第二章 生物分离和提取技术

细胞收集技术（固液分离技术）
1、过滤 2、离心 3、膜分离
则离心沉降速度为：
d p ( s L )4 2 N 2 r
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1、盐析法
原理 水溶性蛋白质溶液是胶体体系，分子与水有很大的亲 和力，所以又是亲水胶体。它的溶解度与其分子高度 水化有关，所以溶解的蛋白质分子周围有水化层。水 化层是胶体体系稳定的必要条件之一。如果向胶体系 统中加入电解质，随着体系的离子强度增大，蛋白质 表面的双电层厚度就会降低，静电排斥作用减弱，同 时也使得蛋白质某些疏水区的水化层脱落，疏水区域 暴露，容易发生凝聚，从而沉淀。水溶液中的蛋白质， 其溶解度一般在生理离子强度范围内（0.15~0.2mol/kg） 最大，低于或高于此范围时均降低。
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水溶性蛋白质的去除
发酵液的预处理，从根本上说，是如何使可溶性杂蛋 白形成沉淀，以便随固形物一同除去的过程
水溶性蛋白质的特征：
1、以胶体状态存在于发酵液中，其稳定性与所带电荷 有关； 2、两性物质，存在等电点，等电点多在酸性范围内。 在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电； 3、加热易变形，可使溶液粘度降低，加快过滤速度 根据蛋白质的特性，有几种去除方法？
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优点：
有机溶剂的密度较低，产生的沉淀物易于分离
缺点：
易引起目标蛋白质变性，沉淀操作必须在低温下进行， 成本较高。一般只适用于液体处理量较少的情况。 常用于沉淀的有机溶剂有丙酮和乙醇
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发酵液处理性能的改善
1、降低发酵液的粘度——加热法和加水稀释法两种
目的：提高过滤速率 例如，在40℃时，12°Be′麦芽汁的粘度为1.2×103Pa· s，当温度升至75℃时，粘度可下降一半，过滤 速率加倍。对于链霉素的发酵液，在pH值3.0的条件 下，升温至70℃后维持半小时，可使液体粘度下降 1/6，过滤速率增大10～100倍。
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2、等电点沉淀法
蛋白质通式：
NH2 R COOH
R COOH COO NH2 R NH2
——一种两性电解质
羧酸解离时产生H+，使蛋白质具有弱酸性：
＋ H
蛋白质的氨基能与H+结合成R－NH3+，使其具有弱碱性：
NH2 R COOH ＋ H R NH3 COOH
它在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电。
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影响盐析的主要因素
1、蛋白质的相对分子量和立体结构，结构不对称的 高相对分子量蛋白质所需的盐浓度较低； 2、对于特定的蛋白质，主要影响因素为无机盐的种 类、浓度、温度和pH值。 离子半径小而带电荷较多的阴离子的盐析效果比 较好，含高价离子比低价型（1-1）盐的效果好。 盐析操作的温度和pH值。 高离子强度下，升高温度，蛋白质溶解度降低； pH值在接近蛋白质等电点时，有利于盐析 盐的种类，硫酸铵、硫酸钠、氯化钠
3、 产物为细胞
离心或过滤——固相干燥——得到菌体 固液分离目的： 分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、 核酸以及蛋白质的沉淀物）
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2.2 发酵液预处理和絮凝
• 预处理:
• 高价无机离子的去除 • 蛋白质的去除 • 絮凝 • 固液分离技术
为什么?
