小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定

小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定作者：田蓉，李巍，于继云，刘玉峰【关键词】树突细胞In vitro culture and characterization of mouse spleen dendritic cells【Abstract】AIM: To explore and optimize the methods for in vitro culture of mouse dendritic cells (DC) that were then observed morphologically and identified biologically. METHODS: Mice were injected with 200 mg/kg cyclophosphamide through the tail vein, and were sacrificed 8 d later. Spleen cells were cultured with ordinary methods firstly, and 3 d later conditional medium containing IL4, GMCSF was added, and TNFα was added at day 5. At day 8, cells were subjected to phasecontrast microscope, scanning electron microscope, and transmission electron microscope analysis. At day 3, 5, 7, cells were subjected to FACS for detection of cell surface markers. RESULTS: Cultured cells displayed a typical DC phenotype in morphological analysis, and FACS showed these cells expressing such DC markers as CD11c, CD86,ⅠAb, H2D6. CONCLUSION: Using of IL4, GMCSF, TNFαas stimulators in the mouse spleen cell culture can obtain DC with high quality and high purity, which makes a foundation for future research on the basic and clinical usage of DC.【Keywords】dendritic cells; cytokines; MHCⅡmolecule【摘要】目的：探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞（DC）的方法，并进行形态学观察和生物学鉴定. 方法：应用环磷酰胺200 mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠，8 d 后处死小鼠，常规培养脾细胞，第3日加入含有IL4, GMCSF细胞因子的条件培养液，第5日补加TNFα,第8日制备标本进行相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，并分别在培养第3, 5, 7日经流式细胞仪检测成熟细胞表面标志. 结果：刺激培养细胞经相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，具有典型的DC形态，流式细胞仪检测发现细胞表面表达CD11c, CD86, ⅠAb, H2D6标志物. 结论：在小鼠脾脏细胞培养中加入IL4, GMCSF, TNFα等刺激，可获得足量、较高纯度的DC，为DC的基础研究与临床应用奠定了基础.【关键词】树突细胞；细胞因子；MHCⅡ类分子0引言自从Steinman等于1973年发现树突状细胞（dentritic cell, DC）以来［1］，DC作为体内最重要的抗原提呈细胞，其强大的提呈抗原作用和启动初始T细胞的能力，日益引起国内外学者的关注. 特别是DC与肿瘤免疫的密切关系以及在抗肿瘤方面的独特功能，使其成为肿瘤免疫研究的一个重要领域. DC来源于骨髓CD34+细胞［2］，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键，然而DC在体内分布散在，含量极低，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%. 目前体外培养DC的方法尚不尽人意，在很大程度上限制了对DC基础和临床工作的开展. 