感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
感受态细胞的制备和转化
感受态细胞的制备和转化或者：设计好实验项⽬，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）3.细菌培养液，各加⽆菌⽔⾄150µL（不超过200µL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的⽬的是计算转化率）；对其余各项，分别各取⼀半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存。
倒置平板，37℃培养12-14⼩时。
⼀般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌⽐⽆活性酶的细菌⽣长慢，故过夜培养后可见到毫⽶⼤⼩的阳性⽩⾊菌落⽽阴性的兰⾊菌落只有针尖⼤⼩。
5. 将上述菌液摇匀后取100µl 涂布于含Amp的筛选平板上，正⾯向上放置半⼩时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫，37℃培养16-24⼩时。
6. 计算转化率，统计每个培养⽫中的菌落数。
转化后在含抗⽣素的平板上长出的菌落即为转化⼦,根据此⽫中的菌落数可计算出转化⼦总数和转化频率,公式如下：转化⼦总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化⼦数／每mg质粒DNA）＝转化⼦总数／质粒DNA加⼊量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化⼦总数／感受态细胞总数[注意] 本实验⽅法也适⽤于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不⼀定⼀样。
有的转化效率⾼,需将转化液进⾏多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,⽽有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离⼼),才能较准确的计算转化率。
第四节注意事项与提⽰1. 倒平板时应避免培养基温度过⾼，若温度过⾼，则加⼊的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表⾯及⽫盖会形成⼤量冷凝⽔，易于造成污染及影响单菌落的形成。
若⽤⼿掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。
制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个⽉，时间过长氨苄青霉素将会失效。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
感受细胞的制备与电转化
一、B.subtilis感受态细胞的制备与电击转化1、培养基GM：40 mL（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，3.6 g山梨醇pH=7.2；ETM：200mL电转缓冲液(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%甘油)：18g山梨醇,18.5g甘露醇,甘油；RM：10mL（LB+0.5 M山梨醇+0.38 M甘露醇）：0.9 g山梨醇，0.7 g甘露醇，LB液体培养基。
2个50ml离心管，灭菌。
2、枯草芽孢杆菌WB600感受态的制备1)在新鲜平板上挑取单菌落（小一点为好）接种于5mL的LB液体培养基中，过夜培养(12小时)；2)测量摇管内菌液的吸光值，控制好接种量，使接种完毕后培养基的吸光值在0.19~0.2 左右，培养基为5mLGM。
37℃，180r/min 培养至OD600=1.0(3-4h)左右；3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000r/min，8min，4℃离心收集菌体；4)用40mL预冷的电转缓冲液(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖)洗涤离心后的菌体，5000r/min，8min，4℃离心倾去上清，如此反复漂洗3次；5)将洗涤后的菌体重悬于500µl电转缓冲液中，每管分装60µl，即为制备好的枯草芽孢杆菌感受态细胞，放于-70℃冰箱中保存。
3、枯草芽孢杆菌WB600电击转化1)向预先制备好的60µl枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中加入6µl重组质粒，冰水浴保温5min，然后加入到预冷的电转杯(1mm)中，电击一次，电转仪设置：2.0KV，25µF，200 Ω，电击一次(持续时间4.5-5ms)；2)电击完毕后立即加入1mL复苏培养基RM（LB+0.5 M山梨醇+0.38 M甘露醇），反复吸打几次，将溶液吸出转移到1.5 mL的离心管中，37℃，180r/min，振荡培养复苏3-5h后。
感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株
连接产物的转化效率
转化效率
指单位质量的感受态细胞转化后，能够成功克隆的重组子数量。
影响因素
转化效率受到多种因素的影响，如感受态细胞的制备方法、连接产物的质量和浓度、转化条件等。为了提高转化 效率，需要优化这些因素，并确保感受态细胞的质量和活性。
03 克隆菌株的转化与筛选
转化过程
01
02
03
准备感受态细胞
连接产物浓度
确保连接产物浓度适中，过高或过低都会影响转化效率。
连接产物纯度
去除连接产物中的杂质，如未连接的DNA片段和蛋白质等。
克隆菌株的稳定性与可重复性
克隆稳定性
克隆菌株应稳定，不易发生变异或丢失目的基 因。
可重复性
确保实验结果可重复，避免因菌株变异或其他 未知因素导致的结果不一致。
菌株筛选
对转化后的菌株进行筛选，选择阳性克隆进行后续实验。
优点
方法简单，不需要特殊试剂。
缺点
转化效率相对较低，且不同菌株的感受态制备效果不一致。
人工感受态细胞的制备
人工感受态细胞制备方法
通过化学或电穿孔法处理细菌，使其进入感受态。常用的化学试剂包括CaCl2、DMSO 等。
优点
转化效率高，适用于大多数细菌。
缺点
需要特殊试剂，操作相对复杂。
02 连接产物转化
感受态细胞的制备态细胞的制备 • 连接产物转化 • 克隆菌株的转化与筛选 • 实验注意事项与难点解析
