基因工程的基本原理和技术
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• • • • • • • • • • DNA是遗传物质的证明 基础理论 DNA双螺旋结构和中心法则的确立 遗传密码的破译（遗传密码的通用性） 基因运载体的发现 工具酶的发明 DNA合成和测序技术的发明 技术发明 DNA体外重组的实现 重组DNA表达实验的成功 第一例转基因动物问世 PCR技术的发明
治疗糖尿病特效药—— 胰岛素 每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。 1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌 内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。
基因工程产品
抗虫害的玉米
转鱼抗寒基 因的番茄
转基因 鲑鱼
基因工程的产物
乳汁中含有人生长激 素的转基因牛(阿根廷)
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
Go back
切割特定的核苷酸序列 将DNA两条链的氢键 的磷酸二酯键 打开形成两条单链
限制性内切酶与DNA水解酶的区别 限制酶
区别
DNA水解酶
切割特定的核苷酸序列 切割磷酸二酯键，形成 的磷酸二酯键，形成片 单个的脱氧核苷酸。 段的DNA.
Go back
思考?
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 • 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两 者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合 成重组的DNA分子了。
• 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来 “分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶 关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”
“分子缝纫针”—— DNA连接酶
关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞 “分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
DNA重组技术的基本工具
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
③类型：
类型 来源 功能 相同点 差别
E· coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端 磷酸 能连接黏性末端和 二酯键 T4DNA连接酶 T4噬菌体 平末端(效率较低)
寻根问底
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
2）噬菌体或某些动植物病毒
• 常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
有切割位点 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
课堂练习
1.在基因工程中，切割运载体和含 有目的基因的DNA片段，需使用 （ A） A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
使每条链中特定部位的两个核苷 • 3、作用：
磷酸二酯键
A
1
H
5 4
H
5 4
A
1
O
H
H
3HO
2
H2O +
3
2
H
5 4 3
T
1 2
H
5 4 3
T
1 2
H
H百度文库
O
• 4、限制酶识别序列
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸 组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组 成
Go on
• 限制酶的识别序列：
Go back
⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。 粘质沙雷氏杆菌 SmaⅠ （Serratia marcesens）
大肠杆菌 EcoRⅠ （Escherichia coli R） 练习：流感嗜血杆菌的d菌株 ( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶， 则分别命名为: HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ
3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 4) 载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不 能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去; 5) 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行 操作,太大就不便操作.
常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒
• 限制性核酸内切酶——“分子手术刀” • DNA连接酶——“分子缝纫针” • 基因进入受体细胞的载体——“分子运 输车”
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” • 1、主要来源：
主要从微生物中分离 纯化
• 2、特点：
识别双链DNA分子的某种特定 核苷酸序列（不同的限制酶能识别不 同特点的核苷酸序列），并且以不同 的方式在两个特殊碱基之间切断DNA 双链。 酸之间的磷酸二酯键断开
生物B基因片段 生物A基因片段 ……GAATTC…… ……GAATTC…………GAATTC…… ……CTTAAG…… ……CTTAAG…………CTTAAG…… 同一种 EcoRⅠ 酶切 ……G AATTC…… ……G AATTC …… …… G AATTC… ……CTTAA G…… ……CTTAA …… G…… CTTAA G…… 不同来源的DNA片段混合 ……GAATTC…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……CTTAAG…… 将不同种来源的DNA片段连接起来
课堂练习 2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因 D、它是环状DNA
课堂练习
3.以下说法正确的是
（ C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来
E· coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键
二、“分子缝合针” —— DNA连接酶
①作用:
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键
②作用原理： 催化磷酸二酯键形成
DNA连接酶——“分子缝纫针”
• 连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的， 称之为E· coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分 离得到，称为T4连接酶。 • 这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链 DNA的缺口，而不能连接单链DNA。 • E· coli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可 “缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。
问题探讨：
苏云金芽孢杆菌
毒蛋白
苏云金芽孢杆菌含有一 种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在 棉花细胞中表达，培育出抵 抗棉铃虫害的抗虫棉。
普通棉花
抗虫棉
想一想需要做哪些关键工作？
• 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来 关键步骤二： 抗虫基因与棉花DNA“缝合” 关键步骤三： 抗虫基因进入棉花细胞
• 外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细 胞(如棉花细胞)？
导入过程需要运输工具——运载体。
• 三、基因进入受体细胞的运载体——” 分子运输车”
• 运载体的作用有哪些？
作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫 基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。
