不用Trizol即可裂解细胞提取RNA的方法

不用Trizol即可裂解细胞提取RNA的方法

关键词：Trizol裂解细胞提取RNA2008-08-30 00:00 来源：互联网点击次数：1536

1、方法一

试剂：

（1）变性液组成：25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB中（42 mmol/L pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mmol/L β-巯基乙醇），65 ℃溶解，过滤灭菌，4 ℃预冷。

（2）酸性酚配制：55 ℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mmol/L，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500 ml 50 mmol/L，pH4.0乙酸钠，直到pH。

操作步骤：

（1）细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4 ℃，3000 g离心5•min；

（2）细胞洗涤：上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3000 g 离心5 min；

（3）细胞破碎：在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆；

（4）在经变性液匀浆的细胞或组织600 μl＋60 μl pH4.0的2 mmol/L乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器600 μl酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10 s，冰浴10-15 min，离心，4 ℃，10000 g，20 min，上层水相吸至无菌离心管中，加等体积的异丙醇，-70℃，30 min沉淀RNA，离心4 ℃，10000 g，20 min；沉淀RNA，冷冻干燥15 min，RNA沉淀重新溶于300 μl变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65 ℃加热，但时间应极短）60 μl pH4.0的2 mmol/L乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器，600 μl酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10 s，冰裕中10-15 min，离心，4℃，10000 g，20 min，上层水相吸至无菌离心管中，等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30 min），75％乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥，复溶于去RNA酶的水中（对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 mmol/L，再加入2.5体积的乙醇，-70 ℃保存）。

2、方法二

氯化锂法提取总RNA 方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA 的污染及RNA得率不高，小RNA片断丢失的缺陷。

试剂：

（1）氯化锂/尿素溶液：氯化锂126 g（3 mmol/L）尿素、360 g（6 mmol/L）加水至1 L，过滤灭菌

（2）悬浮液：10 mmol/L Tris-HCL （pH7.6），1 mmol/L EDTA （pH8.0），0.5%SDS

操作步骤：

（1）对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5-10 ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2 min，对于少量细胞（107细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5 ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中；

（2）匀桨液在0-4 ℃放置4 h后，12000 g离心30 min；

（3）取沉淀，加入原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液，重复步骤（2）；

（4）沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30 min并不时摇动混匀，4000g离心5 min；

（5）取上层水相，加1/10倍体积的3 mmol/L乙酸钠（pH5.2）及2倍体积的乙醇，-20 ℃放置1 h，5000 g离心；

（6）70％乙醇洗沉淀一次，真空干燥；

（7）RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分装，于-70℃保存。