真核细胞常见表达载体复习过程
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
2021届高考生物一轮复习知识点专题25 基因的表达【含解析】
2021届高考生物一轮复习知识点专题25 基因的表达一、基础知识必备（一）遗传信息的转录和翻译1、遗传信息的转录（1）概念在细胞核中,以DNA的一条链为模板合成RNA的过程。
（2）过程DNA解旋→原料与DNA碱基互补并通过氢键结合→RNA新链的延伸→合成的RNA从DNA链上释放→DNA复旋。
2、遗传信息的翻译（1）概念游离在细胞质中的各种氨基酸,以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。
（2）过程①mRNA进入细胞质与核糖体结合后,携带甲硫氨酸的tRNA通过与碱基AUG互补配对,进入位点1。
②携带另一个氨基酸的tRNA以同样的方式进入位点2。
③甲硫氨酸通过与位点2上的氨基酸形成肽键而转移到占据位点2的tRNA上。
④核糖体读取下一个密码子,原占据位点1的tRNA离开核糖体,核糖体移动,使占据位点2的tRNA进入位点1,一个新的携带氨基酸的tRNA进入位点2,继续肽链的合成。
⑤重复步骤2、3、4,直至核糖体读取到mRNA的终止密码子,翻译才终止。
（二）染色体、基因、DNA和脱氧核苷酸相互之间的关系1.四者关系图2、四者关系分析关系内容基因的基本组成单位是脱氧核苷酸,每个基因含有成百上千个脱氧核苷酸,这些脱基因与脱氧核苷酸氧核苷酸的排列顺序称为遗传信息基因与DNA 基因是具有遗传效应的DNA片段,每个DNA分子上有很多个基因基因与染色体基因在染色体上呈线性排列,染色体是基因的主要载体基因与生物性状基因是遗传物质结构和功能的基本单位,特定的基因控制相应的性状染色体主要由DNA和蛋白质构成。
通常情况下一条染色体上含有1个DNA分子, DNA与染色体染色体是DNA的主要载体四者之间数量关系1条染色体→1个或2个DNA分子→许多个基因→成百上千个脱氧核苷酸四者之间层次关系脱氧核苷酸→基因→DNA分子→染色体（三）基因的功能1、基因的功能:通过复制传递遗传信息;通过控制蛋白质的合成表达遗传信息。
2.中心法则(1)提出者:克里克。
hTRT基因荧光表达载体在真核细胞中的表达
ｐ ｒ ｅ ｔ ｆＯ ａ Ｍｅ ｉ ｎ ， ｉｔ Ｐ ｏ ｌ Ｓ ｏ ｉ ｌ Ｓ ｈ ｏ ｏ ｏ ａｏ ｇ ， ｈ ｎ ｈ ｉ ｉｏ Ｔ ｎ ｎｖ￣ ＠ Ｓｈ ｏ ｄ ｉｅ Ｓ ａ ｇ ａ ａ ｔ ｎ ｏ ｒｌ ｄｃ ｅ Ｎ ｎｈ ｅ ｅ ｓ ｔ ， ｃ ｏ ｌ Ｓ ｍ ｔｌ ｙ Ｓ ａ ｇ ａ ａ ｏ ｇ Ｕ ｉ ｉ ｃ ｏｌ Ｍｅ ｉ ｎ ； ｈ ｎ ｈ ｉ ｍ ｉ ｐ Ｈ ｐａ ｔ ｆ ｏ Ｊ ｅ ｆ ｏ ｃ
ａ ｍｐｏ ｔ ｎ ｏ ｅ ｆ ｒ ｅ ｔ ｎｓ ｏ ｉｅ —ｓ ａ ｆ ｎ ｒ ａ ｕｍａ ｅ ｌ ． ｎｉ ｒａ ｔ ｒ ｌ ｏ ｘ ｅ ｉ ｎ ｌｆ ｐ ｎ ｏ ｏ ｍ ｌｈ ｎ ｃ ｌｓ Ｋ ｅ ｏ ｄｓ ｈ ｙ ｗ ｒ ＴＲＴ ；Ｔｒ ｎ ｇ ｎ ｃ ｐ ａ ｍｉ ａ ｓ ｅ ｉ ｌ ｓ ｄ；ＧＦ ；Ｌｉ ｓ ｍｅ Ｐ ｐｏ ｏ
６ ８ ％ 。结 论 ．８
的意 义 。
质 粒 在 ２ ３细 胞 及 人 ９
正 常 口腔 黏 膜 细 胞 中 正 确 表 达 ， 源性 端粒 酶 在 细胞 中 表 达 。２ ３细胞 及 人 正 常 口 腔 黏 膜 角 化 细 胞 转 染 效 率 分 别 为 ３ ． ４ 和 外 ９ ４ ７％ ｈＲ Ｔ Ｔ基 因荧 光 表 达 载 体 在 真核 细胞 中 表 达 ， 于 观 察 转 染 情 况 ， 研 究 组 织 工 程 种 子 细 胞 的 衰 老 问题 具 有 重 要 便 对
关 键 词 端 粒 酶 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因 转 染 质 粒
Ｅ ｐｅｓｏ ｆＲ ｃ ｍｂｎ ｎ Ｔ Ｔ Ｐａｍｉ ｎＥ ｋ ｒｏｉ Ｃ ｌ． Ｚｈ ｕ Ｈａｗ ｎ，Ｙ ｎ ｎｕ ｘ ｒｓ ｎｏ ｅｏ ｉａ ｔ Ｒ ｌｓ ｄｉ ｕ ａ ｙ ｔ ｅｌ ｉ ｈ ｃ ｓ ｏ ｉｅ ａ ｇ Ｗｅｊ ｎ，Ｌｕ Ｄｅｉ ｉ ｉ Ｚ ｏ ｅ ｇｏ ｇ ｉ ｌ，Ｌｕｗｅ， ｈ ｕ Ｚ ｎ ｔｎ ．Ｄｅ —
真核表达载体
真核细胞常见表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
分子生物学复习题 第八章重组DNA技术
第八章重组DNA技术一、选择单选1、下列哪项不属于生物工程？A. PCR技术B.重组DNA技术C.蛋白质工程D.酶工程E.细胞工程2、重组DNA技术中所用的限制酶是哪类？A.Ⅰ型限制酶B.Ⅱ型限制酶C.Ⅲ型限制酶D.Ⅳ型限制酶E.Ⅴ型限制酶3、可以利用蓝白筛选法筛选用pUC转化的重组DNA克隆，是因为pUC包含以下哪种元件？A.复制起点B. amp RC.acZ'D.多克隆位点MCSE.调节基因lacI4、关于λ噬菌体，以下叙述错误的是A.基因组DNA的部分序列并非溶原性生长所必需B.基因组DNA感染大肠杆菌后形成闭环结构C.在溶原性生长时进行滚环复制D.复制时形成多联体结构E.其转化的细菌经过培养形成噬菌斑5、pBR322质粒包含两个抗性基因：氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，据此可以利用哪种方法筛选重组DNA克隆？A.α互补B. PCRC.插入失活D.核酸分子杂交E.蓝白筛选6、制备重组DNA首先要制备目的DNA，要保证目的DNA的量和纯度能满足重组要求。
