[课件]动物细胞体外培养知识PPT
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1.2.1 动物细胞培养 课件(中图版选修3)
继续培养，此即传代培养。
[思维激活2] 有没有不进行贴壁生长和不存在接触抑制现象 的细胞？若有，试各举一例。 提示 淋巴细胞可以持续在悬浮状态下生长；癌细胞无接 触抑制现象，在适宜条件下可以无限增殖。
3．冻存与复苏 (1)冻存 降低温度 。 保存细胞的措施主要是_________ 一般的低温 ，如哺乳动 a．短期和临时性的保存可以采用___________ 4℃左右 可存活几十天甚至几个月。 物的细胞在_________ 超低温冻存法 ，即将细胞和 b．长期保存细胞一般采用_____________ －196℃的液氮 中进行保存，在超低温环境 保护剂 放入_______________ _______ 最低点 ，近似于“_____” 休眠 状态。 中，细胞的代谢活动降到了_______ (2)复苏 当需要冻存的细胞时，随时将它们取出，迅速放入______ _____中解冻，细胞便会逐渐“_____”过来。
养瓶中会贴壁生长，形成一层细胞，相互接触后停止生长。 克隆培养法培养过程中，仅有极少数细胞的基因型会发生 改变。二倍体细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下 去了。恶性细胞系的细胞具有不死性，可以进行传代培养。
答案
D
归纳提升
动物细胞培养的选材、结果及工具酶
(1)动物细胞培养时，一般选取幼龄动物的组织、器官， 其细胞的分化程度较低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容 易培养。 (2)在动物细胞培养过程中，一般情况下10代以前的细胞
不同组织来源的细胞需要不同的而且也不4适宜的气体环境一般把细胞置于氧气和二氧化碳的气体环境中氧气参与细胞的二氧化碳可以维持培养葡萄糖无机盐维生素核苷酸生长因子需求量955呼吸作用ph课堂互动探究课堂互动探究热点考向示例热点考向示例随堂达标检测随堂达标检测为什么进行动物细胞培养的环境要求无菌无提示离体培养的细胞已失去了对微生物和有毒物质的防御能力一旦受到污染或自身代谢物质积累等有毒物质的侵害细胞就会死亡
动物细胞培养技术ppt课件
常用的排除微生物污染的方法
抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓 度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏 效。
加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的 细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支 原体。
动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或 腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细 胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤 细胞进行培养
2、上皮型细胞：
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同
来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍 生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形， 中有圆形核
生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层— 铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个 活动
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质常 突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细 胞相区别。
4、多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态，可统归于此类。
（二）悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。
(二) 细胞的营养
培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞 营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还 提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一， 含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养 成分 。
其它成分（条75%酒精泡2—3秒钟 （时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再 用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置 平皿中。
高中生物新人教版选择性必修3动物细胞培养(38张)课件
26
2．应用 干细胞与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有 着广泛的应用。
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第2章 细胞工程
27
类型
应用
优点
造血 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起
来源于病人自
干细胞 的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
身的体细胞，
神经 治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕
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第2章 细胞工程
14
③不能用胃蛋白酶处理：由于大多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4, 而胃蛋白酶发挥作用的最适pH为2.0左右，因此不能用胃蛋白酶使细胞 分散开。
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第2章 细胞工程
15
(3)原代培养和传代培养：区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的 对象。 ①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细 胞后进行培养，为原代培养。 ②第二次：细胞培养过程中出现接触抑制现象，用胰蛋白酶使其从瓶壁 上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。
