淀粉酶菌株的选育发酵工艺的研究和酶的纯化模板
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
二、分离及纯化1、材料试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱其他：报纸、纱布、棉花、面线绳2、方法2.1培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制称量1.2克淀粉。
加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。
（2）无菌水的制备分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。
取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。
（3）器皿的准备将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。
2.2菌悬液的制备和梯度稀释取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。
取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。
淀粉酶产生菌的筛选、培养与选育
功能微生物（淀粉酶产生菌）的筛选、培养与选育22100934 程雅楠摘要：以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程，并测定了诱变后菌株的16s序列，初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。
关键词：产淀粉酶细菌筛选选育诱变育种淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株。
淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。
此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌，通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。
以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
1材料和方法1.1材料1.1.1 来源：南师大北区教学楼附近的土壤。
1.1..2培养基：淀粉培养基的配制①固体培养基膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
②液体培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。
优化条件培养基配制：①淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 4.0 。
②淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 7.2 。
碳源培养基：①淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。
淀粉酶菌株的选育发酵工艺的研究和酶的纯化
淀粉酶菌株的选育发酵工艺的研究和酶的纯化摘要：淀粉酶是最早用于工业生产同时迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，第一通过淀粉培养基从土壤中选择出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，选择出产量高、性状优良的突变菌株，再用正交试验的方法对其发酵条件进行优化，实验最后采纳硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活性进行了测定。
关键词：淀粉酶；分离选择；紫外线诱变；优化；提纯1、引言淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，是最早用于工业生产同时迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有宽敞的用途。
我国是传统的农业大国，进展淀粉深加工工业是解决当前淀粉生产积压的好出路，而几乎所有淀粉深加工工业的基础差不多上以淀粉质原料的水解作为第一步，因此淀粉质原料的液化情形直截了当关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。
因此，改进淀粉液化工艺也是降低生产成本，提高产品市场竞争能力的一种重要手段。
明显，改进淀粉液化工艺首要任务确实是提高淀粉酶的生产水平。
那如何提高淀粉酶的生产水平呢？我们明白，现在淀粉酶要紧来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此选择出高产、稳固的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。
本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的枯草杆菌，通过紫外线诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳固的淀粉酶产生菌株，并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯，以达到加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、把握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的阻碍、熟悉发酵条件的优化方法、把握分光光度法测液化型淀粉酶活力的差不多原理和方法、把握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