常用的制备方法不包括A.PCR扩增B.从组织细胞分离基因组DNAC.化学合成D.逆转录合成cDNAE.限制酶截取7、第一种应用于临床的重组蛋白是A.基因工程疫苗B.基因工程抗体C.激素D. 生长因子E.细胞因子8、在重组DNA技术中，目的DNA与载体在体外连接的过程称为DNA的体外重组。
体外重组的方法不包括：A.加人工接头连接B.加同聚物尾连接C.互补黏端连接D.连接E.平移连接9、重组DNA的宿主细胞有原核细胞和真核细胞。
用于制备基因文库的宿主细胞主要是A.哺乳动物细胞B.大肠杆菌C.酵母D.枯草杆菌E.昆虫细胞10、哪种方法要求宿主细胞必须是感受态细胞？A.CaCl2法B.病毒感染法C.脂质体载体法D.显微注射法E.穿刺法11、蓝白筛选属于筛选重组DNA克隆方法的哪种？A.PCR分析B.插入失活分析C.核酸分子杂交分析D.酶切分析E.免疫分析12、重组DNA技术领域常用的质粒DNA是A. T病毒基因组DNA的一部分B. 细菌染色体外的独立遗传单位C. 细菌染色体DNA的一部分D. 真核细胞染色体外的独立遗传单位E. 真核细胞染色体DNA的一部分13、某限制性内切核酸酶切割5’…GGGGGG▼AATTCC…3’序列后产生A. 5’突出末端B. 5’或3’突出末端C. 5’及3’突出末端D. 3’突出末端E. 平末端14、“克隆”某一目的DNA的过程不包括A. 重组DNA分子导人受体细胞B. 外源基因与载体的拼接C. 基因载体的选择与构建D. 筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞E. 表达目的基因编码的蛋白质15、关于基因文库及其构建，以下叙述错误的是A.基因文库包括基因组文库和cDNA文库B.构建基因组文库常用的克隆载体是λ噬菌体、粘粒和酵母人工染色体系统C.目前构建的cDNA文库可以包含一种生物基因组所含的全部编码序列D.真核生物cDNA文库中的目的基因可以在原核细胞内表达活性产物E.构建cDNA文库要用到逆转录酶多选：1、用目的DNA和质粒制备重组DNA，下列哪些工具酶是必需的？A.DNA聚合酶B.核酸酶C.连接酶D.限制酶E.修饰酶2、影响限制酶切割效率的因素有那些？A.底物纯度B.底物甲基化程度C.底物结构D.反应温度E.反应体系组成3、哪些因素会降低限制酶的特异性?A.高浓度限制酶B.高浓度甘油C.低离子强度D.用Mn2+取代Mg2+E.高pH值4、限制酶的应用非常广泛，包括:A.DNA重组B.质粒改造C. DNA杂交D.探针制备E.基因定位5、关于重组DNA技术使用的DNA 连接酶A.用以将目的DNA与载体共价连接成重组DNAB.包括大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶C.大肠杆菌DNA连接酶需要NAD，而T4 DNA连接酶需要ATPD.大肠杆菌DNA连接酶用于连接切口或互补黏端E.T4 DNA连接酶用于连接互补黏端或平端6、重组DNA技术常用的DNA聚合酶有A.DNA聚合酶ⅠB. Klenow片段C. Taq DNA聚合酶D. 逆转录酶E. T4 DNA聚合酶7、载体分为克隆载体和表达载体两类。
蛋白真核表达流程
蛋白真核表达流程
蛋白真核表达的流程包括以下步骤：
1. 克隆DNA：通过PCR等方法扩增感兴趣的基因，并将其植入真核表达载体中。
2. 转化真核细胞：将目标基因的真核表达载体转染到真核细胞中，可以使用病毒载体、电穿孔等方法。
3. 表达蛋白质：使用适当的诱导剂或激励剂（如药物）启动目标基因的转录和翻译过程，使真核细胞产生目标蛋白质。
4. 收集细胞：收集经过表达的真核细胞，可以通过离心沉淀的方式将细胞分离出来。
5. 裂解细胞：使用适当的裂解液或破壁方法将细胞裂解，释放出目标蛋白质。
6. 纯化蛋白质：根据目标蛋白质的性质进行样本处理，然后进行亲和纯化，获取目的蛋白质。
7. 检测蛋白质：使用各种检测方法（如Western blot、ELISA等）对目的
蛋白质进行检测和鉴定。
8. 表达条件优化：根据实验结果，对表达条件进行优化，提高目的蛋白质的表达量和纯度。
9. 应用研究：将纯化的目的蛋白质用于后续的应用研究，如功能研究、药物筛选等。
以上步骤仅为大致流程，具体的实验操作和技术方法可能因实验需求、目的蛋白质的性质等因素而有所不同。
《基础分子生物学》复习题及参考答案要点
《基础分子生物学》复习题及参考答案要点《基础分子生物学》复习题及参考答案一、填空题1.核酸分子中糖环与碱基之间为β型的糖苷键，核苷与核苷之间通过磷酸二酯键连接成多聚体。
2.DNA变性后，紫外吸收增加，粘度下降，浮力密度升高，生物活性丧失。