01 感受态细胞的制备
自然感受态细胞的制备
自然感受态细胞制备方法
将细菌在冰冷的0.1M CaCl2溶液中洗涤并悬浮，然后在42℃下热 激处理，使细菌进入感受态。
将细菌培养至对数生长期， 离心收集并用冰冷的0.1M CaCl2洗涤。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
感受态细胞的制备及大肠埃希菌转化图文
酶切处理
使用限制性内切酶对质粒进行酶切， 使其具有黏性末端，便于与外源 DNA连接。
纯化质粒
通过凝胶电泳和回收试剂盒对酶切 后的质粒进行纯化，去除杂质。
转化过程
制备感受态细胞
通过化学或电击法将大肠埃希菌的细 胞壁进行预处理，使其处于易于接受 外源DNA的状态。
加入质粒
离心和涂布培养
将转化后的细胞离心收集，涂布在含 有抗生素的选择性培养基上，筛选成 功转化的克隆。
实验原理
感受态细胞制备原理
通过物理或化学方法降低细菌的细胞 壁通透性，使其能够吸收外源DNA 。
大肠埃希菌转化原理
外源DNA与感受态细胞结合，通过细 胞壁的渗透作用进入细胞内，并在细 胞内进行复制和表达。
02
感受态细胞的制备
细菌培养
01
02
03
菌种选择
选择对数生长期的细菌作 为感受态细胞制备的起始 菌种，以保证较高的转化 效率。
CaCl2处理法
CaCl2处理
在细菌培养物中加入适量的CaCl2，使细菌细胞壁产生可逆性损伤，提高感受态细 胞的转化效率。
低渗溶液
将CaCl2处理后的细菌细胞洗涤在低渗溶液中，使细胞壁进一步损伤，提高感受 态细胞的转化效率。
03
大肠埃希菌的转化
准备质粒
提取质粒
从宿主菌中提取出质粒DNA，通 常使用质粒提取试剂盒进行操作。
高转化效率是实现高效基因工程操作的关键因素 之一，因此对转化效率的测定具有重要的实际意 义。
05
结果与讨论
实验结果
成功制备感受态细胞
通过电击法成功制备了感受态细胞，细胞形态无明显变化，生长 状态良好。
大肠埃希菌转化效率高
将外源DNA导入感受态细胞后，成功获得了高转化效率的大肠埃 希菌。
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备方法（BL21）1．菌种纯化。
①在LB平板上，用接种环挑取大肠杆菌BL21，在平板上分级划线，以能够出现单菌落为宜。
②将上述划线的平板倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。
2．菌体培养。
①取20 ml LB培养基至100 mL三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。
②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①中。
③ 37℃振荡（约120 rpm）培养。
④测定OD值，当OD值达到0.35～0.5时（培养约5小时）放置冰上停止培养（如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。
3．感受态细胞的制备①取上述冰上菌液1 mL于1.5 mL ep管中（根据需要量确定Microtube数量）。
② 1,500×g（微型离心机约4,000 rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
③在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution A，轻轻弹动ep使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。
④ 1,500×g 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
⑤在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution B，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，勿剧烈振荡。
⑥感受态细胞制作完成。
本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。
在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。
感受态细胞的DNA转化1．将-80℃保存的感受态细胞置于冰上融化10分钟。
2．向100 μl的感受态细胞中加入0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl，一般连接产物用10 μL，质粒用0.5 μL）的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。
3．42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。
4．加入900 μL培养基。
5．37℃ 140-160 rpm振荡培养45 min。
6. 离心6000rpm，3min，弃上清，留约100 μL，混匀后涂平板。
感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备与转化高中生物学选择性必修三基因工程中对于细菌作为表达载体的受体细胞，只是简单地说“先用Ca2+处理使之成为感受态细胞”，但如何制备感受态细胞并使其转化未作详细说明。
常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
所谓的感受态细胞，即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。
通俗的讲，就是受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl2，RuCl3等化学试剂法)处理后，细胞膜的通透性变大，能够容许外源DNA分子通过，这时的细胞就称为感受态细胞。
一般来说，感受态细胞的最基本要求是：1. 没有质粒(也可以有与待转质粒复制子兼容的质粒)2. 容易被转进去(一般是G-细菌，细胞壁薄)3. 营养条件一般，非苛养菌在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法(如：电击法，CaCl2等化学试剂法)处理后使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