2、材料与方法2. 1 实验材料2．1．1 样品：贵师大综合楼邻近的土壤2．1．2 培养基和试剂：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液体）种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液2．1．3 仪器设备：全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案产淀粉酶菌株的筛选是一项重要的研究工作，它可以满足很多工业和农业领域的需求。
下面是一个设计方案，包含步骤、实验条件和分析方法。
1.步骤（1）菌株的收集和培养首先，需要收集不同环境中的样品，如土壤、水体、植物表面等。
将样品分离培养在富含淀粉的琼脂培养基中。
培养过程中，需保持适宜的温度（通常在30℃左右）和适宜的pH（通常为6-7）。
（2）淀粉酶活性筛选将分离培养基中的菌株进行淀粉酶活性筛选。
取一小部分菌株涂抹到含有淀粉的琼脂培养基上，培养一段时间后在培养皿上观察是否产生明显的透明圈。
透明圈的出现表示淀粉酶活性较高的菌株。
（3）淀粉酶活性检测和比较从产生透明圈的培养皿中挑取具有高活性的菌落，进行淀粉酶活性检测。
可采用碘液滴加法，在含淀粉的琼脂培养基上，滴上一滴碘液，观察出现的蓝色溶解圈的明暗程度，可以初步评估淀粉酶活性的强弱。
（4）纯化和鉴定筛选出具有较高淀粉酶活性的菌株后，通过纯化和鉴定，进一步确定其产淀粉酶的能力以及体外条件如温度和pH对淀粉酶活性的影响。
可采用离心、柱层析等技术对菌株进行纯化。
通过测量在不同条件下的淀粉酶活性，确定最适宜的条件。
2.实验条件（1）培养条件：温度为30℃，pH为6-7（2）培养基：含淀粉和琼脂的培养基。
（3）检测条件：培养基含有淀粉，通过碘液滴加法观察形成的蓝色溶解圈明暗程度。
3.分析方法（1）测量淀粉酶活性采用I2-KI法测定淀粉酶活性。
将一定量的菌株培养液加入含淀粉的缓冲液中，反应一段时间后，加入碘液和KI溶液，混匀后通过测量吸光度来确定淀粉转化的程度。
（2）蛋白质含量测定通过BCA方法测定菌株培养液中的蛋白质含量。
将菌株培养液样品与BCA试剂混合，在一定温度下测量吸光度来确定蛋白质含量。
（3）酶动力学参数分析采用酶动力学参数分析方法，如麦克斯韦–玛尔特尔方程等，通过测定在不同底物浓度下的淀粉酶活性，来确定酶的最适底物浓度、最适酶浓度以及酶的最大反应速率。
“产淀粉酶菌株的筛选”设计方案
“产淀粉酶菌株的筛选”设计⽅案产淀粉酶（α-淀粉酶）细菌菌株筛选⼀、实验⽬的：1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微⽣物的完整操作步骤。
2.巩固以前所学的微⽣物学实验技术。
3.学习淀粉酶活性的测定⽅法。
⼆、实验原理：1.α-淀粉酶是⼀种液化型淀粉酶，它的产⽣菌芽孢杆菌，⼴泛分布于⾃然界，尤其是在含有淀粉类物质的⼟壤等样品中。
2.从⾃然界筛选菌种的具体做法，⼤致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。
a)采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究⼀下⾃⼰打算筛选的微⽣物在哪些地⽅分布最多，然后才可着⼿做各项具体⼯作。
在⼟壤中⼏乎各种微⽣物都可以找到，因⽽⼟壤可说是微⽣物的⼤本营。
例如厨房⼟壤、⾯粉加⼯⼚和菜园⼟壤中淀粉的分解菌较多。
b)富集培养：富集培养就是在所采集的⼟壤等含菌样品中加⼊某些物质，并创造⼀些有利于待分离微⽣物⽣长的其他条件，使能分解利⽤这类物质的微⽣物⼤量繁殖，从⽽便于我们从其中分离到这类微⽣物。
c)初步筛选：i.（选择培养基）初筛使⽤选择培养基对菌种进⾏培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出⽬的菌种，从⽽进⾏培养。
ii.（鉴别培养基）初筛利⽤鉴别培养基，通过添加⼀些特殊的试剂或成分来鉴别出⽬的菌种，从⽽筛选出来并对其进⾏培养。
d)分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的⽬的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从⽽得到纯种的菌落。
纯种分离的⽅法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢⼦或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
e)性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进⾏性能测定后才能决定取舍。
三、实验材料：1.培养基配制：a)培养基按以下⽐例配制后，加蒸馏⽔调⾄100%；b)富集培养基：可溶性淀粉1%、蛋⽩胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、琼脂粉0.8%、⽜⾁膏0.5%、pH7.0；c)分离培养基：⽟⽶粉2%、黄⾖饼粉1.5%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸铵0.075%（溶解后加⼊）、Na2HPO40.2%、pH7.0。
产_淀粉酶菌株的分离_鉴定及酶学性质研究
try. Methods: A- amylase- producing strains were isolated from soil samples by initial screening with iodine solution and the flasks fermentation. Then strains were identified based on partial 16S rDNA gene sequence aligned with the GenBank database and its morphological characteristics.