3.DNA双螺旋直径为 2 nm，每隔 3.4nm上升一圈，相当于10个碱基对。
4.Z-DNA为左手螺旋。
5.hn-RNA是真核生物mRNA的前体。
6.用Sanger的链末端终止法测定DNA一级结构时，链终止剂是双脱氧核苷三磷酸。
7.维系DNA双螺旋结构稳定的力主要有氢键和碱基堆积力。
8.在碱性条件下，核糖核酸比脱氧核糖核酸更容易降解，其原因是因为核糖核酸的每个核苷酸上-OH 的缘故。
9.DNA复制时，连续合成的链称为前导链；不连续合成的链称为随从链。
10.DNA合成的原料是四种脱氧核糖核苷三磷酸；复制中所需要的引物是RNA 。
11.DNA合成时，先由引物酶合成RNA引物，再由DNA聚合酶Ⅲ在其3′端合成DNA链，然后由 DNA聚合酶Ⅰ切除引物并填补空隙，最后由 DNA连接酶连接成完整的链。
12.细菌的DNA连接酶以NAD为能量来源，动物细胞和T4噬菌体的DNA连接酶以A TP为能源。
13.大肠杆菌RNA聚合酶的全酶由α2ββ′σ组成，其核心酶的组成为α2ββ′。
14.RNA转录过程中识别转录启动子的是σ因子，协助识别转录终止部位的是ρ因子。
15.真核细胞mRNA合成后的成熟过程包括戴帽、加尾、剪接、甲基化修饰。
16.遗传信息由RNA传递到 DNA 的过程称为逆转录，由逆转录酶催化。
17.反密码子第 1 位碱基和密码子第 3 碱基的配对允许有一定的摆动，称为变偶性。
18.在原核细胞翻译起始时，小亚基16SrRNA的3′端与mRNA5′端的 SD序列之间互补配对，确定读码框架，fMet-tRNA f占据核糖体的 P 位点位置。
19.细胞内多肽链合成的方向是从 N 端到 C 端，而阅读mRNA的方向是从5′端到3′端。
真核细胞常见表达载体
真核细胞罕睹表黑载体之阳早格格创做真核细胞, 表黑载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特性:该真核细胞表黑载体分子量为6600碱基对于，主要由CMVp开用子、兔β-球蛋黑基果内含子、散腺嘌呤、氨青霉素抗性基果战抗neo基果以及pBR322骨架形成，正在大普遍真核细胞内皆能下火稳牢固天表黑中源手段基果.更要害的是，由于该真核细胞表黑载体中抗neo基果存留，转染细胞后，用G418筛选，可修坐宁静的、下表黑手段基果的细胞株.拔出中源基果的克隆位面包罗Sal1、BamH1战EcoR1位面.注意正在此载体中有二个EcoR1位面存留.2、pEGFP, 巩固型绦色荧光蛋黑表黑载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特性: pEGFP表黑载体中含有绿色荧光蛋黑，正在PCMV 开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: 该表黑载体EGFP上游有Nde1、Eco47111战Age1克隆位面，将中源基果扦进那些位面，将合成中源基果战EGFP的混合基果. 借此可决定中源基果正在细胞内的表黑战/或者构造中的定位.亦可用于检测克隆的开用子活性(与代CMV开用子,Acet1-Nhe1).3、pEGFT-Actin, 巩固型绿色荧光蛋黑/人肌动蛋黑表黑载体特性:pEGFP-Actin表黑载体中含有绿色荧光蛋黑战人胞浆β-肌动蛋黑基果，正在PCMV开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: pEGFP-Actin载体正在真核细胞表黑EGFP-Actin混合蛋黑，该蛋黑能调整到胞内正正在死的肌动蛋黑，果而正在活细胞战牢固细胞中瞅察到细胞内含肌动蛋黑的亚细胞结构.4、pSV2表黑载体特性：该表黑量粒是以病责SV40开用子启动正在真核细胞手段基果举止表黑的，克隆位面为Hind111.SV40开用子具备构造/细胞的采用特同性.此载体没有含neo基果，故没有克没有及用去筛选、修坐宁静的表黑细胞株.5、CMV4 表黑载体特性:该真核细胞表黑载体由CMV开用子启动，多克隆天区酶切位面采用性较多.含有氨苄青霉素抗性基果战死少基果片段以及SV40复造本面战fl单链复造本面.但是值得注意的是，该表黑载体没有含有neo基果，转染細胞后没有克没有及用G418筛选宁静的表黑细胞株. 其余时常使用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ugpUC18 DNA 25 ugpUC19 DNA 25 ug证明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体符合于DNA片段的克隆、DNA测序战对于中源基果举止表黑等.那些载体由于正在lacZ基果中含有多克隆位面，当中源DNA片段扦进，转移lacZ基果缺累细胞，并正在含有IPTG战X-gal的培植基上培植时，含有中源DNA载体的细胞将为红色菌降，而无中源DNA片段载体的细胞则为兰色菌降，由此易于筛选有无中源DNA片段的载体.别的，那些载体中有便于测序的M13、T7战T3的通用引物举止DNA测序. 