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第2章 细胞工程
36
核心知识小结
4.胚胎干细胞具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一 步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 5.类似胚胎干细胞的一种细胞为诱导多能干细胞(iPS细胞)。
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第2章 细胞工程
37
word部分：
请做：随堂达标检测
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将它移植回病
干细胞 金森病、阿尔茨海默病等)
人体内后，理
可治疗小鼠的镰状细胞贫血，在治疗阿尔茨海
《动物细胞培养技术》课件
动物细胞培养技术可以用于组织工程和再 生医学领域，为损伤或病变的组织和器官 提供替代疗法。
02
动物细胞培养的基本原理
细胞周期与细胞分裂
细胞周期
描述细胞生长和分裂的阶段，包 括间期和分裂期。
细胞分裂
细胞繁殖的方式，包括有丝分裂和 减数分裂。
细胞分裂调控
介绍细胞分裂的调控机制，如周期 蛋白、激酶等。
调整细胞浓度
将分离出的单个细胞调整到合适的浓度。
接种
将调整好的细胞悬液接种到培养容器中，轻轻晃 动容器使细胞均匀分布。
培养
将接种好的容器放置在恒温、恒湿、恒光的培养 箱中培养，定期观察记录细胞的生长情况。
细胞观察与检测
01
02
03
04
形态观察
定期观察细胞的形态变化，如 细胞大小、形态、染色深浅等
。
• 干细胞治疗是一种新兴的治疗方法，利用干细胞的再生和分化能力来修复或替换受损的组织和器官。动物细胞培养技术在 干细胞治疗领域的应用，为干细胞分离、培养和扩增提供了重要的技术支持，有助于推动干细胞治疗的发展。
动物细胞培养技术的发展前景 干细胞治疗领域的应用
药物筛选与毒性测试
药物研发过程中，需要进行大量的药物筛选和毒性测试。动物细胞培养技术可以 模拟人体细胞对药物的反应，为药物筛选和毒性测试提供更为准确和可靠的数据 支持，有助于加速新药的研发进程。
动物细胞培养技术广泛应用于生物医 学、药物研发、食品安全等领域。
培养基是动物细胞培养的关键因素， 它为细胞提供营养、生长因子和适宜 的生存环境。
动物细胞培养技术的外培养动物细胞。
20世纪初，随着组织培养技术 的不断发展，动物细胞培养技术
逐渐成熟。
21世纪初，随着基因编辑技术 的发展，动物细胞培养技术在疾 病治疗、药物研发等领域的应用
《动物细胞组织培养》课件
低温保存
将细胞置于-196℃的液氮中长时间保存。
细胞复苏
从液氮中取出细胞，快速解冻后用培养基培养细胞，使细胞重新生长繁殖。
04
动物细胞组织培养的实验操作
实验准备
培养基制备
准备适宜的动物细胞生 长的培养基，确保培养 基的营养成分、pH值和
渗透压适宜。
细胞来源
确保细胞来源可靠，并 经过必要的消毒和检测
异质性的原因
培养细胞异质性主要与细胞在生长和分化过程中 受到的微环境因素、基因突变等因素有关。
解决异质性的措施
采用标准化操作流程、优化培养条件、选用同质 化细胞系等方法，降低培养细胞的异质性。
动物细胞组织培养的前景展望
动物细胞组织培养在科学研究 、生物工程、医学等领域具有 广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和应用领 域的拓展，动物细胞组织培养 将迎来更多的发展机遇和挑战 。
细胞鉴定
通过形态学观察、免疫荧光等技术对细胞进行鉴定，确保细胞的种类 和来源。注意事项：选择适当的鉴定方法，确保准确性。
细胞观察与记录
定期观察细胞的生长状态、形态变化等，并记录数据。注意事项：保 持观察的连续性和准确性。
实验结果分析
细胞生长曲线绘制
根据观察数据绘制细胞生长曲 线，分析细胞的生长特性和规
律。
细胞形态学分析
观察细胞的形态变化，分析细 胞的分化、凋亡等情况。
基因表达分析
通过PCR、Western blot等技 术分析细胞中特定基因的表达 情况。
细胞功能检测
根据实验目的，对细胞进行特 定的功能检测，如药物筛选、
毒性测试等。
05
动物细胞组织培养的挑战与前景
培养细胞的污染问题
污染来源
将细胞置于-196℃的液氮中长时间保存。
细胞复苏
从液氮中取出细胞，快速解冻后用培养基培养细胞，使细胞重新生长繁殖。
04
动物细胞组织培养的实验操作
实验准备
培养基制备
准备适宜的动物细胞生 长的培养基，确保培养 基的营养成分、pH值和
渗透压适宜。
细胞来源
确保细胞来源可靠，并 经过必要的消毒和检测
异质性的原因
培养细胞异质性主要与细胞在生长和分化过程中 受到的微环境因素、基因突变等因素有关。
解决异质性的措施
采用标准化操作流程、优化培养条件、选用同质 化细胞系等方法，降低培养细胞的异质性。
动物细胞组织培养的前景展望
动物细胞组织培养在科学研究 、生物工程、医学等领域具有 广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和应用领 域的拓展，动物细胞组织培养 将迎来更多的发展机遇和挑战 。
细胞鉴定
通过形态学观察、免疫荧光等技术对细胞进行鉴定，确保细胞的种类 和来源。注意事项：选择适当的鉴定方法，确保准确性。
细胞观察与记录
定期观察细胞的生长状态、形态变化等，并记录数据。注意事项：保 持观察的连续性和准确性。
实验结果分析
细胞生长曲线绘制
根据观察数据绘制细胞生长曲 线，分析细胞的生长特性和规
律。
细胞形态学分析
观察细胞的形态变化，分析细 胞的分化、凋亡等情况。
基因表达分析
通过PCR、Western blot等技 术分析细胞中特定基因的表达 情况。
细胞功能检测
根据实验目的，对细胞进行特 定的功能检测，如药物筛选、
毒性测试等。
05
动物细胞组织培养的挑战与前景
培养细胞的污染问题
污染来源
动物细胞培养ppt课件
培养细胞的分化
❖不适应（Deadaption）
细胞在体内时所拥有的分化特性减 弱或不显。
❖脱分化（Dedifferentiation）
由于基因变异而使细胞失去分化能 力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基 酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
组织培养的分类及基本概念
分类:
1.组织培养(Tissue Culture) 2.细胞培养(Cell Culture) 3.器官培养（Organ Culture）
组织培养的细胞生物学特点:
1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不
完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节 和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生 变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism） 现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、 细胞趋单一化、不死性、恶性状。
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