脱盐后, 对其酶学性质进行初步研究。结果: 从土壤中筛选到一株高产 A- 淀粉酶菌株, 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis XL- 15。 该 菌株所产 A- 淀粉酶的最适反应温度为 50e , 最适作用 pH 为 6. 5; Ca2+ 和 Mn2+ 对酶有激活 作用, 而 Cu2+ 、Zn2+ 和 EDTA 对酶有 抑
实验一土壤中淀粉酶产生菌的分离和纯化
1.掌握常用培养基的配制方法。
2.掌握微生物的分离、纯化及菌种保藏的基本原理和方法。
3.练习微生物接种、移植和培养等基本技术，掌握无菌操作技术。
二、基本原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，混杂生存着大量不同种类的微生物，从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
3.3.4恒温培养：将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24hr后观察。
六注意事项
1 整个操作在无菌条件下进行
2 配置固体培养基时要等溶液煮沸再加琼脂
3 稀释土壤悬液时每次换枪头
4 高压蒸汽灭菌过程中，注意不要将待灭菌的物品摆放太密，以免妨碍空气流通；灭菌结束后，应待压力降至接近“0”时，才能打开放气阀，过早过急地排气，会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外
1.5加塞培养基分装完毕，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
1.6灭菌将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，放回内层锅，并装入培养基，加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，加热，0.103MPa，121℃并同时打开排气，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升；当锅内压力升到所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间。30min后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至”0”时，打开排气，旋送螺铨，打开盖子，取出。
3.3.2 划A区：将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯(这时皿盖朝上，仍留在酒精灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
产淀粉酶菌株的筛选实验报告
产淀粉酶菌株的筛选实验报告一、实验背景淀粉酶是一种常见的酶，广泛存在于微生物和植物中。
淀粉酶能够水解淀粉分子，将其分解成糖类分子，如葡萄糖、麦芽糖等。
淀粉酶广泛应用于食品、医药、环保等领域中。
制备高效的产淀粉酶菌株，对实现产业化生产具有重要意义。
二、实验目的通过筛选不同菌株的淀粉酶产量，选出产淀粉酶效果较好的菌株，为后续工业化生产提供依据。
三、实验步骤及方法1. 菌株的选取本实验选取了3株常见的淀粉酶产生菌株，分别为Bacillus subtilis、Aspergillus niger、Trichoderma reesei。
2. 菌株的培养将3株菌株接种到琼脂培养基中，经过静置培养后，选取菌落较为圆润、生长状态良好的菌落，移植至含有淀粉质的液体培养基中，进行淀粉酶产量的筛选实验。
3.淀粉酶活性的测定分别取3组接种液，以葡萄糖和淀粉为基质，分别加入菌液，进行淀粉酶活性测定。
具体步骤如下：(1)准备含1%淀粉质的液体培养基和0.5%葡萄糖液体培养基。
(2)将接种液投入含1%淀粉质的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入 1%伊红色溶液备用。
(3)将接种液投入含0.5%葡萄糖的液体培养基中，加入0.1mol/L乙酸钠溶液，pH为5.6，放置于37℃水浴中反应30min，加入1%伊红色溶液备用。
(4)通过比较加入菌液前后溶液颜色的深浅，计算出淀粉酶的酶活力。
4. 结果记录及分析根据上述实验步骤，在不同的液体培养基中测定了3株菌株的淀粉酶活性，并记录结果如下表所示：表1.不同菌株的淀粉酶活性| 菌株名称 | 淀粉酶酶活力 || ------------------ | --------------- || Bacillus subtilis | 0.19 U/mL || Aspergillus niger | 0.21 U/mL || Trichoderma reesei | 0.23 U/mL |根据上表结果可以看出，3株菌株在淀粉酶产量方面的效果有所不同。
产淀粉酶菌种的筛选及酶活力检测
产胞外淀粉酶的菌株的筛选以及酶活力的测定一：实验原理异养型微生物在生存的时候，自己不能产生可以供机体使用的能源物质。
所以必须从体外获取这些能源物质。
某些异养型的微生物可以利用淀粉作为能源物质将其分解为葡萄糖让自己利用。
但是淀粉作为大分子的物质不能直接进入微生物的体内直接将其分解。
所以某些微生物会产生胞外淀粉酶，将自己周围的淀粉分解为葡萄糖。
再葡萄糖进行吸收利用。
本实验就是筛选出一种产胞外淀粉酶的高效菌株，并对其产生的胞外淀粉酶的酶活力进行初步检测。
二：实验器材，试剂1样品：发霉的面包，富含淀粉的土壤，2仪器：离心机，试管，紫外分光光度计，三角瓶，摇床，分析天平，定量移液器，药匙，培养皿，恒温水浴锅，恒温培养箱，超净工作台，接种环，接种针，酒精灯，高压灭菌锅，直尺，移液管，洗耳球。
