邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性
SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法
SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。
按照GB/T5009.171-2003中邻苯三酚自氧化的方法测定酶活力，利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
一、试剂：1、pH 7.8, 0.05mol/L的磷酸缓冲液：A液: 称取17.9g Na2HPO4•12H2O于容量瓶中定容至1L；B液: 称取 7.8g NaH2PO4•2H2O于容量瓶中定容至1L；取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH 7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液。
2、C液: pH 8.20 ，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)- 盐酸缓冲液(内含1mmol/L EDTA•2Na)：称取1.2114gTris和37.2mg EDTA•2Na溶于62.4mL 0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。
3、 0.lmol/L盐酸溶液:量取2.lmL 12mol/L盐酸，蒸馏水定容至250mL。
4、.10mmol/L盐酸溶液:量取10mLO.lmol/L盐酸，蒸馏水定容至l00mL。
5、D液:4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液：称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的盐酸溶液，并定容至100mL。
二、仪器：1.冷冻离心机2.水浴锅；3．电子天平；4．紫外-可见分光光度计；5．精密酸度计，精确到0.01pH；6．10mL比色管；7．10mL离心管；8．玻璃乳钵。
三、实验步骤1．SOD粗酶液的提取称取叶片1g，置于研钵中研磨，加入3mL 0.05mol/L磷酸缓冲液，加入少量石英砂，继续在冰浴中的研钵内研磨成匀浆，取4mL至离心管中，于4℃10000r/min离心20min，上清液即为SOD粗提液。
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法
邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂）文献来源[1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424.操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。
1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。
1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mgNa2EDTA，混合，稀释到80 mL。
用pH计测量，pH应为7.4。
用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。
（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。
1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。
再往里加连苯三酚14.6 mg (M。
W.126.1 )，即得。
（当天有效,以上为1个样品的用量）。
2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。
多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。
多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。
二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。
由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。
把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。
精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。
用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。
由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。
所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。
研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。
四、试剂1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。
贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。
2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。
3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。
土壤多酚氧化酶性质研究及意义_郝建朝
; 对传统测试土壤多酚氧化酶的方法提出了一
些建议 , 对一些现象进行了初步解释 , 如荷花出淤泥而 不染成因 。 这为加快土壤多酚氧化酶在环境修复中应 用和开发它的广阔应用前景奠定基础
[ 12, 13, 14, 15]
。
1 材料与方法
1 . 1 滨江带生态湿地基本情况 湿地处于长江中下游平原的镇江北固山脚下 , 位于 东经 119° 82′ 89″ , 北纬 32° 81′ 59″ , 属于东部季风湿润区 ,
收稿日期 : 20050418; 修订日期 : 2005 - 07 -01 基金项目 : 国家 “ 十五 ”重大科技专项 (2003AA 601100 -3)资助 作者简介 : 郝建朝 (1980 - ), 男 , 河北保定人 , 贵州大学在读研究生 , 环境生物学 。 *通讯作者 : yanyouw u@ u js . edu . cn
土壤多酚氧化酶 (Polyphenol ox id ase , 简称 PPO ) 主要来源于土壤微生物 、 植物根系分泌物及动植物残 体分解释放的酶 , 它是一种复合性酶 。 土壤多 酚氧化酶能把土壤中芳香族化合物氧化成醌 , 醌与土 壤中蛋白质 、 氨基酸 、糖类 、矿物等物质反应生成大小 分子量不等有机质和色素 , 完成土壤芳香族化合物循 [ 6, 7, 8] 环 。 利用土壤多酚氧化酶的反应机制 , 人们把多 酚氧化酶用于土壤环境修复 , 丁克强
[ 10] [ 9] [ 1, 2, 3, 0 ～ 1600 毫米 , 年平均气温 15 . 4℃, 全 年 无霜 期 为 240 ～ 260 天 , 年 积 温 5000 ～ 6500℃, 而且四季分明 , 适合多种植物生长 , 并且此湿地 植被以芦苇和鹝草为主 。 供试土壤性质如表 1。
常用土壤酶测定药品及方法
