组织化学技术(2010)_PPT幻灯片
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+Co2+
硫化钴（黑色） 磷酸钴
试剂配制
① 作用液
2%巴比妥钠（5，5-二乙基巴比妥钠）10ml
3%β-甘油磷酸钠10ml 2%无水氯化钙10ml
2%硫酸镁1ml
蒸馏水5ml
本液PH值为9．4。
②对照液 在上述液中用10ml蒸馏水代替3%β-甘油磷 酸钠。
染色方法 ① 将未固定的组织在恒冷切片机切片； ② 用新配制的作用液（孵育液）孵育切片，37℃，10min （切片8μm厚）； ③ 流水冲洗5min； ④ 入2%硝酸钴溶液中5min； ⑤ 蒸馏水洗； ⑥ 入0.5%的硫化氨液1min； ⑦ 蒸馏水洗； ⑧ 甘油明胶液封固。 （4）结果 硫化钴的黑色沉淀表示酶活性。
三.组织化学研究的内容
酶类、糖类、脂肪、核酸、蛋白质等
（二）酶的组织化学反应法
1． 偶氮染料法 2． 吲哚酚法 3． 金属---金属盐法 4．氧化-还原反应法 5．色素形成法
酶类
酸性磷酸酶
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
Gomori与McDonedel硫化铅法
碱性磷酸酶 Gomori-Takamatsu法
琥珀酸脱氢酶（SDH）是属于琥珀酸氧化酶系统的
酶，也是普通的酶类之一，是三羧酸循环中一个很重要的酶。 它存在于所有有氧呼吸的细胞，其中以心肌、肾小管曲部上皮 细胞及肝细胞含量最丰富，它牢固结合于线粒体膜内，最适 PH值为7.6。此酶对固定剂很敏感，因此，要求新鲜组织低温 恒冷切片。
Nachlas硝基蓝四唑法结果 琥珀酸脱氢酶活性部位呈蓝
紫色颗粒
Pearson二甲亚砜法结果 酶活性表现为蓝紫色沉淀
多糖类
凡化学结构上含有糖分子的物质都称多糖类。多糖类物 质分布很广，其中主要的有糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白 和糖脂类。在机体内很多组织，如肝、肌肉、消化道、呼吸 道和唾液腺的上皮粘液、甲状腺滤泡胶质、软骨基质、垂体 嗜碱性细胞、基底膜、真菌、纤维蛋白、胶原纤维和中枢神 经系统等都含有糖。
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
作用原理 试剂配制 染色方法 对照 结果
作用原理 在酸性PH值的情况下，给切片加入甘油磷酸 酯（或任何磷酸单酯），如有酸性磷酸酶，则释放磷酸酯， 后 者 与 高 浓 度 的 Pb2+ 结 合 ， 形 成 无 色 的 磷 酸 铅 ， 经 硫 化 胺 （或硫化氢）作用，磷酸铅转变为黑色硫化铅：
甘油磷酸酯酸性磷酸酶磷酸酯+铅
磷酸铅
硫化铅
试剂配制
①孵育液 在400ml 0.05M醋酸缓冲液（PH值5.0）中加入0.53g 硝酸铅及40ml3%的β-甘油磷酸钠溶液，在37℃放置24h产生一 些沉淀物，冷却后过滤，过滤后立即使用。
②硫化氢液 用浓硫酸作用于硫化锌或硫化铁，所产生的硫化 氢气体用通过很稀的盐酸洗去气体中的杂质后，再通过50ml蒸 馏水中，每分钟通过120个气泡的速度10min即可。
有较多的方法可以显示多糖类的成分。最常用的有： 过碘酸-Schiff反应
PAS—阿尔辛蓝法
过碘酸-Schiff反应
作用原理 试剂配制 染色方法 结果 注意事项
作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用过碘酸-
Schiff反应（PAS反应）来显示。其原理是通过过碘酸的氧 化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基，与无色碱 性品红反应显示出红色。
碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase , ALP）广泛存在
于机体组织，常见于具有活跃转运功能的细胞膜内，如毛细血 管及小动脉的内皮，肝内胆小管膜，肾近曲小管的刷状缘，肾 上腺、膀胱、脾脏内皮细胞以及乳腺和卵巢中。
显示碱性磷酸酶的方法有多种，最常用的是金属沉淀的钙 钴法。
Gomori-Takamatsu法
作用原理 试剂配制 染色方法 结果 注意事项
作用原理 在PH9.4及Ca2+存在的情况下，给切片加入甘 油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有碱性磷酸酶，则释 放磷酸酯，后者与高浓度的Ca2+结合，形成无色的磷酸 钙，经硝酸钴处理后，磷酸钙转变磷酸钴，再经硫化胺 作用，磷酸钴转变为黑色硫化钴：
甘油磷酸酯 碱性磷酸酶 磷酸酯 +Ca2+ 磷酸钙