3试剂：碘固体，DNS（3，5－二硝基水扬酸），1mg/ml的麦芽糖溶液，1%的淀粉标准溶液，PH为5.5的柠檬酸缓冲液。
4培养基：淀粉培养基：可溶性淀粉2g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，PH7.0。
种子培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0。
产酶培养基：可溶性淀粉2g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0。
三：实验步骤1：初筛①若样品为富含淀粉的土壤，则称取土壤样品10g放在盛有90ml无菌水和8颗小玻璃珠的三角瓶中，放置在摇床上震荡30min后再进行七次梯度稀释，分别取第4,5,6,7次梯度稀释后的稀释液各1ml进行初步培养。
所用的培养基为淀粉培养基。
在37℃恒温培养箱中培养，直至培养基中长出明显的菌落。
②若样品为发霉的面包，则用接种环或接种针挑取部分的霉块。
将挑取的霉块浸泡在装有10ml无菌水的试管里震荡1min进行稀释。
取1ml稀释液进行初步培养。
所用培养基为淀粉培养基。
在37℃恒温培养箱中培养，直至培养基中长出明显的菌落。
淀粉酶产生菌株细菌的分离纯化及检测
1%豆粕粉浸出液的制备
称取1%豆粕粉，加入适量水； 加热煮沸20min，过滤后定溶至1Hale Waihona Puke 的体 积备用； 加热过程注意补水。
实验中器材的准备（需要包扎灭菌）
1ml无菌吸管 6支 99ml无菌水 1瓶（带玻珠，装于 250ml三角瓶中） 9ml无菌水 4支（装于18×180mm试 管） 不锈钢涂布器 3支
实验步骤及安排
今天完成稀释平板分离培养——倒平板、 样品稀释、加样、涂布、恒温倒置培养 （37℃ 48hr）； 2天后晚上，挑菌保存，点植平板培养 24hr； 点植后24hr内检测淀粉酶产生量——测量 平板上透明圈、菌落直径，并计算出比值。
实验结果
记录稀释平板分离的结果——细菌数、产 淀粉的菌数及所点比例； 记录点植结果——挑取菌株编号、透明圈 直径、菌落直径，并计算出透明圈、菌落 直径比； 根据以上结果完成实验报告； 确定相关菌株（5~10株）保存好，准备 进行下周摇瓶初筛试验。
目的要求
了解利用选择培养基进行α-淀粉酶产生菌 株分离的要求。 掌握α-淀粉酶产生菌株相关分离纯化的方 法步骤——稀释平板菌落分离、挑菌保存、 平板点植、观察测定透明圈等。 学习在平板上进行α-淀粉酶产生菌株的检 测及产酶高低的判断。
平板分离用选择培养基
可溶性淀粉 10g； 1%豆粕粉浸出液 1000mL； Na2HPO4 .12H2O 2g； （NH4）2SO4 1g； CaCl2 0.5g； KCl 0.15g； 琼脂 20g pH 7.0~7.6 121.3℃灭菌20分钟
产α淀粉酶菌株发酵工艺流程
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自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。
淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。
根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。
随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。
生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。
70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。
研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。
Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。
产淀粉酶菌株的分离与纯化
产淀粉酶菌株的分离与纯化一、实验目的和内容目的：掌握用平板稀释法分离得到微生物纯种的方法内容：分离产淀粉酶的芽孢杆菌二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，因此可以从土壤中分离、纯化有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法是常用的方法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等条件，或加入某种底物、抑制剂造成只利于该微生物生长而一直其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落儿获得一种纯培养，获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板技术来完成。
（3）纯化方法：平板划线法，即将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线，第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C 区）是逐级稀释的过渡区，第四区（D区），则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。
为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是D﹥C﹥B﹥A。