纤维素酶：酶活测定方法：3,5-二硝基水杨酸比色法；540nm比色；1 试剂配制：（1）1%羟甲基纤维素溶液（2）PH5.5 磷酸盐酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g磷酸氢二钠溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
（3）甲苯（4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。
（5）葡萄糖标准溶液（1ml标准液含0.2—0.8mg葡萄糖）。
标准曲线绘制：分别取不同浓度标准葡萄糖溶液1ml移于25ml容量瓶中，加3ml二硝基水杨酸溶液。
将试管放在沸腾水浴上5min，然后迅速冷却3min。
定容，15min后在分光光度计上于波长540nm处比色测定。
以光密度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2 操作步骤称取10g土壤置于50ml三角瓶中，加20ml 1%羟甲基纤维素溶液、5ml PH5.5磷酸缓冲液及1.5ml 甲苯，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
培养结束后，过滤并定容25ml。
取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。
每一试验处理均应设置以3ml水代替基质的对照，为检验试剂纯度应设无土壤的对照组。
纤维素酶活性，以72h，10g土壤生成葡萄糖毫克数表示。
蔗糖酶：风干土酶活测定方法：3,5-二硝基水杨酸比色法；508nm比色；1 试剂配制：（1）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。
2）PH5.5 磷酸盐酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）0.5ml 加1/15M磷酸氢二钾（9.078g磷酸氢二钾溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
（3）8%蔗糖溶液。
邻苯三酚法测定SOD酶活
邻苯三酚法测定SOD酶活—修改的Marklund方法1、本方法检出限1.17U/ml.2、定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需要的SOD酶量为一个酶活力单位。
3、原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成红橘酚，同时生成O2-，连苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。
SOD能催化O2-发生歧化反应生成H2O2和O2，从而抑制连苯三酚的自氧化。
样品对连苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD的含量。
4、试剂4.1 A液：pH 8.20、0.1 mol/l Tris-HCl缓冲溶液（内含1 mmol/L Na2EDTA）。
称取1.2114 g Tris 和37.2 mg Na2EDTA溶于62.4 ml的0.1 mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100 ml。
4.2 B液：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。
称取邻苯三酚（A.R）56.7 mg 溶于少量10 mmol/l 盐酸溶液，并定容至100 ml。
4.3 10 mmol/l 盐酸溶液。
4.4 0.200 mg/ml 超氧化物歧化酶。
4.5 蒸馏水。
5、样品制备样品测定前需离心，取上清液测定。
6、分析步骤6.1 邻苯三酚自氧化速率测定：在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml，加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1），本实验确定△A325（min-1）为0.060。
6.2 样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按以上步骤分别加入一定量样液或酶液使抑制率约为1/2 △A325（min-1），即△A’325（min-1）为0.030。
SOD活性测定加样程序见表1。
表1 SOD活性测定加样表试液空白样液SOD液A液/ml 2.35 2.35 2.35蒸馏水/ml 2.00 1.80 1.80样液或SOD液/μl200μl200μl B液/ml0.150.150.157、结果式中：U/ml——SOD酶活力单位；△A325——邻苯三酚自氧化速率；△A’325——样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；V——所加酶液或样液体积，单位为毫升（mL）；D——酶液或样液的稀释倍数；4.5——反应液总体积，单位为毫升（mL）。
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。
2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。
二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。
酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。
其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。
多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。
多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶•普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与02氧化形成醌，使组织形成褐变.以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。
因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410 nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的0D值产生变化，通过0D值的变化确定PPO的酶活大小。
多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2O2 -------------------------------- 邻醌+ H2O三、试验材料、试剂及试验用品1. 材料：马铃薯块茎。
2. 仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3 .试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L 邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L 磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA ）；10mmol/L 亚硫酸钠四、实验方法：1•多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在4C下离心（8000r/min）5min,取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。
土壤酶活活性测定方法
土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。
