蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用精品课件

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特点
可分离10—100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配
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第一向IEF电泳
在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从
阳极到阴极，pH值逐渐增大。而蛋白质分子具有
两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白
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双向电泳典型过程包括：
①蛋白质样品制备：要防止蛋白质酶降解蛋白质。
②上样
一种是IPG胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上 样。
别一种是将样品与重泡胀液混合，在IPG胶条泡胀的同时 样品出参入了胶条。
③IPG的运行和平衡
④SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑤胶上蛋白质检测和定量：
质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时
原
失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚 焦蛋白质分子的等电点（pI）。同理，位于酸性
理 区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它
们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电
点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋
白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场
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蛋白质组学研究的内容
1、蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究
蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的 与基因组学相对应的主要内容。它要求对蛋白质组 进行表征,即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图 谱化。双向凝胶电泳(2-DＥ)和质谱(Mass spectrometry)技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支 柱技术
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➢ mRNA水平的基因表达研究取得进 展，但mRNA与蛋白质间的相关系 数仅为0.4～0.5
➢ 蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA 水平得到解答
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蛋白质组学的概念
蛋白质组是澳大利亚学者Williams 和Wilkins于1994年首先提出，
被定义为：一个基因组/一种生物或 一种细胞/组织所表达的全部蛋白质。
（一）、二维（双向）凝胶电泳（twodimensional electrophoresis，2-DE)：
◆ 利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶 化学特性，分离各种蛋白质的方法。
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原理
◆第一向在高压电场下对蛋白质进行等电 聚焦电泳技术(IEF)将蛋白质混合物按照 等电点高低进行分离, 再在第一向垂直 方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电 泳 (SDS-PAGE) 按 照 相 对 分 子 质 量 大 小 进行蛋白质分离。
2、蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白 质相互作用网络关系)的研究
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大规模的蛋白质分析过程
样品制备
是蛋白质组研究的第一步也是最关键的一步。
蛋白质分离（技术）：
二维电泳（核心技术）、多维色谱
蛋白质分析与鉴定（技术）：
质谱技术（核心技术）、蛋白质芯片技术、酵母双杂 交技术和噬菌体表面展示技术等。
第11章
蛋白质组学及其在微生物学 研究中的应用
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主要内容
第一节 引言 第二节 蛋白质组学研究基本技术 第三节 微生物蛋白质组学
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第一节 引言
背景
➢ 基因组时代 →后基因组时代 ➢ 核苷酸序列本身很难直接与生命功能和生命
现象挂起钩，而蛋白质才是生物功能的最终 执行者。 ➢ 蛋白质数目大大超过基因数目。 蛋白质随时 间和空间而变化。
优点
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固相pH梯度等电聚焦的优点
◆克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 ◆稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
尤 其 可 在 较 窄 的 pH 范 围 内 进 行 第 二 轮分析，大大提高了分辨率及重复性。
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第二向SDS-PAGE电泳
垂直板电泳 水平超薄胶电泳
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蛋白质组是：
对应于基因组的所有蛋白质构成的整 体，不是局限于一个或几个蛋白质。
同一基因组在不同细胞、不同组织中 的表达情况各不相同 。
在空间和时间上动态变化着的整体。
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蛋白质组学(proteomics)
指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新 兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动 态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状 态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示 蛋白质功能与细胞生命活动规律。
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蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴 定和解析蛋白质技术的进步。
重要技术突破主要包括三点：
固相化pH梯度二维电泳（IPG-2-DE)的 发明与完善；
生物质谱，即应用软电离技术对生物大分 子进行分析的质谱技术的发展；
生物信息学发展。
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一、蛋白质组研究中的蛋白质分离
◆ 在2－D胶上有些蛋白质点量太少，难以进 行质谱鉴定；操作费时、费力，自动化程度低 难于与质谱联用实现自动化性质联用。
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2、新型非凝胶技术
◆高效液相色谱法 High performance liquid chromatography，HPLC ◆毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE ◆液相等点聚焦和毛细管色谱 capillary electrochromatography
荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿，线性范围要远 高地银染，与质谱兼容性好。
⑥图像采集、分析及数据处理
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2-DE技术的缺点
◆ 所能分离的蛋白质的性质有一定限制，如蛋白质分
离范围一般为8~200kD，对极碱性蛋白质，疏水性蛋 白质，包含信号蛋白和转录因子的低丰度蛋白质难于 有效分离。
★ 蛋白质组发展的瓶颈是缺乏自动化的蛋白质分析 的完整途径。
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第二节 蛋白质组学研究基本技术
典型的蛋白质组学研究常分为四个步骤：
从生物学物质（如细胞、组织、体液等） 提取蛋白质混合液
分离蛋白质混合液
将有意义的蛋白质消化 成肽进行质谱分析
将质谱获得的数据利用各种
生物信息精学品 P工PT 具可修进改行分析
内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等
电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
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传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。
pH凝胶制作的不稳定和重复性差限制了 等点聚焦电泳技术的应用，
Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯 度等电聚焦技术，GÖrg等成功地将之 应用于双向电泳。