Gomori改良钙钴法
Gomori萘酚磷酸酯法
琥珀酸脱氢酶 Nachlas硝基蓝四唑法
Pearson二甲亚砜法
过氧化物酶 Graham-Karnovsky法
Vitale辣Baidu Nhomakorabea过氧化物酶
酸性磷酸酶（Acid Phosphatase , ACP）广泛
分布于机体组织中，它主要位于溶酶体中，也有少量在 内质网中。巨噬细胞、前列腺、空肠上皮纹状缘、肝、 脾、肾及肾上腺等尤为丰富。
试剂配制
① 过碘酸氧化液 高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。此液溶后冰 箱中待用。
② Schiff液 碱性复红 1g 1N盐酸 20ml
偏重亚硫酸钠 1g 双蒸馏水 200ml
先将200ml双蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g碱性复红， 再煮沸1min。冷却至50℃加入20ml1N盐酸，待35℃时加入 2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后见稍带红色，5h之后变为 无色液体。棕色瓶内装好，封口，放入冰箱中保存待用。
一.组织化学的定义
组织化学（histochemistry）技术是通过化学 或物理反应原理显示组织切片或细胞内某种化学 成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。
二.组织化学的研究概况
随着科学技术的不断发展，组织化学在近几十年来 已经得到了迅速的发展，产生了许多分支，如核酸与蛋 白质、蛋白质与氨基酸、脂类与蛋白质、碳水化合物与 粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学、电镜 组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织 化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影 技术等。因此，现代组织化学的概念已经大大的超过了 以往的范畴，无论从理论、内容、研究手段、研究范围 都比以往更广泛及更深入。
染色方法 ①未固定的新鲜组织用恒冷切片机切片； ②在孵育液中，37℃孵育切片，不同的组织孵育的时间不同； ③充分蒸馏水洗，以除去未被吸附的或未沉淀的铅； ④切片入硫化氢液10～60s； ⑤充分蒸馏水洗； ⑥在甘油明胶封固剂中封固。
对照片 在孵育液中加入0.01M氟化钠。 结果 硫化铅沉淀为黑色或棕色的沉淀
硫化钴（黑色） 磷酸钴
试剂配制
① 作用液
2%巴比妥钠（5，5-二乙基巴比妥钠）10ml
3%β-甘油磷酸钠10ml 2%无水氯化钙10ml
2%硫酸镁1ml
蒸馏水5ml
本液PH值为9．4。
②对照液 在上述液中用10ml蒸馏水代替3%β-甘油磷 酸钠。
染色方法 ① 将未固定的组织在恒冷切片机切片； ② 用新配制的作用液（孵育液）孵育切片，37℃，10min （切片8μm厚）； ③ 流水冲洗5min； ④ 入2%硝酸钴溶液中5min； ⑤ 蒸馏水洗； ⑥ 入0.5%的硫化氨液1min； ⑦ 蒸馏水洗； ⑧ 甘油明胶液封固。 （4）结果 硫化钴的黑色沉淀表示酶活性。
三.组织化学研究的内容
酶类、糖类、脂肪、核酸、蛋白质等
（二）酶的组织化学反应法
1． 偶氮染料法 2． 吲哚酚法 3． 金属---金属盐法 4．氧化-还原反应法 5．色素形成法
酶类
酸性磷酸酶
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
Gomori与McDonedel硫化铅法
碱性磷酸酶 Gomori-Takamatsu法
琥珀酸脱氢酶（SDH）是属于琥珀酸氧化酶系统的
酶，也是普通的酶类之一，是三羧酸循环中一个很重要的酶。 它存在于所有有氧呼吸的细胞，其中以心肌、肾小管曲部上皮 细胞及肝细胞含量最丰富，它牢固结合于线粒体膜内，最适 PH值为7.6。此酶对固定剂很敏感，因此，要求新鲜组织低温 恒冷切片。
Nachlas硝基蓝四唑法结果 琥珀酸脱氢酶活性部位呈蓝
紫色颗粒
Pearson二甲亚砜法结果 酶活性表现为蓝紫色沉淀
多糖类
凡化学结构上含有糖分子的物质都称多糖类。多糖类物 质分布很广，其中主要的有糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白 和糖脂类。在机体内很多组织，如肝、肌肉、消化道、呼吸 道和唾液腺的上皮粘液、甲状腺滤泡胶质、软骨基质、垂体 嗜碱性细胞、基底膜、真菌、纤维蛋白、胶原纤维和中枢神 经系统等都含有糖。