保存液: TE BufferTE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA用途: 克隆中源DNA片断. 举止基果表黑. 使用M13、T7战T3引物举止测序. 存留的问题细胞的死命活动是一个搀纯的调控历程，有些死命活动的机理还没有真足浑晰，由于插人的手段基果分歧，载体构修栗用的逆式组件分歧，组拆的空间位子分歧，采与的表黑系统分歧，手段基果表黑火仄易阳性克隆筛选率皆市有很大好别.其余，由于所有的逆式元件存留种属战构造特同性，所构修的下效表黑载体纷歧定正在所有细胞株中均下效表黑.再者，细胞死少状态的好别，转染要领的分歧培植时阉的少短，筛选药物浓度的下矮，对于表黑量皆有很大效率.所以，需要概括评介一个表黑载体战表黑系统，排除一些没有定果素，筛选出最好拉拢真核表黑载体趋背于既有好处扩删手段基果又有好处筛选阳性克隆的载体的构修.许多灵验的应用范畴广的强开用子战巩固子被人创造并应用于载体中，大大普及了手段基果的表黑量，其余一些强的组成型开用子，如SV40早期开用子+PHTLv，已应用于大规模死产的细胞系中. 应用以GS为筛选标记的表黑载体可兼有筛选战扩删手段基果二种功能，是暂时钻研的沉面.以IRES连交的单逆反子表黑载体已成为核表黑载体的主体.正在共一开用子把持下，筛选基果或者报告基果与手段基果转录正在共一mRNA上通过IRES的效率，表黑出二种蛋黑，果而正在表面上可认为，通过了筛选或者表黑了报告基果的克隆必为阳性克隆，即表黑手段基果的克隆，有报导道那种单逆反子的共表黑率为90％.那便大大普及了筛选率，简化了真验历程. 将强开用子、巩固子战可扩删的筛选标记组拆正在共一载体上，构修下效表黑战筛选的表黑载体并将其使用于最符合的表黑系统中，是现正在真核表黑载体构修钻研死少目标.。
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
7第七章：真核生物的克隆载体
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择 哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微 克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
7.1.6
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学
研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌
基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒
和自主复制型质粒两大类。
在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
重组体，可以在生物反应器中长时间地生长。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母 菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一 些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从 酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是， 在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行 测序，以判断重组体是否已经正确构建。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色 体DNA复制的起始位置。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染 色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一 起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几 百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他 质粒载体携带的更大的DNA分子。
YAC载体的结构和用途
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母
基因的真核表达技术路线流程
目的序列的获得
重组载体的构建(酶切、连接) 转移至宿主细胞(转化)
目的序列的检测(整合、表达)
生物材料
化学合成、PCR、cDNA、鸟枪法
目的基因的分离
克隆载体
酶切、连接
重组的克隆载体
转化
受体细胞（大肠杆菌）
筛选
表达载体
克隆子
DNA重组
胚胎干细胞法、逆转录病毒介导、显微注射等
2载体的构建？
2构建重组农杆菌 3转化 4筛选 5再生
2载体的构建
构建好的植物表达载体
6检测
DNA水平的检测（看是 否整合到宿主基因组中）
蛋白质水平的检测 （ 看目的产物是否表 达及活性如何）
