基因工程资料1
基因工程知识点 超全
基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在二、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀”2、DNA连接酶-----“分子缝合针”3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车”（5）识别序列的特点：2．“分子缝合针”——DNA连接酶（1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
（2）类型相同点：都连接磷酸二酯键3．“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
(4)载体的作用:①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
【解题技巧】(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。
(4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。
(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。
基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
例1．限制酶MunⅠ和限制酶Eco RⅠ的识别序列及切割位点分别是－C↓AATTG－和－G↓AATTC－。
高一生物基因工程知识点
高一生物基因工程知识点基因工程是应用生物技术手段对生物体基因进行分子水平的操作和改造，以达到某种特定目的的过程。
它是现代生物技术的重要组成部分，具有广泛的应用前景和巨大的社会经济效益。
下面将介绍一些高一生物基因工程的知识点。
一、基因工程的定义与概念基因工程（Genetic Engineering），又称基因重组技术或遗传工程，是指人为地对生物体的遗传物质DNA进行重组、修饰和改变，通过在DNA水平上的操作，实现对生物体基因的控制和调节，从而获得特定的基因组合和性状的改良。
二、基因工程的主要技术手段1. DNA重组技术：包括DNA分子剪切、粘接、连接、转化等操作，以实现对目标基因的操作和改造。
2. 基因克隆技术：通过将目标基因从一个生物体中剪切并插入到另一个生物体中，实现对目标基因的复制和扩增。
3. 基因敲除技术：通过人为干预基因的表达，使目标基因在特定生物体中失去功能，以研究其功能和调控机制。
4. 基因编辑技术：利用CRISPR/Cas9等工具，直接对基因序列进行定点改造，实现精确的基因编辑和修饰。
三、基因工程在农业领域的应用1. 转基因作物的培育：通过将外源基因导入作物中，使其获得抗虫、抗病、耐旱、抗逆等性状，提高作物的产量和品质。
2. 基因编辑育种：利用基因编辑技术，对农作物的基因组进行精确的改造，实现性状的快速改良和遗传纯化。
3. 基因工程种子的利用：在种子中加入抗生素和草除剂等基因的表达载体，使作物在生长过程中具有抗草药性和抗病药性，提高作物的生长环境适应性。
四、基因工程在医学领域的应用1. 基因治疗：通过将正常基因导入患者体内，修复患者体内异常或缺失的基因，治疗某些遗传性疾病。
2. 重组蛋白的生产：通过将目标基因导入细胞中，使细胞表达目标蛋白，用于生产重要的药物和治疗蛋白。
3. 基因诊断：通过对患者基因组的检测，发现和分析基因突变和异常，为疾病的早期诊断和治疗提供依据。
五、基因工程的伦理与风险基因工程技术的发展和应用给人类带来了众多的利益，但也存在一定的伦理和风险问题。
基因工程专业资料
基因工程专业资料基因工程是一门涉及基因操作和基因改造的学科，通过改变生物体的遗传信息，可以实现对生物体性状的调控和改善。
基因工程技术的应用范围广泛，涵盖农业、医学、环境保护等多个领域。
本文将介绍基因工程的基本原理、应用领域以及未来发展方向。
一、基因工程的基本原理基因工程的基本原理是通过对DNA分子进行操作，改变生物体的遗传信息。
DNA是生物体遗传信息的携带者，由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、鳞氨酸）组成的序列决定了生物体的遗传特征。
基因工程的操作主要包括DNA的分离、剪切、连接和转移等步骤。
首先，通过特定的方法，可以将DNA从细胞中提取出来，得到纯净的DNA样本。
然后，利用限制性内切酶对DNA进行剪切，得到具有特定序列的DNA片段。
接下来，将目标DNA片段与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
最后，将重组DNA导入宿主细胞中，使其表达目标基因。
二、基因工程的应用领域基因工程技术在农业、医学、环境保护等领域有着广泛的应用。
在农业领域，基因工程技术可以用于改良作物品质、提高产量和抗病虫害能力。
例如，通过转基因技术，可以将抗虫基因导入作物中，使其具有抗虫的能力，减少农药的使用量，降低环境污染。
此外，基因工程还可以用于改善作物的抗逆性，使其能够适应恶劣的环境条件，提高作物的产量和品质。
在医学领域，基因工程技术可以用于研发新药和治疗遗传性疾病。
通过基因工程技术，可以大规模合成蛋白质药物，如重组人胰岛素、重组人生长激素等。
此外，基因工程技术还可以用于基因治疗，通过修复或替代患者的异常基因，治疗遗传性疾病。
在环境保护领域，基因工程技术可以用于生物降解和生物修复。
通过基因工程技术，可以改造微生物，使其具有降解有机污染物的能力，用于处理工业废水和固体废弃物。
此外，基因工程技术还可以用于修复受污染的土壤和水体，恢复生态平衡。
三、基因工程的未来发展方向随着基因工程技术的不断发展，未来的研究方向主要包括以下几个方面：1. 基因编辑技术的突破：目前，CRISPR-Cas9是最常用的基因编辑技术，但其存在一定的局限性。
基因工程知识点总结
基因工程知识点总结基因工程是一门现代生物学领域的重要学科，它通过改造生物体的遗传物质，实现对生物体基因的精确操控和改良。
下面将对基因工程的相关知识点进行总结，以帮助读者更好地了解该领域的基本概念和技术应用。