Holt与Bitensky改良磷酸铅法
作用原理 试剂配制 染色方法 对照 结果
作用原理 在酸性PH值的情况下，给切片加入甘油磷酸 酯（或任何磷酸单酯），如有酸性磷酸酶，则释放磷酸酯， 后 者 与 高 浓 度 的 Pb2+ 结 合 ， 形 成 无 色 的 磷 酸 铅 ， 经 硫 化 胺 （或硫化氢）作用，磷酸铅转变为黑色硫化铅：
甘油磷酸酯酸性磷酸酶磷酸酯+铅
磷酸铅
硫化铅
试剂配制
①孵育液 在400ml 0.05M醋酸缓冲液（PH值5.0）中加入0.53g 硝酸铅及40ml3%的β-甘油磷酸钠溶液，在37℃放置24h产生一 些沉淀物，冷却后过滤，过滤后立即使用。
②硫化氢液 用浓硫酸作用于硫化锌或硫化铁，所产生的硫化 氢气体用通过很稀的盐酸洗去气体中的杂质后，再通过50ml蒸 馏水中，每分钟通过120个气泡的速度10min即可。
有较多的方法可以显示多糖类的成分。最常用的有： 过碘酸-Schiff反应
PAS—阿尔辛蓝法
过碘酸-Schiff反应
作用原理 试剂配制 染色方法 结果 注意事项
作用原理 糖原、多糖和糖蛋白等都可用过碘酸-
Schiff反应（PAS反应）来显示。其原理是通过过碘酸的氧 化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基，与无色碱 性品红反应显示出红色。
碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase , ALP）广泛存在
于机体组织，常见于具有活跃转运功能的细胞膜内，如毛细血 管及小动脉的内皮，肝内胆小管膜，肾近曲小管的刷状缘，肾 上腺、膀胱、脾脏内皮细胞以及乳腺和卵巢中。
显示碱性磷酸酶的方法有多种，最常用的是金属沉淀的钙 钴法。
Gomori-Takamatsu法
作用原理 试剂配制 染色方法 结果 注意事项
作用原理 在PH9.4及Ca2+存在的情况下，给切片加入甘 油磷酸酯（或任何磷酸单酯），如有碱性磷酸酶，则释 放磷酸酯，后者与高浓度的Ca2+结合，形成无色的磷酸 钙，经硝酸钴处理后，磷酸钙转变磷酸钴，再经硫化胺 作用，磷酸钴转变为黑色硫化钴：
甘油磷酸酯 碱性磷酸酶 磷酸酯 +Ca2+ 磷酸钙
Gomori改良钙钴法
Gomori萘酚磷酸酯法
琥珀酸脱氢酶 Nachlas硝基蓝四唑法
Pearson二甲亚砜法
过氧化物酶 Graham-Karnovsky法
Vitale辣Baidu Nhomakorabea过氧化物酶
酸性磷酸酶（Acid Phosphatase , ACP）广泛
分布于机体组织中，它主要位于溶酶体中，也有少量在 内质网中。巨噬细胞、前列腺、空肠上皮纹状缘、肝、 脾、肾及肾上腺等尤为丰富。
试剂配制
① 过碘酸氧化液 高碘酸0.5g，蒸馏水100ml。此液溶后冰 箱中待用。
② Schiff液 碱性复红 1g 1N盐酸 20ml
偏重亚硫酸钠 1g 双蒸馏水 200ml
先将200ml双蒸馏水煮沸，稍有火焰，加入1g碱性复红， 再煮沸1min。冷却至50℃加入20ml1N盐酸，待35℃时加入 2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后见稍带红色，5h之后变为 无色液体。棕色瓶内装好，封口，放入冰箱中保存待用。
一.组织化学的定义
组织化学（histochemistry）技术是通过化学 或物理反应原理显示组织切片或细胞内某种化学 成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。
二.组织化学的研究概况
随着科学技术的不断发展，组织化学在近几十年来 已经得到了迅速的发展，产生了许多分支，如核酸与蛋 白质、蛋白质与氨基酸、脂类与蛋白质、碳水化合物与 粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学、电镜 组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织 化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影 技术等。因此，现代组织化学的概念已经大大的超过了 以往的范畴，无论从理论、内容、研究手段、研究范围 都比以往更广泛及更深入。
染色方法 ①未固定的新鲜组织用恒冷切片机切片； ②在孵育液中，37℃孵育切片，不同的组织孵育的时间不同； ③充分蒸馏水洗，以除去未被吸附的或未沉淀的铅； ④切片入硫化氢液10～60s； ⑤充分蒸馏水洗； ⑥在甘油明胶封固剂中封固。
对照片 在孵育液中加入0.01M氟化钠。 结果 硫化铅沉淀为黑色或棕色的沉淀