PCR检测结果
PCR：初步检测目的基因是否整合到植物基因组当中。
Southern Blot检测结果
重组的表达载体
转化、筛选
体外培养的动物细 胞
受精卵
大肠杆菌 三亲交配等 大肠杆菌（原核表达）
基因枪、PEG介导、花粉管通 道等
基 因 工 程
筛选
农杆菌
农杆菌介导
药物分离纯化
植物细胞（愈伤、叶盘、原生 质体等）
发育成为个体（水生 动物）
代孕母体子宫中胚胎 发育（克隆）
筛选、分化、再生、鉴定
疫苗、抗体……
讨论
摘要
材料与方法
•实验材料 •实验方法
克隆载体
表达载体
实 验 材 料
pBlue script SK克隆载体图谱
pBI121表达载体图谱
E.Coli复制 起始位点 右边界
新霉素抗 性基因 CaMV35S 启动子 GusA基因
左边界
分子生物学：真核生物表达系统
人延长因子1基因 人巨细胞病毒立早基因 劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因 猿猴病毒40早期基因 腺病毒主要晚期启动子 小鼠β－珠蛋白基因
40～160 4 2 1.1 1 0.4 0.2
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（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所 有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结 构，多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化 位点上游11～30核苷酸的保守序列AAUAAA 和一个下游的GU或U富含区组成，
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(4)复制子：哺乳动物基因表达载体的 复制子一般采用病毒基因组的复制子， 由于某些病毒可以在哺乳动物宿主细胞 内进行自主复制。不同的病毒复制子的 工作效率不同，常用于构建哺乳动物表 达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛 乳头瘤病毒等的复制子。
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1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、表达出来的蛋白质不能有效、正 确的折叠及二硫键配对错误 3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸 化和羧化等翻译后修饰以及对原核 细胞有毒性。
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一、真核细胞表达宿主的种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较 大肠杆菌 产率 蛋白酶消化
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pCMV-HA：为Clontech公司产品， 该质粒载体含CMV启动子，在CMV 下游的内含子为晚期SV40 19S mRNA内含子及SV40 16S mRNA内 含子，在N端有血凝素(HA)表位标签 和氨基苄青霉素抗性基因选择标记。
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病毒感染 转染
化学法
物理法
microRNA 过表达载体具体步骤及说明
microRNA 过表达载体具体使用说明及步骤MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA 特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（如右图所示）。
GenePharma MicroRNA 载体利用CMV 启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha（RNase Ⅲ）作用形成small hairpin pre-miRNAs。
在使用载体法针对某一MicroRNA 进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1、实验对照组的确立在一个完善的MicroRNA 表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括载体阴性对照组、转染试剂对照组。
载体阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（microRNA），可以表达与目的基因序列无同源性的microRNA 片段；另一种是将目的microRNA 的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。