一、基因工程的基本概念和原理基因工程是指通过人为手段修改生物体的基因组，以改变其性状和功能的技术。
其实现的基本原理包括基因定位、基因克隆和基因传递。
1. 基因定位：基因定位是指确定感兴趣的基因在基因组中的位置。
常用的方法有FISH（荧光原位杂交）和PCR（聚合酶链反应）等。
2. 基因克隆：基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中，使其在目标生物体中表达。
常用的方法有限制酶切、连接酶切和DNA合成等。
3. 基因传递：基因传递是指将经过克隆的基因导入到目标生物体中，并使其在目标生物体中稳定遗传。
常用的方法有基因枪、电穿孔和冷冻贮存等。
二、基因工程的应用领域基因工程技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用，下面将分别介绍其主要应用领域。
1. 农业应用：基因工程技术在农业领域的应用主要包括转基因作物的培育和遗传改良。
通过导入特定基因，转基因作物可以获得抗病虫害、耐逆性或提高产量等特点，从而增加农作物的产量和质量。
2. 医学应用：基因工程技术在医学领域的应用主要包括基因诊断、基因治疗和生物药物的生产。
通过基因诊断，可以准确检测遗传病的基因突变，为疾病的早期预测和治疗提供依据。
基因治疗则通过修复或替代患者体内的异常基因，治疗遗传性疾病。
此外，基因工程技术还被用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
3. 工业应用：基因工程技术在工业领域的应用主要包括酶的生产和环境修复。
通过基因工程技术，可以大量生产具有特定功能的酶，用于工业生产和制药领域。
此外，基因工程技术还可以改造微生物，使其能够降解有机物污染物，用于环境修复和生物能源开发。
三、基因工程的伦理和安全问题尽管基因工程技术具有重要的应用前景，但也带来了一些伦理和安全问题。
基因工程知识点总结
基因工程知识点总结基因工程，这个在现代生物学中熠熠生辉的领域，正以惊人的速度改变着我们的生活和对生命的认知。
它就像是一把神奇的钥匙，开启了无数未知的大门，为解决人类面临的诸多问题带来了前所未有的希望和可能。
一、基因工程的定义与基本原理基因工程，简单来说，就是按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行切割、拼接和重组，然后导入另一种生物的细胞内，使之稳定遗传并表达出相应产物的技术。
其基本原理基于三个重要的步骤：首先是获取目的基因，这就像是在茫茫基因海洋中找到我们想要的那一颗珍珠；其次是构建基因表达载体，相当于给这颗珍珠打造一个合适的盒子，使其能够安全、有效地传递；最后是将重组 DNA 分子导入受体细胞，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
二、获取目的基因的方法1、从基因文库中获取基因文库就像是一个巨大的基因仓库，里面存储着各种各样的基因。
我们可以根据已知的信息，从这个文库中筛选出我们需要的目的基因。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 技术就像是一个基因的复印机，能够以极少量的基因片段为模板，快速大量地复制出我们想要的基因。
3、人工合成法如果已知目的基因的核苷酸序列，或者其氨基酸序列，我们可以通过化学方法直接人工合成目的基因。
三、基因表达载体的构建基因表达载体是基因工程的核心部分，它就像是一辆专门运输基因的列车，需要具备多个关键组件。
1、启动子启动子是基因表达的“开关”，它能够控制基因在何时何地开始表达。
2、终止子终止子则是基因表达的“刹车”，告诉基因在何处停止表达。
3、标记基因标记基因就像是一个个小标签，帮助我们筛选出成功导入目的基因的受体细胞。
4、目的基因这是我们最终想要表达的基因片段。
四、将目的基因导入受体细胞1、导入植物细胞（1）农杆菌转化法农杆菌就像是一个天然的基因运输工具，能够将其携带的基因转移到植物细胞中。
（2）基因枪法通过高速的微粒将目的基因直接打入植物细胞。
（3）花粉管通道法利用花粉管通道将目的基因导入植物的受精卵中。
生物学知识点 基因工程
生物学知识点基因工程基因工程是生物学中的一个重要分支，它涉及到对基因的操作和改造，以达到改良生物体的目的。
本文将介绍基因工程的基本概念、技术方法以及应用领域。
一、基因工程的概念与原理基因工程是指通过对生物体的基因进行人为的操作和改造，以达到改良生物体的目的的一门学科。
其基本原理是利用现代分子生物学的技术手段，对生物体的基因进行剪接、克隆、转移等操作，从而实现对生物体特性的调控和改变。
基因工程的核心技术是基因重组技术，即将不同生物体的基因进行重组，形成新的基因组合，然后将其导入目标生物体中，使其表达出新的特性。
基因重组技术主要包括以下几个步骤：1. DNA提取：从生物体中提取出含有目标基因的DNA片段。
2. 基因剪接：利用限制酶将目标基因与载体DNA进行剪接，形成重组DNA。
3. 转化：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其表达出目标基因。
4. 选择与筛选：通过选择性培养基或标记基因等方法，筛选出带有目标基因的转基因细胞或生物体。
5. 鉴定与分析：对转基因细胞或生物体进行鉴定和分析，确认其是否成功表达目标基因。
二、基因工程的应用领域1. 农业领域：基因工程在农业领域的应用十分广泛。
通过基因工程技术，可以改良农作物的抗病性、耐逆性和产量等性状，提高农作物的品质和产量。
例如，转基因水稻可以提高抗虫性和耐盐碱性，转基因玉米可以提高抗除草剂和杂草的能力。
2. 医学领域：基因工程在医学领域的应用主要包括基因治疗和基因诊断。
基因治疗是指利用基因工程技术，将正常的基因导入到患者体内，以治疗遗传性疾病或其他疾病。
基因诊断是指通过对患者的基因进行检测和分析，以确定患者是否携带某种疾病的遗传基因。
3. 环境保护领域：基因工程可以应用于环境污染治理和生物修复。
通过基因工程技术，可以改造微生物，使其具有降解有机污染物的能力，从而实现对环境污染物的清除和修复。