作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞) 内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。
教学目标
• 知识与能力 • 1.简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。 • 2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和 技术创新。 • 二、 教学重点和难点 • 1.教学重点： • DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。 • 2.教学难点: • 基因工程载体需要具备的条件。
基因工程
据调查： 2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我 国约6000万。
后 期 基 础 理 论
梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
克里克等提出中心法则
复制
转录
翻译
DNA
逆转录
RNA
蛋白质
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的 遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。
基础理论和技术的发展催生了基因工程
（一）基因工程的概念
• 什么叫基因工程？
基因工程又叫DNA重组技术。该技术 是在生物体外，通过对DNA分子进行人工 “剪切”和“拼接”，对生物的基因进行 改造和重新组合，然后导入受体细胞内进 行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表 达，产生出人类所需要的基因产物。
基因工程的概念
基因工程的别名 操作环境
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
摩尔根证明基因在染色体上，并提出基 因的连锁互换定律。
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从 一种生物个体转移到另一种生物个体。
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？
高二·2010年上学期
作为运载体必须具备哪些条件？
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目 的基因插入到载体上去。
DNA重组技术
生物体外
操作对象
操作水平 基本过程
基因
DNA分子水平 剪切 → 拼接 → 导入→ 表达
按照预先设计的蓝图，定向改变 生物遗传特性，创造出新型生物
结果（目的）
科技探索之路
基因工程研究的理论基础
早 期 基 础 理 论
达尔文提出生物进化论
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律
EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
Go back
黏性末端
EcoRⅠ
黏性末端
Go back
重复演示
• 什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
SmaⅠ
平末端
平末端
限制性内切酶与DNA解旋酶的区别
限制酶
区别
DNA解旋酶
DNA聚合酶 DNA连接酶
区别1
1)只能将单个核苷酸连 1)在两个DNA片段之 接到已有的核酸片段上， 间形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键
2)以一条DNA链为模板，2)将DNA双链上的两 区别2 将单个核苷酸通过磷酸 个缺口同时连接起来， 二酯键连接成一条互补 不需要模板 的DNA链 相同点 形成磷酸二酯键
治疗糖尿病特效药—— 胰岛素 每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。 1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌 内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。
基因工程产品
抗虫害的玉米
转鱼抗寒基 因的番茄
转基因 鲑鱼
基因工程的产物
乳汁中含有人生长激 素的转基因牛(阿根廷)
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
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切割特定的核苷酸序列 将DNA两条链的氢键 的磷酸二酯键 打开形成两条单链
限制性内切酶与DNA水解酶的区别 限制酶
区别
DNA水解酶
切割特定的核苷酸序列 切割磷酸二酯键，形成 的磷酸二酯键，形成片 单个的脱氧核苷酸。 段的DNA.
Go back
思考?
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 • 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两 者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合 成重组的DNA分子了。
• 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来 “分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶 关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”
“分子缝纫针”—— DNA连接酶
关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞 “分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
DNA重组技术的基本工具
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
③类型：
类型 来源 功能 相同点 差别
E· coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端 磷酸 能连接黏性末端和 二酯键 T4DNA连接酶 T4噬菌体 平末端(效率较低)
寻根问底
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
2）噬菌体或某些动植物病毒
• 常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
有切割位点 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
课堂练习
1.在基因工程中，切割运载体和含 有目的基因的DNA片段，需使用 （ A） A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
使每条链中特定部位的两个核苷 • 3、作用：
磷酸二酯键
A
1
H
5 4
H
5 4
A
1
O
H
H
3HO
2
H2O +
3
2
H
5 4 3
T
1 2
H
5 4 3
T
1 2
H
H百度文库
O
• 4、限制酶识别序列
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸 组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组 成
Go on
• 限制酶的识别序列：
Go back
⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。 粘质沙雷氏杆菌 SmaⅠ （Serratia marcesens）
大肠杆菌 EcoRⅠ （Escherichia coli R） 练习：流感嗜血杆菌的d菌株 ( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶， 则分别命名为: HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ
3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 4) 载体DNA必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不 能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去; 5) 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行 操作,太大就不便操作.