对照组的设立对于MicroRNA 表达研究是很有必要的，您可以利用载体对照来确认microRNA 实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。
2、细胞转染条件的确定使用MicroRNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
3、MicroRNA 表达的检测通常用两大类方法来检测MicroRNA 表达效率，一类方法是直接检测MicroRNA 的变化水平，常用的方法如northern 杂交、芯片（microarrays）以及核糖核酸酶保护分析，但这些传统的方法都需要用到标记探针与纯化的RNA 进行杂交，由于成熟的miRNAs 及其前体共享一段共同的靶序列，而且目前的这些方法有无法通过大小将其分开，因此很难专一识别成熟的MicroRNA，导致较高的背景信号。
细胞生物学》期末复习重点
细胞生物学》期末复习重点细胞生物学》期末复重点一、填空题1.支原体是目前发现的最小、最简单的细胞。
2.真核细胞的基本结构体系包括：生物膜结构体系、遗传信息表达体系、细胞骨架体系。
3.病毒的增殖过程简单分为三个阶段：病毒侵入细胞，病毒核酸的侵染；病毒核酸的复制、转录与蛋白质的合成；病毒的组装、成熟与释放。
4.膜脂的三种类型：磷脂、糖脂、胆固醇。
膜脂四种运动方式：侧向运动、自旋运动、尾部摆动、翻转运动；膜蛋白的三种类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白、脂锚定膜蛋白。
5.跨膜结构域是内在膜蛋白与膜脂结合的主要部位。
6.红细胞的质膜是最简单、最易研究的生物膜；膜骨架赋予它既有很好的弹性又有较高的强度。
7.介导细胞与细胞之间的锚定连接的方式有：桥粒、黏合带；介导细胞与胞外基质之间的锚定连接方式有：半桥粒、黏合斑。
8.神经冲动传导过程中，电突触可以快速实现细胞间信号通讯，化学突触则表现出动作电位在传递中的延迟现象。
9.细胞表面的黏着分子中，钙黏蛋白属于同亲型结合；选择素和整联蛋白属于异亲型结合；免疫球蛋白超家族既具同亲型结合，又具异亲型结合，且不具有Ca依赖性。
10.胶原是胞外基质最基本的结构成分。
11.胞外基质中弹性纤维、胶原纤维的共同存在，分别赋予了组织以弹性和抗张性。
12.膜转运蛋白可分为两类，其中载体蛋白既可介导被动运输又可介导逆浓度和电化学梯度的主动运输；而通道蛋白只介导被动运输。
13.植物细胞协同运输的驱动力是H+电化学梯度，动物细胞协同运输的驱动力是膜两侧的Na+电化学梯度。
14.组成型的外排途径与分泌型的外排途径的重要区别是：是否需要激素信号刺激。
15.光合作用中暗反应的典型途径是卡尔文循环；光反应中形成的ATP、NADPH这些活跃的化学能主要在还原阶段被利用，每次循环固定1个CO2分子，需3个ATP和2个NADPH。
16.溶酶体发生途径中，催化溶酶体酶磷酸化生成M-6-P的两种重要酶类分别是：N-乙酰葡萄胺磷酸转移酶、磷酸葡萄糖苷酶。
原核生物和真核生物的载体构建
本实验用内切酶将T-GFP质粒的GFP cDNA切割下来，与用同样内切酶消化的pcDNA3.1连接，构建真核表达载体pcDNA3.1-GFP。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
【试剂】
1.菌种含绿色荧光蛋白重组子T-GFP质粒
2.LB液体培养基称取胰蛋白胨3.0g，酵母提取物1.5g，NaCl3.0g，加双蒸水200ml溶解，用5mol/LNaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。
【原理】
引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成2—3个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。
15.DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5μg/μl。
16.其他试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇。
【操作步骤】
1.将下列试剂缓冲液2μl，T-GFP质粒或pcDNA3.1质粒(1μg)，KpnI和ApaI各5～10U加至0.5mlEP管中，加双蒸水至20μl，加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应1h。
9.10mg/mlRNaseA称取RNaseA10mg溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸。
简述真核生物基因表达调控过程
简述真核生物基因表达调控过程真核生物基因表达调控过程是指在真核生物细胞中，如何通过一系列的调控机制，将基因中的遗传信息转化为蛋白质，以实现细胞功能的正常发挥。
基因表达调控过程可以分为转录调控和转录后调控两个阶段。
在转录调控阶段，首先是在细胞核中进行转录。