4. 工业领域：基因工程在工业领域的应用主要包括生物制药和生物能源。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
基因工程知识点总结
基因工程知识点总结一、基因工程的概念基因工程，又称基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
简单来说，基因工程就是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。
二、基因工程的工具（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
2、特点：能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3、作用结果：产生黏性末端或平末端。
（二）“分子缝合针”——DNA 连接酶1、分类：E·coli DNA 连接酶和 T4DNA 连接酶。
2、作用：将两个具有相同末端的 DNA 片段连接起来。
（三）“分子运输车”——载体1、作用：将目的基因送入受体细胞。
2、具备条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。
具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入。
具有标记基因，便于筛选。
3、种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
其中质粒是基因工程中最常用的载体。
三、基因工程的基本操作程序（一）目的基因的获取1、从基因文库中获取基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如 cDNA 文库）。
基因组文库包含了一种生物的全部基因；cDNA 文库只包含了一种生物的部分基因，是由 mRNA 反转录得到的 DNA 组成。
2、利用 PCR 技术扩增目的基因PCR 是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。
原理：DNA 双链复制。
条件：模板 DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）等。
3、人工合成如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。
（二）基因表达载体的构建（核心步骤）1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。
基因工程基础知识梳理(一)
基因工程基础知识梳理（一）一、DNA重组技术的基本工具基因工程又叫＿＿＿＿＿＿＿，指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和＿＿＿＿＿＿＿等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
其操作水平是在＿＿＿＿＿＿＿上进行设计和施工，操作环境是在生物体外。
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（1）主要来源：＿＿＿＿＿生物。
（2）特点：能够识别DNA特定的＿＿＿＿＿＿＿，切开两个核苷酸之间的＿＿＿＿＿。
（3）DNA末端：限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式：＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”（1）作用：将双链＿＿＿“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的＿＿＿＿＿。
（2）种类①E·coli DNA连接酶：只能缝合DNA的＿＿＿＿＿＿。
②T4DNA连接酶：即可缝合DNA的黏性末端，又可缝合双链DNA的＿＿＿＿＿。
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（1）载体的种类①质粒：是一种裸露、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有＿＿＿＿＿能力的＿＿＿＿＿。
②＿＿＿＿＿的衍生物。
③动植物病毒。
（2）质粒载体的特点①能够在细胞内＿＿＿＿＿＿＿。
②具有一个或多个＿＿＿＿＿＿＿，便于供外源DNA片段插入其中。
③具有特殊的＿＿＿＿＿＿＿，供重组DNA的鉴定和选择。
（3）质粒载体的处理：真正被用作载体的质粒，都必须在天然质粒的基础上进行＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
二、基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取（1）目的基因：指编码蛋白质的＿＿＿＿＿。
（2）获取目的基因的方法①从基因文库中获取目的基因a．基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多＿＿＿＿＿，导入＿＿＿＿＿的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
b．基因文库和种类（ⅰ）基因组文库：含有一种生物的＿＿＿＿＿基因（ⅱ）部分基因文库：含有一种生物的＿＿＿＿＿基因c．目的基因的获取依据：（ⅰ）基因的＿＿＿＿＿序列；（ⅱ）基因的功能；（ⅲ）基因在染色体上的位置；（ⅳ）基因的＿＿＿＿＿产物mRNA；（ⅴ）基因的翻译产物蛋白质。
生物基因工程知识点
生物基因工程知识点1. 基因工程定义基因工程，又称遗传工程，是指通过人工手段对生物体的基因进行改造，以实现对生物体性状的改变和新品种的培育。
它包括基因克隆、基因转移、基因编辑等多个技术环节。
2. 基因克隆基因克隆是指将特定的基因片段从供体生物体中提取出来，并在体外进行复制和扩增的过程。
这一过程通常涉及限制性内切酶、DNA连接酶和载体等分子生物学工具。
3. 基因转移基因转移是将克隆的基因片段导入到受体细胞中，使其成为受体细胞基因组的一部分，并能够表达出新的性状。