（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。
将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。
用2mL甲苯处理15分钟。
往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。
仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。
与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。
培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。
摇匀，将悬液过滤。
吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。
然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。
多酚氧化酶活性测
溶液配制
pH=7的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液的配制：1/C1mL, C1mol/L的KH2PO4+2.963*0.2/C2mL,C2mol/LNaOH+H2O 至10mL 0.1mol/L邻苯二酚溶液的配制：取1.1g邻苯二酚 定容至100mL,保存，备用
酶的提取
从新鲜马铃薯块茎中提取多酚氧化酶：取新鲜 马铃薯洗净去皮切丝,加入100mLpH=7.0的 0.1mol/L的预冷的磷酸盐缓冲液，在高速组织 捣碎机中匀浆3min，使受伤组织中的多酚氧化 酶从细胞中分离出来，过滤得到匀浆液,将匀浆 液装入离心管中在4℃高速冷冻离心机中以 4000r/min离心15min,取出离心后的匀浆液，静 置，分液，得到上清液即为粗酶液
多酚氧化酶活性测定
缓冲液的配制
0.2mol/L的邻苯二甲酸氢钾溶液的配制 取2.042g邻苯二甲酸氢钾（204.2g/mol）固体， 溶解，定容50mL NaOH溶液的配制及标定 取0.8g氢氧化钠固体，溶解，定容至100mL （0.2mol/L），以酚酞为指示剂，用邻苯二甲酸氢 钾溶液标定，设标定后氢氧化钠溶液的浓度为 C1mol/L 磷酸二氢钾溶液的配制 取2.902g磷酸二氢钾（145.1g/mol）固体，溶解， 定容至100mL，用C1mol/L NaOH溶液标定，设标定 后磷酸二氢钾溶液的浓度为C2mol/L
பைடு நூலகம்
xmL0.2mol/LKH2PO4+ymL0.2mol/LNaOH+水至 20mL
pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 x 5 5 5 5 5 5 y 0.372mL 0.570mL 0.860mL 1.260mL 1.780mL 2.365mL pH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 x 5 5 5 5 5 5 y 2.963mL 3.500mL 3.950mL 4.280mL 4.520mL 4.680mL
多酚氧化酶实验报告
一、实验目的1. 理解多酚氧化酶（PPO）在植物组织中的作用及其活性测定的原理。
2. 掌握分光光度法测定PPO活性的操作技术。
3. 分析不同条件下PPO活性的变化，如pH值、温度等。
二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。
它能够催化酚类物质与氧气反应生成醌类物质，进而引起植物组织的褐变。
本实验采用分光光度法测定PPO的活性，通过测量反应体系在特定波长下的吸光度变化来反映酶的活性。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：马铃薯、茶叶、茶叶提取物等。
2. 试剂：0.03M磷酸缓冲液（pH 6.0）、0.01mol/L邻苯二酚溶液、5%三氯乙酸溶液、0.01mol/L的间苯二酚溶液、0.01mol/L的NaF溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、硫脲等。
四、实验步骤1. 酶提取：取一定量的马铃薯或茶叶，加入适量磷酸缓冲液（pH 6.0），用匀浆机充分匀浆，过滤，收集滤液。
2. 酶活性测定：取适量酶液，加入0.01mol/L邻苯二酚溶液，在410nm波长下测定吸光度。
3. 酶活性计算：根据吸光度变化计算酶活性，公式如下：\[ 酶活性 = \frac{ΔA}{Δt} \times V_{底物} \]其中，ΔA为吸光度变化，Δt为反应时间，V_{底物}为底物体积。
4. 影响因素实验：分别考察pH值、温度、底物浓度等因素对PPO活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活性测定：通过分光光度法测定，得到不同样品的酶活性数据，如表1所示。
表1 不同样品的酶活性| 样品 | 酶活性（U/mg） || -------- | -------------- || 马铃薯 | 1.23 || 茶叶 | 0.98 || 茶叶提取物 | 1.57 |从表1可以看出，茶叶提取物的酶活性最高，马铃薯次之，茶叶最低。
2. 影响因素实验：（1）pH值：在pH 4.0～7.0范围内，PPO活性随pH值升高而增加，在pH 6.0时达到最大值，随后逐渐下降。
多酚氧化酶活性测定及控制[开题报告]
![多酚氧化酶活性测定及控制[开题报告]](https://img.taocdn.com/s3/m/cb4313e8dd3383c4bb4cd26d.png)
毕业论文开题报告生物工程多酚氧化酶活性测定及控制一、选题的背景、意义多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。
本研究就PPO的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。
二、相关研究的最新成果及动态2.1鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，DEAE-SepH-Arose离子交换柱层析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱层析进行纯化后，经SDS-PAGE电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。
在整个过程中，该酶纯化了95．66倍，产率为2．4％。
同时研究表明，鲜切莲藕组织中PPO相对分子质量在65 900～66 100之间。
2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强,但酪氨酸所测活性的变异系数大。
面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦粉中的PPO活性高,变异系数大。
2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性,与灰分含量成极显著正相关性;前路粉流PPO 活性比后路粉流低;物料含皮较多的在线粉流PPO活性高;物料来源于小麦胚乳外层的粉流PPO活性高。
2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是NA2S2O3、AGNO3。
2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件以邻苯二酚为底物时,底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm,最适pH值为6.8,最适温度为50℃,反应时间不宜超过20min,反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳定。
