医学免疫学检验-细胞因子测定及应用PPT优选课件

2020/10/18
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显示检测结果
1、细胞增殖状态的显示： 放射性核素掺入法、 胞内酶活性显示法 活细胞染色法 细胞荧光测定法
2、细胞毒或细胞病变状态的显示
活细胞染色法
胞内酶活性显示法
DNA断片测定法
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细胞增殖检测方法分类
➢直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、
Clone-IXN/2b（M）增殖法
中性粒细胞（M、H）趋化法
TF-1（H）增殖法
IL-3、IL-5
IL-6、IL-5
L929 （M、H）细胞毒法
wish（H）病变保护法
IFN- 、 IFN-
L929（M）病变保护法
IFN- 、 IFN2-5
检测标本的准备
1、分离特定的产生细胞 2、对产生细胞进行诱导、激活 3、选择适当的收集时间
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各
类
细
胞
因
子
间
关
CSFs
系
Chemokines
ILs IFNs TNFs TGFs
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1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性 2、多源与同源性 3、高效性 4、多效性（pleiotropy） 5、丰余性（redundancy） 6、协同性 7、拮抗性 8、网络性
的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。
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第二节 细胞因子检测的方法与原理
一、细胞因子的细胞生物学检测
二、细胞因子的免疫学检测
三、细胞因子的分子生物学检测
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细胞因子的细胞生物学检测
1、检测方法与原理 2、检测中的操作注意要点
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检测方法与原理
细胞增殖或增殖抑制试验 细胞病变抑制试验 细胞毒试验 细胞趋化试验
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第一节 细胞因子检测概述
一、细胞因子的类型与作用特点 二、细胞因子检测的特点与方法
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细胞因子
由非神经—内分泌细胞产 生的一大类与免疫应答活动 密切相关的低分子蛋白与多 肽。
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细胞因子的类型与作用特点
1、细胞因子的分类 2、细胞因子的作用特点
结果客观易于自动化； 适用于大标本量的测定
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方法的特异性受依赖细 胞株影响；放射性污染
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(2) MTT 比色法
特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
与同位素掺入法相比
测定步骤类似
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掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同
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细胞因子检测的特点与方法
1、检测的特点 2、检测的方法
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细胞因子检测的特点
免疫原性较弱 样品含量低 样品具有时效性 生物效应特异性差
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细胞因子检测的方法
免疫学检测方法——抗原性检测
细胞生物学检测方法——生物活性检测
分子生物学检测方法——基因表达检测
难以标准化和自动化 ➢细胞代谢活性测定方法
3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比 色法 ➢细胞代谢产物测定法
代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表 面标记或可溶性分子测定法
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(1) 放射性核素掺入法
通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方 法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对 核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（ 3H/125I ），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增 殖的程度。
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以生物学作用进行划分的分类
白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN-、IFN-、IFN- 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF- 趋化因子（Chemokine）—— IL-8、GROs、MCP-1 生长因子（Growth factor）—— EGF、FGF、IGF、PDGF
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生物学活性测定方法学评价
敏感性较高 特异性不高 操作繁琐 易受干扰
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细胞因子的免疫学检测
分泌型细胞因子的检测 细胞内细胞因子的检测
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ELISA
特异、简便 易于推广和标准化等优点 可同时检测大量标本且试验废弃物便于处 理 细胞因子测定的首选方法
敏感性偏低
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各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-1
IL-2 IL-3
实验系统 D10（M）增殖法 EL-4（M）增殖法 A352（H）增殖抑制法 CTLL（M）增殖法 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法
IL-4 IL2-0520/10/18
CTLL（M）增殖法 BCL-1（M）增殖法
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细胞
趋化因子
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滤膜：计数受趋化细胞
趋化试验原理示意
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检测中的操作注意要点
靶细胞的选择与培养
检测标本的制备
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靶细胞的选择与培养
1、对所测的细胞因子有特异的敏感性
2、易培养、保存、生物学特性稳定
3、有良好的生长状态
4、种属适配
不能判断细胞因子的生物学活性。
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ELISPOT
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酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)
在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加 基 入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无 本 刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因
原 子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续 理 的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验
干扰因素 IL-2、IL-4 IL-4
IL-4
GN-CSF、IL-5
IL-6、EPO
IL-2
IL-4
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各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-6
IL-7 IL-8 GM-CSF
TNF/ IFN
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实验系统
干扰因素
B9（M）增殖法
IL-4、IL-11
BM60（H）增殖法