邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性
SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法
SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。
按照GB/T5009.171-2003中邻苯三酚自氧化的方法测定酶活力，利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
一、试剂：1、pH 7.8, 0.05mol/L的磷酸缓冲液：A液: 称取17.9g Na2HPO4•12H2O于容量瓶中定容至1L；B液: 称取 7.8g NaH2PO4•2H2O于容量瓶中定容至1L；取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH 7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液。
2、C液: pH 8.20 ，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)- 盐酸缓冲液(内含1mmol/L EDTA•2Na)：称取1.2114gTris和37.2mg EDTA•2Na溶于62.4mL 0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。
3、 0.lmol/L盐酸溶液:量取2.lmL 12mol/L盐酸，蒸馏水定容至250mL。
4、.10mmol/L盐酸溶液:量取10mLO.lmol/L盐酸，蒸馏水定容至l00mL。
5、D液:4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液：称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的盐酸溶液，并定容至100mL。
二、仪器：1.冷冻离心机2.水浴锅；3．电子天平；4．紫外-可见分光光度计；5．精密酸度计，精确到0.01pH；6．10mL比色管；7．10mL离心管；8．玻璃乳钵。
三、实验步骤1．SOD粗酶液的提取称取叶片1g，置于研钵中研磨，加入3mL 0.05mol/L磷酸缓冲液，加入少量石英砂，继续在冰浴中的研钵内研磨成匀浆，取4mL至离心管中，于4℃10000r/min离心20min，上清液即为SOD粗提液。
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mgNa2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。
多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。
二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。
由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。
把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。
精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。
用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。
由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。
所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。
研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。
四、试剂1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。
贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。
2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。
3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。
土壤多酚氧化酶性质研究及意义_郝建朝
; 对传统测试土壤多酚氧化酶的方法提出了一
些建议 , 对一些现象进行了初步解释 , 如荷花出淤泥而 不染成因 。 这为加快土壤多酚氧化酶在环境修复中应 用和开发它的广阔应用前景奠定基础
[ 12, 13, 14, 15]
。
1 材料与方法
1 . 1 滨江带生态湿地基本情况 湿地处于长江中下游平原的镇江北固山脚下 , 位于 东经 119° 82′ 89″ , 北纬 32° 81′ 59″ , 属于东部季风湿润区 ,
收稿日期 : 20050418; 修订日期 : 2005 - 07 -01 基金项目 : 国家 “ 十五 ”重大科技专项 (2003AA 601100 -3)资助 作者简介 : 郝建朝 (1980 - ), 男 , 河北保定人 , 贵州大学在读研究生 , 环境生物学 。 *通讯作者 : yanyouw u@ u js . edu . cn
土壤多酚氧化酶 (Polyphenol ox id ase , 简称 PPO ) 主要来源于土壤微生物 、 植物根系分泌物及动植物残 体分解释放的酶 , 它是一种复合性酶 。 土壤多 酚氧化酶能把土壤中芳香族化合物氧化成醌 , 醌与土 壤中蛋白质 、 氨基酸 、糖类 、矿物等物质反应生成大小 分子量不等有机质和色素 , 完成土壤芳香族化合物循 [ 6, 7, 8] 环 。 利用土壤多酚氧化酶的反应机制 , 人们把多 酚氧化酶用于土壤环境修复 , 丁克强
[ 10] [ 9] [ 1, 2, 3, 0 ～ 1600 毫米 , 年平均气温 15 . 4℃, 全 年 无霜 期 为 240 ～ 260 天 , 年 积 温 5000 ～ 6500℃, 而且四季分明 , 适合多种植物生长 , 并且此湿地 植被以芦苇和鹝草为主 。 供试土壤性质如表 1。
常用土壤酶测定药品及方法
纤维素酶：酶活测定方法：3,5-二硝基水杨酸比色法；540nm比色；1 试剂配制：（1）1%羟甲基纤维素溶液（2）PH5.5 磷酸盐酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g磷酸氢二钠溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
（3）甲苯（4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。
（5）葡萄糖标准溶液（1ml标准液含0.2—0.8mg葡萄糖）。
标准曲线绘制：分别取不同浓度标准葡萄糖溶液1ml移于25ml容量瓶中，加3ml二硝基水杨酸溶液。
将试管放在沸腾水浴上5min，然后迅速冷却3min。
定容，15min后在分光光度计上于波长540nm处比色测定。
以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2 操作步骤称取10g土壤置于50ml三角瓶中，加20ml 1%羟甲基纤维素溶液、5ml PH5.5磷酸缓冲液及1.5ml 甲苯，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
培养结束后，过滤并定容25ml。
取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。
每一试验处理均应设置以3ml水代替基质的对照，为检验试剂纯度应设无土壤的对照组。
纤维素酶活性，以72h，10g土壤生成葡萄糖毫克数表示。
蔗糖酶：风干土酶活测定方法：3,5-二硝基水杨酸比色法；508nm比色；1 试剂配制：（1）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。
2）PH5.5 磷酸盐酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）0.5ml 加1/15M磷酸氢二钾（9.078g磷酸氢二钾溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
（3）8%蔗糖溶液。
邻苯三酚法测定SOD酶活
邻苯三酚法测定SOD酶活—修改的Marklund方法1、本方法检出限1.17U/ml.2、定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需要的SOD酶量为一个酶活力单位。
3、原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成红橘酚，同时生成O2-，连苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。
SOD能催化O2-发生歧化反应生成H2O2和O2，从而抑制连苯三酚的自氧化。
样品对连苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD的含量。
4、试剂4.1 A液：pH 8.20、0.1 mol/l Tris-HCl缓冲溶液（内含1 mmol/L Na2EDTA）。