抑制剂NAHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。
2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化园二色谱分析表明莲藕PPO主要含有α一螺旋和β一折叠结构。
大实验—土壤酶活性的测定解析
4.2.5 土壤酶活性的测定脲酶活性的测定采用奈氏比色法．以1 g干土24 h生成的NH3- N量为脲酶的1个活性单位[41]．过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法．酶活性以1 g干土1 h内消耗的0．1 mol·L-1KMn04体积数(以ml计)表示[42]多酚氧化酶活性的测定采用邻苯三酚比色法，以1 g干土3 h内生成的没食子素的量为多酚氧化酶的1个活性单位[43]，脱氢酶活性的测定采用三苯基四氮唑氯化物作为氢受体。
被还原后生成红色的甲臜，用比色法测定，以1 g干土6h生成的甲臜质量为脱氢酶的1个活性单位[44]。
1. 脲酶活性的测定——苯酚钠比色法（1）标准曲线的绘制吸取稀释的氮的标准溶液1，4，7，10，13，16，19mL，移入50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容。
1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。
根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。
绘制的标准曲线如图4-1所示：图4-1脲酶标准曲线（2）操作步骤取5g风干土，置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。
15min后加10mL10%尿素液和20mL PH6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
过滤后取3mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的毫克数表示。
2. 过氧化氢酶活性的测定——高锰酸钾滴定法（1）操作步骤取5g土壤样品于100mL三角瓶中（用不加入土样的作空白对照），加0.5mL甲苯，摇匀，于4℃冰箱中放置30min。
取出，立刻加入25mL冰箱储存的3%H2O2水溶液，充分混匀后，再置于4℃冰箱中放置1h。
取出，迅速加入冰箱储存的2mol/L H2SO425mL，摇匀，过滤。
取1mL滤液，用0.05mol/L的KMnO4滴定。
（2）计算根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的H2O2的量所消耗的KMnO4。
多酚氧化酶对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的干扰
。
酶 活 力 单 位定 义 为 以 抑 制 0 5 %的 反 应 产 物 蓝 0 5 叼 的 酶 鼠为 一 个
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土壤酶指标测定
土壤生物化学指标测定一、土壤脱氢酶(dehydrogenase)活性测定（比色法）（一）分析意义脱氢酶能酶促脱氢反映，它起着氢的中间传递题的作用。
在土壤中，碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，他们可以作为氢的工体。
脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。
（二）方法选择与原理Lenhard(1956)最先提出用TTC作为氢的受体生成红色的TF，进行闭塞测定，以溶液的光密度值表示酶活性。
后来对上述的方法做了不同的改进和完善。
用土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖做氢的供体，用生成的TF数量或换算成氢的体积来表示脱氢酶的活性。
（三）试剂配制1、0.5%TTC溶液2、甲苯3、Tris-HCl缓冲液Ph7.6：0.1M三羟甲基氨基甲烷（12.114g/L）50ml 与0.1MHCl38.5ml混合后，用水稀释至100ml。
4、硫化钠5、0.1mol/L葡萄糖溶液。
（四）实验步骤1、标准曲线的绘制：称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50 ml比色管中，定容，制成1 mg/L的母液。
分别向6支50ml比色管中依次注入1、2、3、4、5、6mL mg/ml 标准TTC溶液，用蒸馏水定容，是为工作液：取7只带塞比色管（50ml）依次加入2 mL Tris-HCl演算缓冲液，1 mL不同浓度的TTC工作液，1 mL10%硫化钠新配溶液，摇匀，放置20分钟；反应完全后，准确加入10ml甲苯，振摇。
完全提取TF，稳定数分钟，取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞（在比色皿中也需稳定2分钟）绘制标准曲线。
2、操作过程：取0.5g新鲜土壤，置于50ml 比色管中，依次加入2mlTris-HCl盐酸缓冲液、1ml 0.1mol/L葡萄糖溶液、1ml 0.5% TTC溶液,震荡均匀，离心（4000转/分）5分钟后，将甲苯提取液在分光光度计492 nm处闭塞测定。
同时设无土壤和无TTC的对照（以蒸馏水替代）。
3、结果计算：脱氢酶活性=TF含量/0.5g —土壤含水量脱氢酶活性，以24h后1g干土中TF的生成量表示。
植物多酚氧化酶、超氧化物歧化酶的测定
植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。
用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。
反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O三、材料、仪器及试剂1. 材料：马铃薯块茎等2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚；20％三氯乙酸。
四、实验步骤1. 粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。
将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。
A 酶提取液总量（ml）酶活力（0.01A·min－1）＝———————×———————————0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）A 酶提取液总量（ml）酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×——————————0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
多酚氧化酶活性的测定
多酚氧化酶活性的测定多酚氧化酶(POD)是一种酶类，广泛存在于植物、细菌和真菌等生物体中，具有氧化多酚的功能，可将多酚类物质氧化为其对应的醛酮或烯醇。
多酚氧化酶活性的测定是研究植物生理生态、农业及食品科学等领域的重要技术手段之一。
多酚氧化酶活性的测定方法有多种，常见的测定方法有单宁酸、苯胺、硫脲、芳香胺等底物的光度法、荧光法、色谱法和电化学法等。
其中，光度法测定多酚氧化酶活性是相对最简便、经济、有效的方法之一。
一、实验原理多酚氧化酶活性的测定原理基于多酚类物质的氧化反应，其反应方程式如下：多酚+ H2O2 → 多酚氧化酶→ 合成物 + H2O在光度法中，用苯酚为底物，通过苯酚酸化后生成背景吸光度，再将多酚加到反应体系中，多酚在酸性条件下与过氧化氢发生氧化反应，产生黄色的产物苯醛，可在310nm处检测吸光度增加。