三、实验材料1.土样2. 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.5g、蛋白胨15g、NaCl 2.5g、琼脂10g、2%可溶性淀粉10g、无菌水1000ml、PH7.4-7.63.试剂与材料用具：无菌水烧杯、玻璃管、涂布棒、无菌吸管、移液枪、玻璃棒、接种环、无菌培养皿、三角烧瓶、量筒、培养基分装器、天平、药匙、PH试纸、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、棉花、牛皮纸、记号笔，橡皮筋等。
四、实验步骤（一）稀释涂布平板法1.制备培养基2.倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷至55~60℃时，倒平板。
3.制备土壤菌悬液称取土样10g放入盛有90ml无菌水的烧杯中，搅拌均匀。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从中吸取1ml加入另一支盛有9ml无菌水的试管中，充分混匀，以此类推制成10ˉ1,10ˉ2,10ˉ3,10ˉ4,10ˉ5,10ˉ6不同稀释度的土壤溶液。
高产淀粉酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究PPT课件
06
结论
研究成果总结
确定了该菌株的最佳生长条件，包括温度、pH 和培养基成分。
通过基因工程技术对菌株进行改造，提高了淀粉酶的 产量和性能。
成功分离出高产淀粉酶的菌株，经过鉴定为革 兰氏阳性菌。
酶学性质研究表明，该菌株产生的淀粉酶具有较 高的活性和稳定性，适用于多种淀粉类物质的降 解。
对实际生产的指导意义
针对市场需求，研究开发具有 更高活性和稳定性的淀粉酶突 变体，提高产品的竞争力。
谢谢观看
菌株分离方法
采用适当的培养基和培养条件， 通过划线分离、涂布分离、稀释 分离等方法，将菌株从样本中分 离出来。
分离得到的菌株鉴定
形态学鉴定
观察菌落的形状、大小、颜色、 质地等特征，以及菌体细胞的形 态、染色反应等，初步确定菌株 的分类地位。
生化鉴定
通过测定菌株对碳源、氮源、维 生素等物质的利用以及产生的代 谢产物，进一步确定菌株的分类 学特征。
高产淀粉酶菌株的分离鉴定及酶学 性质研究ppt课件
目录
• 引言 • 高产淀粉酶菌株的分离 • 酶学性质研究 • 菌株遗传特性研究 • 实验结果与讨论 • 结论
01
引言
研究背景与意义
淀粉酶在食品、造纸、纺织等工业领 域具有广泛应用，因此高产淀粉酶菌 株的分离鉴定及酶学性质研究具有重 要的实际意义。
酶活力的测定
在确定的发酵条件下，测定菌株产淀粉酶的 活力，为后续的酶学性质研究提供依据。
03
酶学性质研究
酶活力的测定
酶活力定义
酶活力是指酶催化特定化学反应的能 力，通常以单位时间内底物消耗或产 物生成的量来表示。
酶活力测定方法
通过在一定条件下，测定酶促反应的 初速度来计算酶活力，常用的方法有 紫外可见吸收法、荧光法、电化学法 等。
产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备[开题报告]
![产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备[开题报告]](https://img.taocdn.com/s3/m/95b4b2aa0975f46527d3e16d.png)
毕业论文开题报告生物工程产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备1 选题的背景和意义淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。
它是最重要的工业用酶之一，广泛应用于各种淀粉转化为糖浆，以环糊精为产品的制药行业，这些酶约占全球酶产量的30％。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物，现在广泛应用于工业生产的主要是微生物淀粉酶。
淀粉酶不仅可以简化液化、糖化过程，降低淀粉深加工的生产成本，还可用于麦芽糖浆的生产、开发新型助消化剂以及工业废液处理等多个领域，包括淀粉酶、异构酶、果胶酶和纤维素酶等糖酶所占的市场份额约为40％。
而食品和饮料行业利用90％的糖酶进行生产，因此淀粉酶具有巨大的应用前景。
随着社会需求的增大，工业生产对α-淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需具更高活性的淀粉酶制剂。
生物发酵法生产淀粉酶只是解决了“丰产”的问题，但要最大限度地创造出物质财富，必须还要从下游分离工程（酶的分离纯化）解决“丰收”的问题。
通常处理的发酵液或酶反应液中淀粉酶的浓度一般很低，提取时所耗费的能量就很大，费用也就很高，同时淀粉酶是生化活性物质，易受环境因素如温度、pH、金属离子和微生物等的影响，甚至失活，而在很多情况下，特别是医药产品和作为生物试剂用的产品，其最终产品的纯度要求很高，有些产品要求是有一定保存期的稳定的无色晶体。
因此，下游工程往往要比其他生产过程需要更多的设备，耗用更多的能源及操作费用。
酶的分离纯化常在整个用发酵法生产酶产品的生产成本上占主要部分，如果终产物纯度要求相当高时更是如此。
对于传统发酵工业来说，其分离和提纯所占费用约为总投资的60%，而对于基因工程菌的发酵，甚至达到整个生产投资的80%-90%。
所以认真地研究和优化发酵液中淀粉酶的分离纯化工艺对工业降低生产成本，提高经济效益至关重要。
2 相关研究的最新成果及动态2.1 产淀粉酶菌株的研究淀粉酶是由植物、动物和微生物产生的。