我们在体外培养扩增了Balb/c小鼠的DC细胞，在培养中添加IL4, GMCSF, TNF等刺激，并通过相差显微镜、电镜观察和流式细胞仪检测分析对所培养细胞进行鉴定，为优化DC的体外培养方法进行积极的探索.1材料和方法1.1材料环磷酰胺购自上海华联公司；荧光标记抗体：CD11cFITC, IAbFITC, H2DbFITC, CD86FITC购自Diaclone公司；rmGMCSF, rmIL4, TNFγ，胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶购自美国GIBCOL公司；Hepes，青霉素，链霉素购自美国Sigma公司；倒置相差显微镜为日本Olympus公司生产，低速离心机为北京医用离心机厂生产，微量台式高速离心机为德国Heraeus公司生产，流式细胞仪为Coulter公司生产，扫描电镜、透射电镜由美国BD公司生产；6~8 wk龄雄性Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心.1.2方法1.2.1DC细胞的分离与培养将环磷酰胺按200 mg/kg体质量由小鼠尾静脉注射，8 d后颈椎脱位处死小鼠，750 mL/L乙醇浸泡10 min，无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100钼钢网上，剔除脾周围的结缔组织，剪碎、研磨后收集滤过的细胞悬液，离心800 r/min, 7 min，加TrisNH4Cl 3 mL，溶除红细胞，获取细胞悬液，以完全培养基悬浮为1×109 /L细胞，37℃，50mL/L CO2孵箱培养. 3 d后，吸弃全部培养基及悬浮细胞，加rmGMCSF/rmIL4条件培养基隔日半量换液，第5 d补加细胞因子TNFγ 1 mg/L，第7 d吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，次日收集悬浮的细胞即为富集的DC. 相差显微镜下观察细胞形态特点.1.2.2扫描电镜观察取如上培养7 d的细胞悬液，接种放置在培养皿中的盖玻片上，37℃，50 mL/L CO2孵箱培养. 待细胞汇合，取出盖片，浸入PBS漂洗细胞表面；将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4℃预冷的40 mL/L戊二醛，在4℃固定2 h，吸出固定剂，PBS浸洗2次，每次10 min，再用4℃预冷的10 g/L锇酸固定，在4℃固定1 h，然后用PBS浸洗2次，每次10 min；用系列梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，扫描电镜观察细胞表面结构.1.2.3透射电镜观察取如上培养7 d的细胞悬液，PBS洗涤，细胞沉淀用40 mL/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，包埋，经超薄切片铅铀染色后透射电镜观察细胞超微结构.1.2.4细胞表面标记FACS分析分别收集培养第3, 5, 7 d的细胞，离心800 r/min, 7 min，弃上清，用含20 mL/L牛血清的PBS洗液1 mL洗涤2次，分别加终浓度为5 mg/L的标记抗体1 μL（CD11cFITC, IAbFITC, H2DbFITC, CD86FITC）. 设阴性对照组. 4℃轻度震荡30 min；再用PBS 1 mL洗液洗涤2次；间标抗体再加入FITC标记羊抗鼠lgG, 100 μL/管，终浓度为5 mg/L，4℃避光轻度震荡30 min，PBS 1 mL洗液洗涤2次，加10 g/L多聚甲醛400 μL固定，上流式细胞仪检测.2结果2.1DC的分离与培养经尾静脉注射环磷酰胺的小鼠，饲养8 d后，脾脏明显增大，为正常小鼠脾脏体积的3倍左右，脾细胞数平均7.5×107/只. 镜下观察细胞体积较大、均匀、圆形，加入GMCSF 20 μg/L, IL4 1 μg/L体外培养3 d后，增殖出大量悬浮的粒细胞及疏松黏附于贴壁单核细胞上的增殖性细胞集落. 第8日收集已脱落的及疏松黏附的细胞集落，即为富集DC.2.2相差显微镜观察培养7 d的DC，相差显微镜下可见较大体积的悬浮细胞，具多形性，贴壁时有细长突起，“呈树突状”，悬浮时向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，呈“刺猬状”，部分伸展为不规则状（图1）.图1培养DC的相差显微镜观察×100（略）2.3扫描电镜观察培养7 d的DC，扫描电镜下可见细胞伸展出大量大小不一、扁平的胞质突起，末端圆钝，细胞膜光滑无皱折（图2A）.2.4透射电镜观察培养7 d的DC，透射电镜DC胞体周围可见不规则突起和褶皱；胞核染色深，偏向一侧，形状不规则，多为分叶状；胞质线粒体较为丰富，较多吞饮大泡及小泡，高尔基体、溶酶体少. 所培养细胞具有典型的DC形态特征（图2B）.A：扫描电镜；B：透射电镜.图2培养DC的电镜观察×1000（略）2.5细胞表面标志FACS鉴定应用流式细胞仪分析体外培养第3, 5, 7日，及补加细胞因子TNFγ后第7 d的DC表面标志显示：N418（CD11c）细胞比例分别为16.22%, 13.54%, 34.37%, 78.16%; MHCII（Iab）细胞比例分别为28.80%, 21.88%, 25.85%, 58.45%; MHCI类（H2Db）细胞比例分别为4.82%, 2.46%, 11.94%, 24.635; B72（CD86）细胞比例分别为77.89%, 59%, 75.71%, 80.59%; 随着细胞成熟，MHCI类分子、MHCII类分子、共刺激分子的表达逐渐增高，加入TNFγ后，所测DC各表面标记均有较明显的增高，显示出TNFγ在DC的成熟分化中的突出作用. 流式细胞仪分析细胞表型结果证实所培养的细胞为淋巴系DC.3讨论DC在组织中分布广，但含量极少，因此建立成熟的DC体外培养技术获得足够数量的有功能的DC就显得非常重要［3］. 1992年，Steinman实验室首先建立了用GMCSF从小鼠骨髓中大规模培养制备DC的方法，目前，小鼠DC的来源仍主要采用这种方法. 但新近研究表明［4］，如果应用亚致死量化疗或放疗药物处理小鼠，使DC前体细胞重新定位于脾脏，在特定的造血环境下扩增，再取出以GMCSF或GMCSF+IL4培养，就能扩增出大量DC，且具有产量大、纯度高、稳定性高、操作简便等特点. 在上述工作基础上，本实验予高剂量（200 mg/kg体质量）环磷酰胺经尾静脉注射小鼠，8 d后可见小鼠脾脏显著增大，此脾细胞经GMCSF （20 μg/L）+ IL4（μg/L）培养，第5日补加细胞因子TNFγ，第8日，获得了大量淋巴系DC，每只小鼠平均可得7.5×107细胞数，较文献报道细胞数高. 