常用的基因转移方法包括质粒介导、病毒载体和基因枪等。
4. 基因编辑基因编辑是指对生物体基因组中的特定位点进行精确的添加、删除或替换。
CRISPR-Cas9是目前最流行的基因编辑技术，它允许科学家在细胞中进行特定DNA序列的编辑。
5. 转基因生物转基因生物是指通过基因工程技术改变了基因组的生物。
这些生物可能会展现出抗虫、抗病、抗旱等特性，或者提高营养价值。
6. 伦理和法律问题基因工程的发展引发了一系列伦理和法律问题，包括生物安全、生物多样性保护、知识产权和公众接受度等。
各国政府和国际组织都在制定相关法规以确保基因工程的安全和合理应用。
7. 基因工程的应用基因工程在农业、医学、工业生产和环境保护等多个领域都有广泛应用。
例如，在医学领域，基因工程被用于生产重组蛋白药物；在农业领域，用于培育抗病虫害的转基因作物。
8. 安全性评估由于基因工程可能对环境和人类健康产生影响，因此对转基因生物的安全性评估至关重要。
这包括对转基因生物的环境影响、长期食用安全性等进行系统的研究和评估。
9. 未来发展趋势基因工程的未来发展趋势包括提高基因编辑的精确性和效率、发展新的基因工程技术、加强跨学科研究以及推动基因工程在全球范围内的合理应用和监管。
10. 公众教育和沟通鉴于基因工程的复杂性和伦理问题，公众教育和沟通显得尤为重要。
科学家和政策制定者需要与公众进行有效沟通，提高公众对基因工程的理解，促进科学决策的制定。
基因工程资料
基因工程资料基因工程是一门涉及生物学、化学、物理学和计算机科学等多学科的交叉学科，它通过改变生物体的基因组，从而改变生物体的性状和功能。
基因工程的应用范围广泛，包括农业、医学、环境保护等领域。
本文将介绍基因工程的基本概念、技术原理、应用领域以及相关伦理和安全问题。
一、基因工程的基本概念基因工程是指通过对生物体的基因进行人为改造，以达到特定目的的一种技术。
它包括基因的克隆、基因的定点突变、基因的插入和基因的删除等操作。
基因工程的核心是DNA分子的重组，通过将不同来源的DNA片段进行连接，构建出具有特定功能的重组DNA。
二、基因工程的技术原理基因工程的关键技术包括基因克隆、基因定点突变、基因插入和基因删除等。
其中，基因克隆是指将感兴趣的基因从生物体中分离出来，并进行扩增，得到足够多的DNA片段。
基因定点突变是指通过人为干预，使某个基因的序列发生改变，从而改变基因的功能。
基因插入是指将外源基因导入到目标生物体的染色体中，使其表达出外源基因的特性。
基因删除是指通过人为干预，将某个基因从生物体的染色体中删除，从而消除该基因的功能。
三、基因工程的应用领域基因工程在农业、医学、环境保护等领域都有广泛的应用。
在农业领域，基因工程可以用于改良作物，使其具有抗虫、抗病、耐旱等性状，提高农作物的产量和品质。
在医学领域，基因工程可以用于治疗遗传性疾病，如基因治疗、基因替代治疗等。
在环境保护领域，基因工程可以用于处理污染物、修复生态环境等。
四、基因工程的伦理和安全问题基因工程的发展给人类带来了巨大的福祉，但同时也引发了一系列的伦理和安全问题。
首先，基因工程涉及到对生物的改造，可能会对生物的自然属性产生不可逆的影响，引发生态系统的紊乱。
其次，基因工程可能导致基因的非预期突变，产生未知的风险和危害。
此外，基因工程还涉及到对个体隐私和人类基因库的管理问题，需要制定相应的法律和伦理准则。
综上所述，基因工程是一门重要的交叉学科，它通过改变生物体的基因组，实现对生物体性状和功能的改变。
基因工程知识点总结
基因工程知识点总结基因工程是现代生物技术的核心领域之一，它为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
接下来，让我们一起深入了解基因工程的相关知识点。
一、基因工程的定义和基本原理基因工程，又称重组 DNA 技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
其基本原理是基于不同生物的 DNA 都具有相同的化学组成和双螺旋结构，并且遵循相同的碱基互补配对原则。
通过提取目的基因，将其与适当的载体连接形成重组 DNA 分子，然后导入受体细胞，使目的基因在受体细胞中得以表达。
二、基因工程的操作工具（一）“剪刀”——限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。
它就像一把精准的剪刀，能够在 DNA 链上剪出我们需要的片段。
（二）“针线”——DNA 连接酶DNA 连接酶能将被限制酶切割开的两个 DNA 片段的末端连接起来，从而形成重组 DNA 分子。
（三）“运载体”常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
运载体需要具备多个条件，如能够在宿主细胞中稳定保存并自我复制；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有标记基因，便于重组 DNA 分子的筛选等。
三、基因工程的基本操作程序（一）目的基因的获取获取目的基因的方法有多种，比如从基因文库中获取、利用 PCR技术扩增目的基因以及通过化学方法人工合成等。
（二）基因表达载体的构建这是基因工程的核心步骤。
将目的基因与运载体结合，构建基因表达载体，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时能够表达和发挥作用。
（三）将目的基因导入受体细胞根据受体细胞的不同，导入的方法也有所不同。
例如，将目的基因导入植物细胞可以采用农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等；导入动物细胞常用的方法是显微注射法；导入微生物细胞则通常使用感受态细胞法。
基因工程知识点
基因工程知识点一、基因工程的定义和发展历程基因工程是指利用现代生物技术手段，对生物体的基因进行修改、操纵和重组，以达到改良、创新或者创造新的生物体的目的。
其发展历程可以分为三个阶段：第一阶段是20世纪60年代至70年代初期，主要是基于限制性内切酶和DNA重组技术；第二阶段是70年代中期至80年代，主要是基于DNA测序技术和克隆载体技术；第三阶段则是80年代后期至今，主要是基于CRISPR/Cas9系统和合成生物学技术。