发酵液杂质对分离提取影响最大的是：
高价无机离子和水溶性杂蛋白
2、分子量：分子量上升，有利于架桥，但水溶性降 低。 3、pH值：影响离子型絮凝剂中功能团的电离度， 从而影响分子链的伸展，电离度上升，伸展状态上 升。
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助滤剂的加入方法
（1）预涂层：一种是在过滤介质表面预先涂一 层助滤剂（涂层厚约1～2mm） （2）直接加入：另一种是将助滤剂直接加入发 酵液中，两种方法也可同时使用
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蛋白质的等电点： 当溶液处于某一pH值时，蛋白质质点所带的净电 荷恰好为零，此时的pH值就称为蛋白质的等电点 等电点状态时，蛋白质之间的静电排斥力最小，此时 蛋白质质点迅速结合成聚集体，沉淀极易析出。 在抗生素的生产过程中，一般将发酵液的pH值调至 2~3的偏酸性范围或8～9的偏碱性范围内，使蛋白质变 性沉淀。 链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热 至70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过 滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。
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2、 调节pH值——改善过滤特性
1、对于氨基酸和蛋白质等两性物质而言，将pH值调 至等电点，即可沉淀除去。 2、在膜过滤时，发酵液中的大分子物质容易吸附于 膜上，调节pH值可改变易吸附分子的电荷性质，减 少膜的堵塞和污染。 3、在合适的pH值下，细胞和细胞碎片及某些胶体物 质会趋于絮凝状态，形成较大的颗粒，有利于过滤 操作的进行。
高价无机离子——影响离子交换树脂对目标物的吸附
水溶性杂蛋白
影响离子交换和大网格树脂的吸附能力 有机溶剂提取和双水相萃取时，产生乳化，难以分离 在常规过滤或膜过滤时，使滤速下降，污染滤膜
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发酵液的特点及预处理
发酵液的特点：
1、多为悬浮液，粘度大，不易过滤 2、滤液浑浊、滤速极慢（菌体自溶，核酸、蛋白 质及其他有机粘性物质） 3、目标产物在发酵液中的浓度通常较低； 4、含有高价无机离子（Ca2+ , Mg2+, Fe3+ ，成分复 杂（菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会） 预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤
需消耗大量的酸碱。因此，采用调节pH值实现等电 点沉淀有一定的局限性。 16
3. 加热法
原理：热敏性是蛋白质的一个显著特性，有些蛋 白质在50℃即失去活性而变性。一般的蛋白质在 70～80℃则不可逆的变性析出。 在柠檬酸的生产过程中，将发酵液加热到80℃可以 使蛋白质变性凝固，降低发酵液的粘度，在除去杂 蛋白的同时，过滤速度也得到了提高。
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无机离子的去除
钙离子的去除 ——加入草酸或草酸钠
1、草酸可酸化发酵液，改变发酵液的胶体状态，有助于 产物转入液相。 2、反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质 量。 3、在沉淀钙离子的同时，草酸还会与发酵液中的镁离子 形成草酸镁，去除部分镁离子。 4、草酸的价格较高，注意回收利用以降低成本。 例如：在四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，60℃下 反应生成草酸铅，草酸铅在90～95℃下用硫酸分解， 再经过过滤、冷却、结晶操作后就可以回收草酸。
大多数细胞表面都有一定 的电荷，絮凝过程是加入 电解质后，相同电荷的排 斥以及细胞表面水合程度 不同而产生聚并的过程。 Kakii通过实验证实细胞表 面的离子键和氢键参与了 细胞的絮凝过程。
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常见的絮凝剂
絮凝剂从化学结构看，主要分为三类：高聚物、 无机盐、有机溶剂及表面活性剂。 有机溶剂：成本高、用量大。如乙醇、丙酮和甲醛 无机絮凝剂：效果好、但通用性不好 阳离子对带负电的胶粒凝聚能力的次序为：
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3、酶分离纯化 细胞破碎——絮凝——酶
例： -半乳糖甘酶（胞内酶）的分离纯化
壳聚糖+聚乙酰亚胺
-半乳糖甘 ——细胞破碎——离心分离——澄清液 酶发酵液 调节pH 细胞碎片+部分可溶 -半乳糖甘酶的活性没有影响 性杂蛋白
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CaCl2
影响因素
1、絮凝剂浓度：浓度上升，有利于架桥；浓度过多， 引起吸附饱和，形成胶粒，产生二次稳定。
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聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，它们无毒，可用于 食品和医药工业中。 天然的高分子絮凝剂 ——壳聚糖、海藻酸钠、明胶、骨胶等
优点：无毒无害，环境友好
无机高分子聚合物： ——聚合铝盐、聚合铁盐
微生物： ——多为多糖和核酸、蛋白质 由微生物产生的具有絮凝效果的代谢物 多无毒，安全性好，高效性（用量少）
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第二章 生物产品分离提取技术
北京化工大学 谭天伟教授
生物产品的分离纯化技术