化学制备法大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法)，该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告引言感受态细胞作为一种重要的免疫细胞类型，具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在转化实验中的应用。
通过本实验，我们将对感受态细胞的制备过程进行详细介绍，并探究其在转化实验中的应用。
制备感受态细胞的实验步骤材料与试剂准备1.细胞培养基2.细胞培养器具3.酶消化液4.感受态细胞激活剂细胞培养与繁殖1.收集目标细胞样本，并进行细胞分离与纯化。
2.将分离得到的细胞移入培养基中，进行细胞培养与繁殖。
感受态细胞的诱导与培养1.将培养得到的细胞转移到感受态细胞激活剂的培养基中。
2.在一定的时间段内，定期观察细胞形态和数量的变化。
感受态细胞的纯化和筛选1.使用细胞分离技术将感受态细胞从培养基中分离出来。
2.进行感受态细胞的纯化和筛选，以获得高纯度的感受态细胞。
感受态细胞的转化实验步骤转染实验1.将制备好的感受态细胞转染入目标细胞中。
2.配制转染试剂，并按照说明书进行转染操作。
3.观察转染效果，检测感受态细胞的转化率。
转化效果的评估1.使用流式细胞仪检测转化后的细胞表面标记物的表达情况。
2.利用细胞培养和观察技术评估感受态细胞转化的效果。
转化实验的应用研究1.利用感受态细胞的转化特性进行疾病治疗相关研究。
2.探究感受态细胞在免疫调节中的作用。
结论通过本实验，我们成功制备了感受态细胞并进行了转化实验。
实验结果表明，感受态细胞具有较高的转化率和细胞表面标记物的表达效果。
感受态细胞在疾病治疗和免疫调节等方面具有广泛的应用前景，为相关研究提供了重要的实验基础。
参考文献1.Smith A, et al. (2018). Preparation and conversion of sentientcells in vitro. J Cell Sci. 131(18): jcs213587.2.Gardener B, et al. (2019). Applications of sentient cells indisease treatment. Nature Med. 25(6): 897-902.3.Jones C, et al. (2020). Role of sentient cells in immuneregulation. Front Immunol. 11: 1234.。
氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
§1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。
二、实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。
含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。
转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。
重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。
Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小，转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。
除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。
转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。
为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。
三、仪器与试剂1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。
感受态细胞制备及转化步骤
一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。
2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。
3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。
4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。
5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。
6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。
大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。
二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。
2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。
3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
感受态制作及转化
感受态制作及转化第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
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感受态细胞的制备
一、实验原理
受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。
本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。
二、材料及准备工作
一）材料准备
二)试剂配制
1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）
蛋白胨 2.0g
酵母提取物 1.0g
氯化钠（NaCl） 2.0g
2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）
蛋白胨2×1.0g
酵母提取物2×0.5g
氯化钠（NaCl）2×1.0g
琼脂粉2×1.5g
温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。
4℃保存备用。