二、基因工程的应用领域1.医学领域：包括疾病诊断、治疗、预防等方面。
例如，利用基因工程技术可以制备人类胰岛素等药品。
2.农业领域：包括作物遗传改良、动物育种等方面。
例如，通过转基因技术可以使植物具有抗虫害、耐旱等特性。
3.环境保护领域：包括污染治理和资源利用等方面。
例如，利用微生物修复污染土壤等。
三、基因工程的主要技术1.基因克隆技术：包括PCR、限制性内切酶切割、DNA连接等技术。
2.CRISPR/Cas9系统：利用CRISPR RNA和Cas9蛋白对特定的DNA序列进行剪切和修复。
3.基因转移技术：包括农杆菌介导的转化、基因枪法等技术。
四、基因工程的道德和安全问题1.生命伦理问题：包括人类克隆、基因编辑等方面，涉及到人类尊严和自由意志等问题。
2.环境安全问题：转基因作物可能会对生态环境造成影响，需要进行严格的安全评估和监管。
3.生物安全问题：转基因生物可能会对人类健康造成潜在风险，需要进行严格的安全评估和监管。
五、未来发展趋势1.合成生物学技术将成为重要发展方向，可以实现对生物体系的精准控制和调节。
2.纳米技术将与基因工程相结合，开发出更加智能化的药物和治疗手段。
3.人工智能将在数据处理和分析方面发挥重要作用，帮助解决基因工程中的复杂问题。
六、结语基因工程技术是当代科技领域的重要分支之一，其应用领域广泛，但也存在一定的道德和安全问题。
在未来的发展中，需要加强监管和安全评估，确保其合理、安全、可持续发展。
基因工程资料
基因工程的基本定义基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
基因工程的基本条件用于核酸操作的工具酶用于基因克隆的载体用于基因转移的受体菌或细胞用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶基因工程的基本操作程序目的基因的获取、表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定限制性核酸内切酶：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链上的特异位点上的酶。
主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。
限制性核酸内切酶的类型主要特性I 型II 型III 型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM识别序列TGAN8TGCT 旋转对称序列GAGCCAACN6GTGC CAGCAG 切割位点距识别序列1kb处随机性切割识别序列内或附近特异性切割距识别序列下游14-26bp处II 型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等DNA样品的甲基化程度：核酸内切酶的缓冲液性质：载体（vector）：基因工程中携带外源基因进入受体细胞，的“运载工具”，本质是DNA复制子。
载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件具有能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有合适的筛选标记基因，用于筛选重组体DNA质粒：生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的质粒的基本特征质粒的自主复制性、质粒的不相容性、质粒的可转移性、携带特殊的遗传标记理想质粒载体的必备条件较小的分子质量和较高的拷贝数若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点多克隆位点(multiple cloning site, MCS): 载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性内切酶的酶切位点的DNA片段具有两种以上的选择性标记基因缺失mob基因插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达核酸操作的基本技术核酸的提取与纯化（一）化学试剂提取法（二）离心分离法获得目的基因的方法：鸟枪法、cDNA法、PCR法、化学合成法、及建立基因文库的方法用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNAcDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。
基因工程知识点
基因工程知识点基因工程是一门关于生物基因的科学与技术，涉及到生物学、遗传学、分子生物学等多个学科领域。
通过对基因进行分析、修改和重组，基因工程可以改变生物体的遗传信息，从而创造出具有特定性状的新生物体或改良已有的生物体。
1. DNA的复制与修饰基因工程的第一步是对目标基因进行复制和修饰。
在DNA复制中，科学家可以使用聚合酶链反应（PCR）技术来大量复制目标基因。
然后，可以采用限制性内切酶来切割DNA片段，以便进行进一步的修改。
2. DNA的重组与合成基因工程的核心是对DNA分子进行重组和合成，以构建具有特定性状的基因组。
这可以通过DNA重组技术来实现。
该技术利用限制性内切酶将具有相同限制酶切位点的两个DNA分子进行剪切，并通过DNA连接酶将两个分子连接起来形成新的DNA分子。
3. 基因的转导与表达一旦目标基因经过修饰和重组，下一步是将其转导至宿主生物体。
这可以通过多种方法实现，其中最常用的是利用载体。
载体是一种能够稳定传递外源DNA到宿主细胞的工具，例如质粒、病毒等。
一旦外源基因进入宿主细胞，它们将会以不同的方式表达出来，例如转录成RNA、翻译成蛋白质等。
4. 基因工程在医学上的应用基因工程在医学领域有着广泛的应用。
例如，通过基因工程技术，可以合成大量的重组人胰岛素，用于治疗糖尿病。
另外，基因工程还可以用于生产重组疫苗，如乙型肝炎疫苗和人乳头瘤病毒疫苗等。