常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒
• 限制性核酸内切酶——“分子手术刀” • DNA连接酶——“分子缝纫针” • 基因进入受体细胞的载体——“分子运 输车”
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” • 1、主要来源：
主要从微生物中分离 纯化
• 2、特点：
识别双链DNA分子的某种特定 核苷酸序列（不同的限制酶能识别不 同特点的核苷酸序列），并且以不同 的方式在两个特殊碱基之间切断DNA 双链。 酸之间的磷酸二酯键断开
生物B基因片段 生物A基因片段 ……GAATTC…… ……GAATTC…………GAATTC…… ……CTTAAG…… ……CTTAAG…………CTTAAG…… 同一种 EcoRⅠ 酶切 ……G AATTC…… ……G AATTC …… …… G AATTC… ……CTTAA G…… ……CTTAA …… G…… CTTAA G…… 不同来源的DNA片段混合 ……GAATTC…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……CTTAAG…… 将不同种来源的DNA片段连接起来
课堂练习 2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因 D、它是环状DNA
课堂练习
3.以下说法正确的是
（ C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来
E· coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键
二、“分子缝合针” —— DNA连接酶
①作用:
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键
②作用原理： 催化磷酸二酯键形成
DNA连接酶——“分子缝纫针”
• 连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的， 称之为E· coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分 离得到，称为T4连接酶。 • 这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链 DNA的缺口，而不能连接单链DNA。 • E· coli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可 “缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。
问题探讨：
苏云金芽孢杆菌
毒蛋白
苏云金芽孢杆菌含有一 种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在 棉花细胞中表达，培育出抵 抗棉铃虫害的抗虫棉。
普通棉花
抗虫棉
想一想需要做哪些关键工作？
• 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来 关键步骤二： 抗虫基因与棉花DNA“缝合” 关键步骤三： 抗虫基因进入棉花细胞
• 外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细 胞(如棉花细胞)？
导入过程需要运输工具——运载体。
• 三、基因进入受体细胞的运载体——” 分子运输车”
• 运载体的作用有哪些？
作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫 基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。
作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞) 内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。
教学目标
• 知识与能力 • 1.简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。 • 2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和 技术创新。 • 二、 教学重点和难点 • 1.教学重点： • DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。 • 2.教学难点: • 基因工程载体需要具备的条件。
基因工程
据调查： 2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我 国约6000万。
后 期 基 础 理 论
梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
克里克等提出中心法则
复制
转录
翻译
DNA
逆转录
RNA
蛋白质
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的 遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。
基础理论和技术的发展催生了基因工程
（一）基因工程的概念
• 什么叫基因工程？
基因工程又叫DNA重组技术。该技术 是在生物体外，通过对DNA分子进行人工 “剪切”和“拼接”，对生物的基因进行 改造和重新组合，然后导入受体细胞内进 行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表 达，产生出人类所需要的基因产物。
基因工程的概念
基因工程的别名 操作环境
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
摩尔根证明基因在染色体上，并提出基 因的连锁互换定律。
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从 一种生物个体转移到另一种生物个体。
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？
高二·2010年上学期
作为运载体必须具备哪些条件？
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目 的基因插入到载体上去。
DNA重组技术
生物体外
操作对象
操作水平 基本过程
基因
DNA分子水平 剪切 → 拼接 → 导入→ 表达
按照预先设计的蓝图，定向改变 生物遗传特性，创造出新型生物
结果（目的）
科技探索之路
基因工程研究的理论基础
早 期 基 础 理 论
达尔文提出生物进化论
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律
EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
Go back
黏性末端
EcoRⅠ
黏性末端
Go back
重复演示
• 什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
SmaⅠ
平末端
平末端
限制性内切酶与DNA解旋酶的区别
限制酶
区别
DNA解旋酶
DNA聚合酶 DNA连接酶
区别1
1)只能将单个核苷酸连 1)在两个DNA片段之 接到已有的核酸片段上， 间形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键
2)以一条DNA链为模板，2)将DNA双链上的两 区别2 将单个核苷酸通过磷酸 个缺口同时连接起来， 二酯键连接成一条互补 不需要模板 的DNA链 相同点 形成磷酸二酯键