淀粉酶产生菌的筛选、诱变选育及产酶条件优化研究
产淀粉酶菌株诱变剂量选择
• 1. 培养基：葡萄糖2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，水 1000ml • 2. 将出发菌株从试管中用25mL无菌生理盐水多次洗出，倒入含有玻璃珠的无
菌三角瓶中，进行反复振荡20min。
• 3. 吸出5mL至含有磁针的无菌平皿中，置于磁力搅拌器上，缓慢加速磁力搅拌 器。然后打开培养皿盖，再打开紫外灯迅速记时（在红光或黑暗条件下进
实验三 高产淀粉酶产生菌紫外诱变选育
• DNA于260nm有最大能量吸收峰，通过与15W紫外灯相距
30cm的紫外照射，会吸收大量能量造成DNA分子发生断裂、 分子结构形式发生改变。
• 经过修复，DNA碱基发生了改变从而形成了突变株，有些突
变株产酶水平提高了（正突变），而有些突变株产酶水平降低
了（负突变），再通过功能性平板筛选和复筛获得目的突变株。
实验一 淀粉酶产生菌的筛选
培养基制备
配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，
灭菌。
配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三角瓶中，封
口膜封口，灭菌。
倒平板
将融化的初筛平板培养基冷却至50-60℃，以无菌
操作法倒至已灭菌的培养皿中，至盖满底部。冷
却凝固待用。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
样品预处理
淀粉酶的应用
实验内容
• 建立高产淀粉酶产生菌初筛方法 • 建立高产淀粉酶产生菌复筛方法
• 建立淀粉酶酶活测定方法
• 建立高产淀粉酶菌诱变育种方法
• 建立高产淀粉酶产生菌产酶条件优化方法
实验目的
• • • • • 掌握淀粉酶产生菌初筛方法 掌握淀粉酶产生菌复筛方法 掌握淀粉酶酶活测定方法 掌握紫外诱变育种方法 掌握微生物产淀粉酶条件优化方法
实验 产淀粉酶菌株的筛选
六、结果分析
从不同地点获得的结果为什么会出现差1.为什么要用淀粉作为碳源？ 2.为什么要及时观察实验结果，否则会有什么样的后 果？
3.为什么同一个土样要稀释不同梯度进行涂平板？
当能合成淀粉酶的微生物在固体培养基中生长时，会将淀粉
酶分泌到菌体周围，使菌落周围的淀粉水解成为小分子量的 糊精、聚糖和单糖。
在用碘显色时，在菌体周围形成透明圈。
三、实验材料及仪器
实验材料：
实验仪器： 牛皮纸
蛋白胨
牛肉膏
培养皿
试管
NaCl
琼脂 可溶性淀粉 碘液
四、实验步骤
3. 土样的采集
（1）每一小组不同环境取土样并记录当时取样环境情况。
（2）以小组为单位进行稀释分离：
取土样 1g，加入 9mL无菌水，逐步稀释至105、106、107 ，每个梯度涂2个平皿。
（3）30℃恒温培养48 h。
图示：梯度稀释法分离微生物
四、实验步骤
（4）产淀粉酶菌株的鉴定。
涂布棒
恒温培养箱
玻璃珠
四、实验步骤
1.筛选培养基的配制
可溶性淀粉 2g，NaCl 5g，牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，琼脂
20g，水1000mL。
2.碘液的配制 称取 KI 2g，用50 mL去离子水溶解，迅速称量I2 0.5g并加 入KI溶液中，用纯水定容到100mL，搅拌溶解后保存在棕色 瓶中，橡皮塞封口。
1实验一实验一产淀粉酶菌株的筛选产淀粉酶菌株的筛选一实验目的一实验目的n从土壤中筛选一株能够合成分泌淀粉酶的微生物二实验原理二实验原理n自然界中有些微生物能够以淀粉作为碳源进行生长繁殖
产淀粉酶菌株的分离与纯化
产淀粉酶菌株的分离与纯化淀粉酶是一种非常重要的酶，能够分解淀粉成为可溶性糖，因而在食品、医药、酿酒等行业得到广泛应用。
因此，分离和纯化产淀粉酶菌株是具有重要意义的。
下文将介绍产淀粉酶菌株的分离与纯化方法。
1. 采集样品：淀粉酶通常存在于地下、水中、土壤等环境中。
样品的选择应根据所需的淀粉酶的类型和应用场景来决定。
2. 感染培养基：将样品置于适宜的环境中，如适温、适湿度、适pH值的培养基中，让细菌在培养基中生长和繁殖。
比较常用的培养基有TSA、PDA、LB、NB等。
3. 分离单菌：通过分离单菌，可以确定产淀粉酶的细菌，操作方法较为简单。
将样品分别在加了32g/L的琼脂和未加琼脂的培养基上涂布，按舞台上单菌生长的特点，通过肉眼观察或显微镜观察，挑选纯化细菌。
采用串联稀释法和滤膜法也可以分离单菌。
4. 鉴定菌株：通过对不同细菌的营养代谢特性，生化特性和形态特征等鉴定菌株，找出含有产淀粉酶的菌株。
1. 生长条件的调节：影响淀粉酶生长和产酶能力的因素有很多，如温度、pH、营养物质等。
应该根据菌株特性，适当调整这些因素，以提高淀粉酶的产量。
2. 分离淀粉酶：淀粉酶通常存在于细菌的胞外，利用超声波破碎、离心、超滤等方法可以将淀粉酶从菌体的胞外获得。
离心法是最常用的方法，将菌液离心后，分离出淀粉酶液，可以去除不溶性的杂质。
3. 纯化淀粉酶：淀粉酶纯化的方法有许多种，如酒精沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等。
其中，离子交换层析法是常用的一种方法，先将淀粉酶溶液加到离子交换树脂中，随后用缓冲溶液洗脱离子交换树脂，分离出淀粉酶。
以上介绍了产淀粉酶菌株的分离与纯化方法，这些方法可以得到高产量和纯度的淀粉酶，为利用淀粉酶提供了重要的技术支持。
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淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化