此外，基因工程还有助于研究遗传病的发病机制，并可能为这些疾病的治疗提供新的策略。
5. 基因工程在农业上的应用基因工程技术在农业领域的应用也非常广泛。
通过基因工程改良作物的抗虫性、抗病性和耐逆性，可以提高农作物的产量和品质，减少农药的使用。
例如，将一些具有抗虫性的基因导入到作物中，可以提高作物抵抗虫害的能力，从而减少农药的使用量。
总结基因工程作为一门复杂而又有前景的学科，为科学家们提供了许多改变生物体的机会。
通过对基因的分析、修改和重组，基因工程可以为人类的健康、农业的发展甚至整个生态环境带来深远的影响。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1、什么就是基因工程,基因工程得基本流程？基因工程(Genetic engineering)原称遗传工程。
从狭义上讲,基因工程就是指将一种或多种生物体(供体)得基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们得意愿遗传并表达出新得性状。
因此,供体、受体与载体称为基因工程得三大要素。
1、分离目得基因2、限制酶切目得基因与载体3、目得基因与载体DNA在体外连接4、将重组DNA分子转入合适得宿主细胞,进行扩增培养5、选择、筛选含目得基因得克隆6、培养、观察目得基因得表达第二章基因工程得载体与工具酶1、基因工程载体必须满足哪些基本条件？➢具有对受体细胞得可转移性或亲与性。
➢具有与特定受体细胞相适应得复制位点或整合位点。
➢具有多种单一得核酸内切酶识别切割位点。
➢具有合适得筛选标记。
➢分子量小,拷贝数多。
➢具有安全性。
2、质粒载体有什么特征,有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1、克隆质粒2、测序质粒3、整合质粒4、穿梭质粒5、探针质粒6、表达质粒3、质粒得构建(1)删除不必要得 DNA 区域,尽量缩小质粒得分子量,以提高外源 DNA 片段得装载量。
一般来说,大于20Kb 得质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定。
(2)灭活某些质粒得编码基因,如促进质粒在细菌种间转移得 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验得安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应得基因,提高质粒得拷贝数(3)加入易于识别得选择标记基因,最好就是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒得受体细胞。
(4)在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点得 DNA序列,即多克隆接头(Polylinker),便于多种外源基因得重组,同时删除重复得酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因得准确插入。
(5)根据外源基因克隆得不同要求,分别加装特殊得基因表达调控元件。
基因工程基础知识复习归纳
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体〔供体〕的基因与载体在体外进展拼接重组，然后转入另一种生物体〔受体/宿主〕内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的开展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆〔Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程〞、“DNA重组〞为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因〔供体〕：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子〔克隆载体、表达载体〕。
宿主〔受体〕：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞〔组织、器官或个体〕。
4.基因工程的根本步骤〔切、接、转、增、检〔大肠杆菌是中心角色〕〔1〕目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，别离出带有目的基因的DNA片断。
〔2〕重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记〔抗菌素抗性〕的载体分子上。
〔3〕重组体的转化：将重组体〔载体〕转入适当的受体细胞中。
〔4〕克隆鉴定：摘要转化成功的细胞克隆〔含有目的基因〕。
〔5〕目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
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基因工程一. 名词解释1.限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外来DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护自身的DNA不被讲解。
限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。
2.回文序列：这样的序列呈现为旋转对称，反向重复。
3.切口酶：有些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，这种酶称为切口酶。
4.同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
5.同尾酶：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可能产生相同的粘性突出末端。
其切割得到的产物可进行互补。
6.连接酶：催化磷酸基与羟基之间形成磷酸二酯键，将两段核酸连接起来的酶。