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 生物产品的分离纯化 预处理和絮凝技术 细胞破碎技术 双水相萃取技术 膨胀床技术 膜分离 沉淀技术
2.1 生物产品的分离纯化技术
1、胞外产物
离心或过滤——固液分离——转入液相 2、胞内产物： 收集细胞——细胞破碎或整体细胞萃取——目的产物 释放——转入液相——分离细胞碎片
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镁离子的去除
——加入三聚磷酸钠
——与镁离子形成可溶性络合物，即可消除对离子 交换树脂的影响： Na5P3O10 + Mg 2+ = MgNa3P3O10 + 2Na+ ——用磷酸盐处理，也能大大降低发酵液中钙离子 和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提炼。
铁离子的去除
——加入黄血盐
——使其形成普鲁士兰沉淀 3K4Fe(CN)6 + 4Fe 3+ = Fe4[Fe(CN)6]3↓+ 12K+
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絮凝技术 目的：
1 、增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降 速度； 2、降低发酵液粘度（结合其他的预处理方法， 如稀释、加热等）；
3、采用普通、简单、有效的过滤方法，实现固 液分离。
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1、絮凝和凝聚的区别
絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥 作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种 以物理的集合为主的过程
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图1－2 高分子絮凝剂的混合、吸附和絮凝作用示意图 (a)聚合物分子在液相中分散、均匀分布在离子之间； (b)聚合物分子链在粒子表面的吸附； (c)被吸附链的重排，高分子链包围在胶粒表面，产生保护作 用，是架桥作用的平衡构象； (d)脱稳粒子互相碰撞，形成架桥絮凝作用； (e)絮团的打碎
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(3) 双电层理论
无 机 物
金属离子 无机盐
钙盐 铝盐 硼酸盐
絮凝的作用
1、滤速加快、滤液更清，改善滤液质量，去除 杂蛋白与固体杂质
2、可在胞外循环 利用基因工程手段，可以 得到自身絮凝和沉降性能 很好的酵母。
絮凝酵母与传统的固定化细胞相比，具有以下优点： 不需要固定化细胞载体、成本低、节省空间、可以获 得高菌体浓度，实现连续发酵。
Al 3 Fe 3 H Ca 2 Mg 2 K Na Li
主要有Al2(SO4)3、NaCl、Na3PO4、C来自百度文库Cl2和明胶等
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高分子有机物
共同特点：具有长链状的结构，利用长链上的活性基团， 通过静电引力，形成桥架连接，从而生成菌团沉淀。 合成有机物：聚丙烯酰胺类絮凝剂 优点：用量少（一般以ppm计算），絮凝体粗大，分 离效果好，絮凝速度快以及种类多，使用范围广，目 前主要用于提纯杂质为蛋白质或菌丝体的发酵液。 缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺
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条件：
1、在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行
2、在偏酸性范围内，多通过加入无机酸（如盐酸、 磷酸和硫酸等）调节pH值完成等电点沉淀
范围：一般多用于疏水性较大的蛋白质。 优点：省去了后续的脱盐操作，并且当沉淀操作的pH
值较低时，杂蛋白更容易变性，是蛋白质初级分离的 有效手段。
缺点：极端pH值会导致某些目的产物失活，并且
絮凝剂种类 核酸 蛋白质 高 聚 物 纤维素 聚电解质 多糖
絮凝剂 DNA -------------
絮凝细胞 细菌 细菌 酵母
聚丙烯酰胺
聚乙烯亚胺 葡聚糖 壳聚糖 乙醇 丙酮
细菌
细菌 细菌 酵母 酵母 酵母
有 机 物
溶剂
其他有机物
腐殖酸
鞣酸 单宁 镁盐
酵母
酵母 细菌、酵母 细菌、酵母 酵母、藻类 酵母
该方法操作简单，成本低
缺点：导致目标产品的变性，目标产品为热敏性
物质时，应该谨慎使用。
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4. 溶剂沉淀法
原理：有机溶剂使蛋白质分子表面荷电基团或亲水 基团的水化程度降低，破坏蛋白质胶体的水膜，降 低溶液的介电常数。这使得蛋白质之间的静电引力 增大，产生凝聚和沉淀。 影响因素：由于有机溶剂沉淀也是利用同种分子之间 的相互作用，因此无机盐对蛋白质的溶解度影响很大， 在低离子强度和等电点附近，容易生成沉淀，所需的 有机溶剂量较少。并且随着蛋白质相对分子质量的增 大，有机溶剂沉淀越容易进行，有机溶剂的加入量也 越少。
凝聚：指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的 降低，而使胶体体系不稳定的现象 絮凝的优点：能耗低、易操作、工作量小
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2、 絮凝机理
（1）胶体理论 把细菌直接当作胶体溶液中的胶粒来解释絮凝 过程。絮凝是由于细胞表面的极性基团引起的表面 吸附，而使表面自由能降低的过程。 （2）高聚物架桥理论 W.C.Megreor发现细胞在表面分泌出许多高聚物如 蛋白质、多糖等，这些高聚物在细胞膜表面形成胞 外纤丝。细胞的絮凝是由于这些胞外纤丝之间架桥 交联形成的。这个理论可以解释絮凝取决于细胞生 长的胞龄以及表面分泌物的种类和数量。