摘要: 淀粉酶是最早用于工业生产而且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一, 为了提高淀粉酶的生产水平, 首先经过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株, 对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变, 筛选出产量高、性状优良的突变菌株, 再用正交试验的方法对其发酵条件进行优化, 实验最后采用硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活性进行了测定。
关键词: 淀粉酶; 分离筛选; 紫外线诱变; 优化; 提纯
1、引言
淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称, 包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶, 是最早用于工业生产而且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多, 特点各异, 在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。
中国是传统的农业大国, 发展淀粉深加工工业是解决当前淀
粉生产积压的好出路, 而几乎所有淀粉深加工工业的基础都是以
淀粉质原料的水解作为第一步, 因此淀粉质原料的液化情况直接
关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。
因此, 改进淀粉液化工艺也是降低生产成本, 提高产品市场竞争能力的一种重要手段。
显然, 改进淀粉液化工艺首要任务就是提高淀粉酶的生产水平。
那如何提高淀粉酶的生产水平呢? 我们知道, 现在淀粉酶主要来源于植物和微生物, 并经过发酵完成生产, 因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。
本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的枯草杆菌, 经过紫外线诱变育种及发酵条件优化
来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株, 并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯, 以达到加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的影响、熟悉发酵条件的优化方法、掌握分光亮度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
2、材料与方法
2.1实验材料
2．1．1样品: 贵师大综合楼附近的土壤
2．1．2培养基和试剂: 淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨( 斜面) 、牛肉膏蛋白胨( 液体) 种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液
2．1．3仪器设备: 全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光亮度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
2.2实验方法
2．2．1细菌的分离与初步鉴定: 将土壤系列稀释, 把10-3、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上, 27℃倒置培养2天, 将长出的菌落接入斜面。
将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天, 用碘液染色, 记录透明圈大小和菌落直径, 计算D/d值。
保菌供下次实验用。
2．2．2紫外线诱变育种: 取活化后的菌种配成菌悬液、稀释; 倒淀粉培养基平板, 将菌悬液涂布其表面; 用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min, 每个处理2次重复; 放到黑暗中倒置培养, 37℃培养48h, 分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数, 并计算致死率; 加入碘液, 分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径, 计算D/d值; 将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
2．2．3生产菌株摇瓶发酵条件的优化
2．2．3．1培养基初始pH值和装液量对产酶的影响: 用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基pH值, 使培养基的pH值为5.0、7.0、9.0, 分装至250mL三角瓶中, 每瓶25mL, 灭菌, 冷却后编号1、2、3, 再接种, 37℃下恒温摇床培养48h( 摇瓶装液量分别30％、40％、50％) , 最后测定发酵液酶活。
2.2.
3.2培养基碳源对产酶的影响: 在不含可溶性淀粉的培养基中, 分别加入0.5％的各种碳源( 可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖) , 以硝
酸铵作为唯一氮源, 进行碳源对产酶的影响的发酵试验。
2.2.