二、实验步骤步骤一：制备反应液(1)苯酚称取1g苯酚溶于50ml0.1mol/L的钠碳酸中，加入2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至显红色终点，记录滴定体积，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定至淡粉色的时间，同时记录滴定体积，测定得到苯酚的浓度。
(2)过氧化氢称取30%的过氧化氢溶液，在室温下稀释成0.04%过氧化氢溶液。
(3)缓冲液将0.2mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液(PH 6.0)浓度稀释成0.05mol/L。
(4)酶提取液在质量浓度等于1的0.05mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液中先加入1mmol/L的PEG6000，频繁将其混合均匀之后，再加入5%聚乙烯醇，在最后再加入一些几丁糖粉，并不断地搅拌混合均匀之后过滤清除残留物，提取所需酶液。
(1)标准液分别取0-40μmol/L的马尾松酚，加入0.1mol/L的硫酸调节pH至1，在0.1mol/L的缓冲液溶液中进行100μl反应，80℃下控制反应时间在5min在323nm检测吸光度，绘制标准曲线。
(2)样品处理将植物或细胞样品在工作台上用0.1mol/L的N/2 H2SO4溶解，然后过滤，用样品液稀释1倍。
多酚氧化酶的活性测定的报告
xx日：多酚氧化酶活性的测定。
一、试验目的本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原理及操作技术。
二、试验原理酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。
本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
三、试验材料、试剂及试验用品材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯处理。
药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）四、实验方法：1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。
2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。
将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。
以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。
3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。
(注意空白为：2.5mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。
4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V(式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。
邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性
邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性试剂配制(1)1%邻苯三酚溶液 (2)乙醚。
(3)0．5N盐酸。
(4)重铬酸钾标准溶液——o．75g重铬酸钾溶于1升0.5NHCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)。
(5)pH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液。
标收曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用o．5N HCI稀释成各种不同浓度。
定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。
以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。
2。
投作步骤取1g土样(过o．25mm筛)，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1％邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。
取出后加4mlpH 4．5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。
最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。
比色时用波长为430nm的滤光片。
为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。
为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食于酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。
在无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。
3．活性表示紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。
多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克数表示。
我不知道找个“紫色没食子素”是什么意思？是不是要找个试剂啊？我问了几个老师，他们都没有听说过这个试剂。
我的有的药品冯老师本来说他那有，可是我做的时候去找了，缺了几个，王老师说想办法买了，已经给李老师说了，买了后做，这几天榆林大风降温，那个移栽没有办法进行，上面红颜色的我不知道怎么做了，萃取不知道是萃取什么，看不太懂，还有测那个中性磷酸酶时的酚溶液是苯酚加水就可以了么？我这几天在图书馆查了很多资料，可是都没有啥结果（配制方法：在大烧杯中加入80mL去离子水，再加入300g 苯酚，在水浴中加热搅拌、混合至苯酚完全溶解。
将该溶液倒入盛有200mL去离子水的1000mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。
土壤酶活性的测定
土壤酶活性的测定1.土壤样品采集与制备取根际土壤为土壤样品，同时挖取根系周围0-20cm和20-40cm土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。
充分混匀后取样，用于土壤酶活性测定的土壤经风干后，过1mm筛，测定多酚氧化酶活性土样过0.25mm筛。
供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带回实验室，磨细过2mm筛后，置于4℃冰箱内保存备测土壤微生物种群、数量等。
2.土壤酶活性的测定方法2.1.土壤脲酶比色法测定多酚氧化酶、过氧化物酶活性采用邻苯三酚比色法测定；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法；碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法（2）测定操作步骤：称2g过1mm筛风干土，置于100mL三角瓶中，注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液，振荡(120次/分钟)20分钟。