称取1.2114 g Tris 和37.2 mg Na2EDTA溶于62.4 ml的0.1 mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100 ml。
4.2 B液：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7 mg 溶于少量10 mmol/l 盐酸溶液，并定容至100 ml。
4.3 10 mmol/l 盐酸溶液。
4.4 0.200 mg/ml 超氧化物歧化酶。
4.5 蒸馏水。
5、样品制备样品测定前需离心，取上清液测定。
6、分析步骤6.1 邻苯三酚自氧化速率测定：在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml，加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1），本实验确定△A325（min-1）为0.060。
6.2 样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按以上步骤分别加入一定量样液或酶液使抑制率约为1/2 △A325（min-1），即△A’325（min-1）为0.030。
SOD活性测定加样程序见表1。
表1 SOD活性测定加样表试液空白样液SOD液A液/ml 2.35 2.35 2.35蒸馏水/ml 2.00 1.80 1.80样液或SOD液/μl200μl200μl B液/ml0.150.150.157、结果式中：U/ml——SOD酶活力单位；△A325——邻苯三酚自氧化速率；△A’325——样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；V——所加酶液或样液体积，单位为毫升（mL）；D——酶液或样液的稀释倍数；4.5——反应液总体积，单位为毫升（mL）。
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。
2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。
二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。
酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。
其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。
多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。
多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶•普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与02氧化形成醌，使组织形成褐变.以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。
因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410 nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的0D值产生变化，通过0D值的变化确定PPO的酶活大小。
多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2O2 -------------------------------- 邻醌+ H2O三、试验材料、试剂及试验用品1. 材料：马铃薯块茎。
2. 仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3 .试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L 邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L 磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA ）；10mmol/L 亚硫酸钠四、实验方法：1•多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在4C下离心（8000r/min）5min,取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。
土壤酶活活性测定方法
土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。
（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。
将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。
用2mL甲苯处理15分钟。
往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。
仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。
与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。
培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。
摇匀，将悬液过滤。
吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。
然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。
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邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性
试剂配制
(1)1%邻苯三酚溶液 (2)乙醚。
(3)0．5N盐酸。
(4)重铬酸钾标准溶液——o．75g重铬酸钾溶于1升0.5N
HCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)。
(5)pH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液。
标收曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用o．5N HCI稀释成各种不同浓度。
定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。
以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。
2。
投作步骤取1g土样(过o．25mm筛)，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1％邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。
取出后加4mlpH 4．5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。
最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。
比色时用波长为430nm的滤光片。
为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。
为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正
没食于酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。
在
无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。
3．活性表示紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。
多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克
数表示。
我不知道找个“紫色没食子素”是什么意思？是不是要找个试剂啊？我问了几个老师，他们都没有听说过这个试剂。
我的有的药品冯老师本来说他那有，可是我做的时候去找了，缺了几个，王老师说想办法买了，已经给李老师说了，买了后做，这几天榆林大风降温，那个移栽没有办法进行，上面红颜色的我不知道怎么做了，萃取不知道是萃取什么，看不太懂，还有测那个中性磷酸酶时的酚溶液是苯酚加水就可以了么？我这几天在图书馆查了很多资料，可是都没有啥结果（
配制方法：在大烧杯中加入80mL去离子水，再加入300g 苯酚，在水浴中加热搅拌、混合至苯酚完全溶解。
将该溶液倒入盛有200mL去离子水的1000mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，
使其成为乳状液。
静止7～10小时，乳状液变成两层透明溶液，下层为被水饱和的酚溶液，放出下层，贮存于棕色瓶中备用。
）
回复：
没食子素就是邻苯三酚。
紫色没食子素就是多酚氧化酶催化氯化没食子素生成的东西。
乙醚萃取的时候会分层，之前不是加邻苯三酚了嘛，乙醚相中萃取出的多酚物质被邻苯三酚着色了生成紫色没食子素。
萃取出来的成分就是你在430nm处测定的物质啊！。