3.3正交试验设计: 经过三因素两水平的正交试验对高产菌的发酵条件进行优化, 建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。
2．2．4淀粉酶的初步提纯及酶活性的测定
2.2.4.1淀粉酶的初步提纯: 收集发酵液, 3000r /min 离心10min, 去除菌体, 在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵, 待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h, 然后5000r /min 离心20min, 得到初步纯化的淀粉酶。
2.2.4.2标准曲线的制作和酶活性的测定: 将可溶性淀粉稀释成0.2％、 0.5％、 1％、 1.5％和2％的稀释液, 按下表进行标准曲线的制作和酶活性的测定。
管号
1
2
3
4
5
6 7．1 7．2 7．3 7．4
淀粉稀释液/mL 2( 0％) 2( 0.2％)
2( 0.5％)
2( 1％)
2( 1.5％)
2( 2％) 2( 2％) 2( 2％) 2( 2％) 2( 2％)
缓冲液/mL
1
1 1 1 1 1 1 1 1 1
40℃水浴保温5min
蒸馏水/mL 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 粗酶液/mL
1
1
1
1
40℃水浴保温30min, 然后加入0.5mol /L 乙酸10mL, 混均吸取反应液1mL
碘液/mL
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 A 660( 平均值)
( 7．1、7．2、7．3、7．4中加入的粗酶液, 即为正交试验设计中处理一、处理二、处理三、处理四所得的淀粉酶液)
注: ①前6组的数据用于标准曲线的制作: 以淀粉浓度为横坐标, 吸亮度为纵坐标, 作标准曲线; ②后4组的数据用于酶活性的测定: 测得吸亮度后, 可从标准曲线中查出相应的淀粉浓度, 求出被消耗的淀粉量, 这里的酶活即为每毫升粗酶液于40℃, PH6.0的条件下, 每小时液化可溶性淀粉的毫克数【mg可溶性淀粉/mL·h】。
3、结果与分析
3.1菌落的形态特征
菌落在以淀粉为唯一碳源的分离培养基中生长, 培养48h形成白色圆形菌落, 菌落背面乳白色, 边缘不光滑, 形态规则, 质地较密, 有透明圈, 无沉淀。
3.2计算D/d值
3．2．1分离筛选时, 大部分菌落水解圈都粘连在一起, 无法准确测得D/d值, 只得到少部分数据:
单菌落透明圈直径/mm(D) 菌落直径/mm(d) D/d
① 4.0 3.0 1.3
②14.0 7.1 2.0
表A 透明圈直径和菌落直径及比值
分析: 无法准确测得D/d值, 可能是所采土样中产淀粉酶的细菌含量较多, 涂平板之前稀释倍数不够导致单菌落过于密集, 水解圈粘连; 也可能是实验操作不当所致。
3．2．2紫外诱变后, 得到单菌落的透明圈直径和菌落直径及比值: 单菌落透明圈直径/mm(D) 菌落直径/mm(d) D/d
① 4.8 3.0 1.6
② 6.4 5.5 1.2
③14.8 7.4 2.0
④16.0 4.9 3.3
⑤11.8 4.5 2.6
⑥9.8 4.0 2.5
⑦25.0 5.0 5.0
⑧8.8 4.0 2.2
⑨14.0 7.8 1.8
分析: 经过结果, 可看出经过紫外诱变后, 有的菌株产酶活能力有所提高, 有的减小, 筛选产酶活能力最高的菌株, 保存供后续试验使用。
我们挑⑦号菌, 将其保存到斜面培养基上供后续试验使用。
3.3计算菌株紫外诱变的致死率
对菌株分别用紫外线处理, 得到下表:
由此数据, 可作出紫外线诱变的致死曲线
96.7％, 进一步提高照射
时间, 则致死率随之上升, 当照射10min时, 致死率为100％。
一般认为, 进行紫外诱变时, 致死率为95％左右时突变效果最好。
因此, 紫外线诱变的最适剂量为6min。
3.4菌株发酵条件的优化
3．4．1培养基初始pH值和装液量对产酶的影响:
分析: 未得到数据的原因有三点: ①操作不当, 可能是取液过程中加错体积, 也可能是将试管序号弄混了; ②将发酵液从摇床取出的过程中有少量溢出, 导致浓度降低, 影响实验结果; ③发酵过程中有杂菌产生, 发酵液被污染了。
3．4．2培养基碳源对产酶的影响:
分析: 由上表数据可知, 培养基的碳源为葡萄糖时酶活性最大。
从而得出结论: 三种碳源中最佳碳源是葡萄糖。
3．4．3标准曲线的制作:。