随即加入3N硫酸5mL，稳定未分解的过氧化氢并终止反应。
用慢速型滤纸过滤瓶中的土壤悬浊液，吸取25nil滤液，用0.01N高锰敏钾滴定至淡粉红色终点。
结果计算：设滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(mL数)为B滴定25而原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(mL数)为A高锰酸钾滴定度的校正值为T=(A-B)×T/2等于20分钟土壤的过氧化氢酶活性(mL 0.lmol KMnO4/g)2.2.脲酶采用靛酚蓝比色法操作步骤：取2.5g风干土，置于50mL三角瓶中，加0.5mL甲苯，15min后加5mL 10%尿素液和10mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
过滤后取0.5mL滤液注入25mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
氮的标液：精确称取0.4717g硫酸按溶于水并稀释至1000mL，则得1mL含0.1mg氮的标准液。
绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。
标线绘制：取稀释的标准液l、3、5、7、9、11、13mL，移于50rnl容量瓶中，然后加入蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酸钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)
多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)产品简介：多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性，多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。
该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
Leagene 多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)检测原理是以邻苯二酚作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。
该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的多酚氧化酶活性，尤其适用于检测水果中多酚氧化酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
产品组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、低温离心机5、比色杯6、分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取植物组织或水果中层果肉加入预冷的PPO Lysis buffer 研磨或匀浆，离心，留取上清液，冻存，用于多酚氧化酶的检测。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，编号名称TE042960T Storage试剂(A):PPO Lysis buffer 500ml 4℃试剂(B):PPO Assay buffer 25ml4℃避光使用说明书1份冻存，用于多酚氧化酶的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PPO Lysis buffer进行适当匀浆，离心，取上清液，冻存，用于多酚氧化酶的检测。
④高活性样品：如果样品中含有较高活性的多酚氧化酶，可以使用PPO Lysis buffer进行恰当的稀释。
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邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性
试剂配制
(1)1%邻苯三酚溶液 (2)乙醚。
(3)0．5N盐酸。
(4)重铬酸钾标准溶液——o．75g重铬酸钾溶于1升0.5N
HCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)。
(5)pH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液。
标收曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用o．5N HCI稀释成各种不同浓度。
定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。
以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。
2。
投作步骤取1g土样(过o．25mm筛)，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1％邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。
取出后加4mlpH 4．5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。
最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。
比色时用波长为430nm的滤光片。
为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。
为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正
没食于酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。
在
无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。
3．活性表示紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。
多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克
数表示。
我不知道找个“紫色没食子素”是什么意思？是不是要找个试剂啊？我问了几个老师，他们都没有听说过这个试剂。
我的有的药品冯老师本来说他那有，可是我做的时候去找了，缺了几个，王老师说想办法买了，已经给李老师说了，买了后做，这几天榆林大风降温，那个移栽没有办法进行，上面红颜色的我不知道怎么做了，萃取不知道是萃取什么，看不太懂，还有测那个中性磷酸酶时的酚溶液是苯酚加水就可以了么？我这几天在图书馆查了很多资料，可是都没有啥结果（
配制方法：在大烧杯中加入80mL去离子水，再加入300g 苯酚，在水浴中加热搅拌、混合至苯酚完全溶解。
将该溶液倒入盛有200mL去离子水的1000mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，
使其成为乳状液。
静止7～10小时，乳状液变成两层透明溶液，下层为被水饱和的酚溶液，放出下层，贮存于棕色瓶中备用。
）
回复：
没食子素就是邻苯三酚。
紫色没食子素就是多酚氧化酶催化氯化没食子素生成的东西。
乙醚萃取的时候会分层，之前不是加邻苯三酚了嘛，乙醚相中萃取出的多酚物质被邻苯三酚着色了生成紫色没食子素。
萃取出来的成分就是你在430nm处测定的物质啊！。