将培养细胞悬液在相差显微镜及电镜下观察，发现所培养细胞具有典型的DC形态特征，均明显有别于单核细胞和巨噬细胞［5］.DC的发育、成熟与其在体内的迁徙过程和细胞表面标记的变化之间的复杂关系，是其重要的生物学特点［6］. DC并不是一个均一的群体，但所有的DC均来源于骨髓干细胞，不论是组织DC还是培养DC，不论是人DC还是小鼠DC，均可区分为非成熟和成熟两个阶段［7］. 非成熟DC主要位于易与外来抗原接触的外周器官，细胞表面较高表达与吸收和加工抗原有关的分子，如CD1A，CCR6；而当DC细胞完成抗原加工功能，向次级淋巴器官迁徙的过程中，那些影响DC细胞迁徙、提呈抗原、激活T细胞的趋化因子、黏附分子、MHCI 类分子、MHCII类分子及共刺激分子，包括CD1, CD4, CD33, CD40, Iab, H2Db, CD80 （B71），CD86（B72）等的表达逐渐增加，最终，DC转变成为能够专职递呈抗原、发挥免疫功能的成熟DC［8-9］. 我们分别收集所培养第3, 5, 7日及补加细胞因子TNFγ后第7日的DC，应用流式细胞仪分析细胞的表型，结果显示所培养的DC已表达了主要表面标记，并随时间变化总体呈现上升趋势，在培养第5日有所降低，但到第7日时，均明显升高，由于所测表面分子均为成熟DC主要的标记，所以表型的变化规律基本符合DC的成熟过程. 培养DC表面这些分子的升高或较高比例的表达，表明其已成为有可能发挥功能的抗原递呈细胞.另外，我们注意到，在培养第5日补加细胞因子TNFγ后，DC表面的标记分子明显上升，这进一步证实了TNFγ在DC发育、成熟中的作用. 可能的机制为：TNF作为第一信号，可上调并维持干细胞的GMCSFR，抑制干细胞朝粒系转化；上调的GMCSFR在接受GMCSF 的刺激后，进一步朝DC方向发展. 实验结果中有些标记分子的表达比预期的以及理论上的表达量低，可能是由于体外培养DC的各种环境和条件与体内还存在着不同以及操作上的某些差异造成的，但结合细胞形态及表面标志物整体分析，本实验已培养出了具备典型成熟DC特征的细胞，为进一步探讨DC体外对T淋巴细胞的激活作用及抗瘤作用奠定了基础.【参考文献】［1］Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in perpheral lymphoid organs of mice I. Morphology, quantitation, tissue distribution ［J］. J Exp Med, 1973,137(5):1142-1162.［2］Kleindienst P, Brocker T. Endogenous dendritic cells are required for amplification of T cell responses induced by dendritic cell vaccines in vivo ［J］. J Immunol, 2003,170(6):2817-2823.［3］Crespo I, Paiva A. Immunophenotypic and functional characterization of cord blood dendritic cells ［J］. Stem Cells Dev, 2004,13(1):63-70.［4］Pospisilova D, Borovickova J. Methods of dendritic cell preparation for acute lymphoblastic leukemia immunotherapy in children ［J］. Med Oncol, 2005,22(1):79-88.［5］Sandell MH. Dadabayey AR. Prognostic value of tumorinfiltrating dendritic cells in colorectal cancer: Role of maturation status and intratumoral localization ［J］. Clin Cancer Res, 2005,11(7):2576-2582.［6］Andersson BU, Tani E. Prognostic value of tumorinfiltrating dendritic cells in colorectal cancer: Role of maturation status and intratumoral localization ［J］. Clin Cancer Res, 2005,11(7):2576-2582.［7］Hamada I, Kato M. Clinical effects of tumorassociated macrophages and dendriticcells on renal cell carcinoma ［J］. Anticancer Res, 2002,22(6C):4281-4284.［8］Hajek R, Butch AW. Dendritic cell biology and the application of dendritic cells to immunotherapy of mμLtiple myeloma ［J］. Med Oncol, 2000,17(1):2-15.［9］Avigan D. Fusions of breast cancer and dendritic cells as a novel cancer vaccine ［J］. Clin Breast Cancer, 2003, 3 （Suppl 4）: S158-S163.。