细胞核中的DNA被RNA聚合酶酶识别并解链，形成单链mRNA。
但并不是所有基因都会被转录，细胞会根据需要选择性地进行转录。
这是通过转录因子的作用来实现的。
转录因子是一类能够与DNA特定序列结合的蛋白质，它们能够促进或抑制转录的进行。
转录因子的结合位点位于启动子区域，当转录因子结合到启动子区域时，会引发一系列的反应，包括启动RNA聚合酶的活性和引导其结合到合适位置上，从而促使转录的进行。
转录因子的表达受到多种因素的调控，如细胞内的信号分子、细胞周期等。
转录后调控是指在mRNA合成后，通过一系列的调控机制来决定其在细胞中的命运。
mRNA在合成后需要经过剪接、修饰和运输等过程。
剪接是指将mRNA中的内含子去除，将外显子进行连接的过程。
通过剪接的不同方式，可以生成不同的mRNA亚型，从而在翻译过程中产生不同的蛋白质。
修饰是指在mRNA上加上帽子和尾巴等化学修饰，这些修饰可以保护mRNA不被降解，并帮助mRNA与翻译机器结合。
运输是指mRNA离开细胞核，进入到细胞质中，进一步参与翻译过程。
这个过程受到RNA结合蛋白的调控。
在翻译过程中，mRNA被核糖体识别并翻译成蛋白质。
这个过程也受到多种调控机制的影响。
一方面，mRNA上的启动子序列会影响翻译的起始位置，从而决定蛋白质的翻译起始位点。
另一方面，mRNA的稳定性也会影响翻译的效率和蛋白质的表达水平。
mRNA 的稳定性受到RNA结合蛋白和非编码RNA的调控。
总的来说，真核生物基因表达调控过程是一个复杂而精细的调控网络。
通过转录调控和转录后调控的相互作用，细胞可以根据内外环境的需要，在不同的时空位置上产生不同类型的蛋白质，以实现细胞功能的正常发挥。
真核基因克隆表达的大致步骤
真核基因克隆表达的大致步骤1. 啥是真核基因克隆表达呢？简单来说，就是把真核生物细胞里的基因拿出来，然后让它在别的地方，像细菌啊之类的，能够大量地产生这个基因所编码的蛋白质。
这就好比从一个宝藏库里找到一颗特别的宝石（基因），然后把这颗宝石放到一个工厂（比如细菌）里，让这个工厂按照宝石的样子做出好多好多一模一样的小饰品（蛋白质）。
这在生物学研究和很多实际应用里可重要啦。
比如说生产药物，好多药就是利用这种克隆表达的技术生产出来的。
就像胰岛素，以前从动物身上提取可麻烦了，现在通过克隆表达技术，就能很方便地生产出来给糖尿病患者用。
2. 大致步骤来喽。
基因的获取。
我们得先从真核细胞里找到我们想要的那个基因。
这就像在一个超级大的图书馆里找一本特定的书一样难。
有时候可以直接从细胞的基因组里找，这就像在图书馆的书架上一本本找。
还有的时候呢，可以从细胞里已经转录好的mRNA入手，这就好比从图书馆的借阅记录里找这本书的线索，然后再根据这个线索去找那本书。
比如说我们想克隆表达人的胰岛素基因，就要先确定这个基因在人体细胞里的位置或者从产生胰岛素的细胞里找它的mRNA。
构建克隆载体。
找到基因后，得给它找个“小推车”，这个“小推车”就是克隆载体。
常见的克隆载体有质粒啦。
就像我们要把宝石（基因）运到工厂（细菌），得有个小推车来装着它才行。
我们要把基因连接到这个载体上，这就需要一些特殊的工具，像限制性内切酶和DNA连接酶。
限制性内切酶就像一把剪刀，能在载体和基因上剪出合适的接口，然后DNA连接酶就像胶水，把基因和载体粘在一起。
导入宿主细胞。
把带着基因的载体送到宿主细胞里，这就像把装满宝石的小推车推到工厂里。
对于真核基因克隆表达，宿主细胞可以是细菌，也可以是真核细胞，像酵母细胞之类的。
把载体导入细菌细胞可以用转化的方法，就像给细菌开个小后门，让小推车能进去。
要是导入酵母细胞，可能就需要用一些更复杂的方法啦。
筛选阳性克隆。
并不是所有的宿主细胞都成功地接纳了我们想要的基因。
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真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体
1、pCMVp-NEO-BAN 载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔B -球蛋白基因
内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo 基因以及pBR322 骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sall、BamHI和EcoRI位点。
注意在此载体中有二个EcoRI 位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)
特点： pEGFP 表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo 抗性盒由SV40 早期启动子、Tn5 的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV 启动子,Acet1-Nhe1) 。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体