7.质粒：是染色体外的遗传因子，能进行自我复制；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子,少数为线性。
8.标记基因：按其用途可分为选择标记基因和筛选标记基因，选择标记基因用于鉴别目的DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。
而筛选标记基因可用于将携带了外源DNA片段的重组子挑选出来。
9.载体：将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞的工具称为载体。
具备以下三个必须元件：复制原点、多克隆位点和筛选标记10.转化：来自一个供体的 DNA 片段被另一个受体所吸收二．要点2.基因工程的三大要素：供体、受体、载体。
3.基因工程操作的基本步骤：（1）切：从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA （包括外源基因或目的基因）和载体分子切开。
（2）接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成DNA 重组分子。
（3）转：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞（4）增：短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（5）检：筛选和鉴定经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞4.基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达5.绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双键分子，其功能是：（1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力（2）为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力（3）为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力（3）整合质粒：含有整合酶编码基因以及整合特异性的位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进入受体细胞后，能准确地重组整合在受体染色体DNA的特定位点上（4）穿梭质粒：能在两种不同种属的受体细胞中复制及检测（5）探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件（6）表达质粒：使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达9.λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体，由外壳蛋白与一个48.5kb长的双链线状DNA分子组成。
λ -DNA的包装上限为50.9kb。
10.λ -DNA载体由于包装的限制，其外源DNA片段装载量最多只有23kb左右。
12.多数Ⅱ类酶的识别序列为4、5或6个碱基对，而且具有180°旋转对称的回文结构。
13.绝大多数的Ⅱ类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间，一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶，其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，有些酶识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶。
14.大肠杆菌的DNA连接酶在催化连接反应时，需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ＋）作为辅助因子，NAD＋与酶形成酶-AMP复合物，同时释放出烟酰胺单核苷酸（NMN）。
15.T4噬菌体的DNA连接酶以ATP作为辅助因子。
16.T4-DNA连接酶由T4噬菌体编码，T4-DNA连接酶与大肠杆菌连接酶相比具有更广泛的底物适应性20.可将所有的Ⅱ类限制性核酸内切酶分为三大组，即低盐组（0~50mmol/LNaCl）、中盐组（50~100mmol/LNaCl）、高盐组（100~150mmol/LNaCl）21.第Ⅱ类限制性核酸内切酶虽然具有特异性的识别位点及切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称为限制性核酸内切酶的星号活性。
（条件变化可能是低盐、高PH（＞8）、甘油大量存在）22.大多数限制性核酸内切酶可简单地在68℃保温10min灭活23.T4-DNA连接酶催化的连接反应的缓冲系统组成为：50~100mmol/LTris-HCl（PH7.5），10mmol/LMgCl2，5mmol/LDTT以及≤1mmol/L 的ATP。
通常1国标单位（U）的T4-DNA连接酶定义为，在最佳缓冲系统及15℃、1h之内，完全连接1µgλ-DNA的HindⅢ片段所需的酶量24.大多数限制性核酸内切酶产生的黏性末端的Tm值在15℃以下，连接反应温度与时间常采用下列几种组合：15℃-2h，12℃-8h,7℃过夜。
25.重组率是指在连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与所投入的载体分子数之比26.提高重组率可采用以下方法：（P39）（1）提高外源DNA片段与载体DNA的分子数之比（2）在连接反应前，先用碱性磷酸单酯酶处理载体DNA，去除其5′端的磷酸基团（3）在连接反应前，用TdT酶在载体分子的3′羟基末端聚合一段同种碱基的寡聚核苷酸27.不同黏性末端的连接有四种类型：（1）待连接的两种DNA分子都具有5′黏性末端（2）待连接的两种DNA分子都具有3′黏性末端，Klenow酶对这种结构没有活性（3）一种DNA分子具有3′端黏性末端，另一种DNA携带5′黏性末端（4）两种DNA分子均含有不同的两个黏性末端。