3、TSS液（100ml）（有效期2周）
聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%
DMSO 5ml 终浓度5%
MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/L
LB 85ml 终浓度85%
去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用
注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000
4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）
KCl（2mol/L） 2.5ml
CaCl2(1mol/L) 1.5ml
MgCl2(1mol/L) 2.5ml
水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）
5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）
取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃
保存备用
三）仪器设备
1、低温大容量离心机
2、恒温水浴锅
3、超净台
4、高压锅
5、37℃孵育箱
6、恒温摇床
7、制冰机
8、分光光度计
9、微量移液枪
10、低温冰箱
三、步骤及注意事项
一）感受态制备（TSS法）
1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；
2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；
3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；
4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；
5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心
5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；
6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。
二）KCM法转化
1、冰上融化1管感受态细菌（也可室温化解后，再迅速冰浴）；
2、重取1个1.5ml离心管，加入20μl 5×KCM，DNA（建议不要超过10ng），水至100μl，放置冰中；
3、加入100μl 感受态细菌，混匀，继续冰中放置20-30mins；
4、42 ℃热休克90s后，再插入冰中1-5min；（休克30s效果更好）
5、加入1 ml 37℃预热的LB（无氨苄），转移至摇菌管中，220rpm ，
37℃孵育1h；
6、取100μl菌液，接种于含抗生素的LB平皿（也可以把菌液2000 rpm 离心5 min，收集细菌，用预热LB重悬细菌，接种含抗生素的LB平皿上），37℃孵育过夜。
7、剩余的感受态，可做阴性对照。
三）注意事项
1、本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。
2、PEG 和MgCl2二者均可沉淀质粒DNA，且PEG 有使细胞壁具有穿透性, 允许DNA 进入细菌体内的生物学功能；这些可能是优于CaCl2 法的原因。
3、培养基PH值。
pH值在6.8-7.2之间较好。
保证菌摇好后，pH值不低于6.0。
pH值在6.5以上，表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。
4、培养基离子浓度。
经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。
使用20mmol/L MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
5、培养温度。
文献及经验证明，较低的温度培养有利于感受态的形成（一般18℃,一般的感受态，用室温即可），有利于获得较高转化效率的感受态。
6、感受态保存。
文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要
好,它会使感受态的效率增加。
浓度不要超过7%。
液氮速冻也会使感受态的效率提高，可用液氮速冻感受态12小时，然后保存于超低温冰箱内；也可在液氮中长时间保存而不降低效率。
7、热休克时间。
有实验证明热休克时间30s能取得最好效果，而温度40-50℃均可，转化效率下降不明显。
8、转化质粒建议不要超过10ng，否则容易导致效率下降。
9、试剂使用国产分析纯即可，一定要过滤除菌，不能高压灭菌。
四、结果判定
转化后的菌液，分3个梯度DNA量，转化三个LB平皿，计算平均转化效率。
转化效率1×106cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆、有限量的DNA的转化、T-克隆实验；大于1×10 8 cfu/μg DNA可用于构建文库和突变要求用的转化。
转化效率计算公式：
转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量（cfu/μg DNA）这是最常用的方法，即计算每微克DNA经转化后可以得到的阳性克隆菌落的数目(clone formation unit, cfu)。
但实际上，由于用于测定转染效率的质粒（一般要求超螺旋质粒）的分子量不同，每微克DNA所代表的DNA分子数也会有差异，因此一般情况上，转化效率测定使用的都是pBR322或pUC19等小分子量的质粒。
使用一个具体的例子来说明转化效率的计算方法：假设取0.1ng
pUC19质粒转入100μl待测的感受态细菌中，按常规转化步骤进行冰浴和热击，加入900μl SOC培养基继续培养（此时DNA浓度为0.1ng DNA/ml，这里也可使用LB培养基，但最后得到的克隆菌的数目可能会降低）。
然后再用SOC培养基进行1:10稀释（此时DNA浓度变为0.01ng DNA/ml），分别取100μl（含总量为0.001ng的DNA）涂布至两个平行的平板中。
如果最后产生的菌落数为200 个（两个平板菌落的平均数），则转化效率为：
200 cfu/0.001ng = 2×108cfu/μg（注:2×108cfu/μg的转化效率，大约相当于可以将千分之一的pUC19质粒分子成功转入感受态细菌中。
）。