特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆B -肌动蛋白基因，在PCMV启动
子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin 使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo 抗性盒由SV40 早期启动子、Tn5 的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G41 8筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途： pEGFP-Actin 载体在真核细胞表达EGFP-Actin 融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
4、pSV2 表达载体
特点：该表达质粒是以病责SV40 启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为
Hind111。
SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。
此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。
5、CMV4 表达载体
特点：该真核细胞表达载体由CMV 启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。
含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl 单链复制原点。
但值得注意的是，该表达载体不含有neo 基因，转染細胞后不能用G418 筛选稳定的表达细胞株。
其他常用克隆Vector：
pBluscript II KS DNA 15 ug
pUC18 DNA 25ug
pUC19 DNA 25ug
说明：
pBluescript II kS、pUC18 &Puc19 载体适合于DNA 片段的克隆、DNA 测序和对外源基因进行表达等。
这些载体由于在lacZ 基因中含有多克隆位点，当外源DNA 片段扦入，转化lacZ 基因缺乏细胞，并在含有IPTG 和X-gal 的培养基上培养时，含有外源DNA 载体的细胞
将为白色菌落，而无外源DNA 片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA 片段的载体。
此外，这些载体中有便于测序
的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。
保存液: TE Buffer
TE Buffer 组成:
10mM Tris.HCL(Ph 8.0)
1mM EDTA
用途:
克隆外源DNA 片断.
进行基因表达.
使用M13、T7和T3引物进行测序.
存在的问题细胞的生命活动是一个复杂的调控过程，有些生命活动的机理还不完全清晰，由于插人的目的基因不同，载体构建栗用的顺式组件不同，组装的空间位置不同，采用的表达系统不同，目的基因表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。
另外，由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性，所构建的高效表达载体不一定在所有细胞株中均高效表达。
再者，细胞生长状态的差异，转染方法的不同培养时阉的长短，筛选药物浓度的高低，对表达量都有很大影响。
所以，需要综合评价一个表达载体和表达系统，排除一些不定因素，筛选出最佳组合
真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建。
许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中，大大提高了目的基因的表达量，另外一些强的组成型启动子，如SV40 早期启动子+PHTLv ，已应用于大规模生产的细
胞系中。
应用以GS为筛选标志的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能，是目前研究的重点。
以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核
表达载体的主体。
在同一启动子操纵下，筛选基因或报告基因与目的基因转录在同一mRNA上通过IRES的作用，表达出两种蛋白，因
而在理论上可认为，通过了筛选或表达了报告基因的克隆必为阳性克隆，即表达目的基因的克隆，有报道说这种双顺反子的共表达率为90％。
这就大大提高了筛选率，简化了实验过程。
将强启动子、增强子和可扩增的筛选标志组装在同一载体上，构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中，是当今真核表达载体构建研究发展方向。