通常用Klenow酶补平一种DNA分子的5′黏性末端，再用T4-DNA聚合酶切平3′黏性末端的另一端28.细菌转化的全过程包括五个步骤：1、感受态的形成2、转化因子的结合3、转化因子的吸收4、整合复合物前体的形成5、转化因子单链DNA的整合29.受体细胞的选择,通过诱变手段对野生型细菌进行遗传性状改造，使之具备下列条件：（1）限制性缺陷型（2）重组缺陷型（3）转化亲和型（4）遗传互补型（5）感染寄生缺陷型30.细菌受体细胞的转化方法分述如下：（1）Ca2+诱导转化（2）PEG介导的细菌原生质体转化（3）电穿孔驱动的完整细胞转化（4）接合转化（5）λ噬菌体的转染31.转化率是转化（包括感染）效率的评估指标，通常有两种形式表征转化率。
一是在待转DNA分子数大于受体细胞数的条件下，转化细胞与细胞总数之比。
转化率的另一种表示形式是在受体细胞数相对于待转化DNA分子数大大过量时，每微克DNA转化所产生的克隆数32.转化率的影响因素：（1）载体DNA及重组DNA方面：不同载体DNA转化同一受体细胞，其转化率明显不同。
载体分子的空间构想对转化率也有明显的影响，超螺旋结构的载体质粒具有较高的转化率；对于以质粒为载体的重组分子而言相对分子质量大的转化率低（2）受体细胞方面：受体细胞除了具备限制性重组缺陷性状外，还应与所转化的载体DNA性质相匹配（3）转化操作方面：受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大33.基于载体遗传标记的筛选与鉴定：（1）抗药性筛选法（2）营养缺陷型筛选法（3）显色模型筛选法（4）噬菌斑筛选法34.转化子的选择主要是利用抗药性标记或营养缺陷性标记，PUC18/19和PSPORT1这两种质粒除了Lacz′外都含有Ap′选择标记基因。
35.基于克隆片段序列的筛选与鉴定：（1）PCR鉴定法（2）菌落原位杂交法（3）限制性酶切图谱法（4）亚克隆法（5）DNA序列测定法36.菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成千上万个转化子中迅速检测出期望重组子37.最佳探针长度范围为100~1000kb，另外探针内部不能含有大面积的互补序列，否则会直接影响探针与DNA靶序列的杂交38.探针标记有下列几种方法：（1）5′端标记法（2）反转录标记法（3）缺刻前移标记（4）ABC标记法39.DNA的脱氧末端终止测序法的本质是在DNA聚合过程中通过酶促反应的特异性终止进行测序，反应的终止依赖于特殊的反应物2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它们与DNA聚合反应所需的底物2′-脱氧核苷三磷酸（dNTP）结构相同，唯独在其3′位是氢原子而非羟基。
末端终止测序法的操作关键是ddNTP 与dNTP投料比例，两者较为理想的分子比在1:3~1:4之间40.基于外源基因表达产物的筛选与鉴定：（1）蛋白质生物功能检测法（2）放射免疫原位检测法（3）蛋白凝胶电泳检测法41.目的基因克隆的四大战略：（1）鸟枪法P75（2）cDNA法P79（3）PCR扩增法（4）化学合成法42.标准鸟枪法操作程序如下：（1）目的基因组DNA片段的制备：①机械切割②限制性内切酶部分酶解③特定限制性内切酶全酶解（2）外源DNA片段全克隆（3）期望重组子的筛选（4）目的基因的定位43.常规的期望重组子筛选法均可用与cDNA重组克隆的筛选，其中较为理想的首推探针原位杂交法44.报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因，如氯霉素乙酰基转移酶（CAT）等45.含有启动子活性的DNA片段的分离大体上有下列三种方法：（1）鸟枪法克隆（2）酶保护法分离（3）滤膜结合法分离46.应用最广泛的大肠杆菌天然启动子有四种，即Plac、Ptrp、PL、PrecA基因 47.利用可控性的启动子调整外源基因的表达时序，即通过启动子活性的定时诱导，将外源基因的转录启动限制在受体细胞生长循环的某一特定阶段，是克服上述困难的有效方法48.导致异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中不稳定性的主要原因是：（1）大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加工系统（2）大肠杆菌不具备真核生物细胞完善的亚细胞结构以及众多的稳定因子（3）高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，致使蛋白分子间的相互作用增强 49.在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物分子，它们致密的集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种结构称为包含体50.高效表达重组异源蛋白的大肠杆菌所形成的包含体大部分存在于细胞质中，它们基本上由蛋白质组成，其中大部分（占50%以上）是外源基因的表达产物，具有正确的氨基酸序列，但空间构象往往是错误的，因而没有生物活性。
以包含体的形成表达重组异源蛋白，其显著的优点是简化了外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内的分离纯化程序51.包含体的形成机制（1）折叠状态的蛋白质集聚作用（2）非折叠状态的蛋白质集聚作用（3）蛋白质折叠中间体的集聚作用52.包含体的分离主要包括菌体破碎、离心收集、清洗三大操作步骤53.构建融合蛋白表达质粒必须遵循三个原则：（1）受体细菌结构基因应能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化（2）外源基因插在受体菌结构基因的下游区域，并未融合蛋白提供终止密码子（3）当两个蛋白编码序列融合在一起时，外源基因的表达取决于其正确的翻译阅读框架54.融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法和蛋白酶酶促裂解法。