2) 指 数 生 长 期 （ Logarthmic growth phase）：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指 数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每 1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂 指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、 pH、温度等影响。
培养细胞的生长和增殖
1.原代培养（Primary Culture）阶段：或称 初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次 传代，随不同的组织时间长短不一，一般为 1~4w 2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培 养。也就是细胞系（Cell line）阶段，细胞增 殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。
❖不适应（Deadaption）
细胞在体内时所拥有的分化特性减 弱或不显。
❖脱分化（Dedifferentiation）
由于基因变异而使细胞失去分化能 力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基 酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
组织培养的分类及基本概念
分类:
1.组织培养(Tissue Culture) 2.细胞培养(Cell Culture) 3.器官培养（Organ Culture）
组织培养的细胞生物学特点:
1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不
完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节 和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生 变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism） 现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、 细胞趋单一化、不死性、恶性状。
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
2) 指 数 生 长 期 （ Logarthmic growth phase）：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指 数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每 1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂 指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、 pH、温度等影响。
培养细胞的生长和增殖
1.原代培养（Primary Culture）阶段：或称 初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次 传代，随不同的组织时间长短不一，一般为 1~4w 2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培 养。也就是细胞系（Cell line）阶段，细胞增 殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。
动物细胞的体外培养
PH
大多数细胞在PH =7.4时生长最好，一般6.8 --7.6。
PH指示剂
温度
温度除直接影响细胞生长外，也与培养液的PH值有关。 如：低温时，CO2 溶解多，影响PH值。
粘度
粘度对细胞生长影响较少，但在细胞培养或用胰蛋白酶处
细胞培养的类型
理时，为尽量减少细胞损伤 ，可通过提高培养液粘度来克服。
加羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮 来增加粘度。
酸等。
平衡盐溶液
主要用于稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压 ，提供缓
冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，
提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
抗生素
常用为青霉素和链霉素、两性霉素，以抑制革兰氏阴性菌和阳性
菌的污染。
氢离子缓冲器
FGF 成纤维细胞生长因子 EGF 表皮生长因子
三.培养基的物理性质
表面张力和泡沫
原代培养
表面张力有利于培养物粘着于底物上面。在悬浮培养中， 传代培养 减少泡沫的产生，加防泡沫硅 。
渗透压
细胞的衰退 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有
一定耐受性。
一、细胞原代培养
从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖
一定的代数后（一般10代以内）停止生长。
材料来源之一。
(2)单层细胞培养：
在动物培养中，一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形
成致密的细胞单层。
优点：
①更换新鲜培养液比较容易。一般1-3天换液一次，细胞长成 单层后进行传代 ②可用于观察某些因子对细胞生长的影响 ③容易表达某些产物
（2-3天）
(3)悬浮细胞培养：（1）使细胞呈悬浮状态在培养液中连续生 长（小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞）（2）通过机械搅拌使细胞保 持悬浮状态，选择得到悬浮生长的细胞进行悬浮培养。
大多数细胞在PH =7.4时生长最好，一般6.8 --7.6。
PH指示剂
温度
温度除直接影响细胞生长外，也与培养液的PH值有关。 如：低温时，CO2 溶解多，影响PH值。
粘度
粘度对细胞生长影响较少，但在细胞培养或用胰蛋白酶处
细胞培养的类型
理时，为尽量减少细胞损伤 ，可通过提高培养液粘度来克服。
加羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮 来增加粘度。
酸等。
平衡盐溶液
主要用于稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压 ，提供缓
冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，
提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
抗生素
常用为青霉素和链霉素、两性霉素，以抑制革兰氏阴性菌和阳性
菌的污染。
氢离子缓冲器
FGF 成纤维细胞生长因子 EGF 表皮生长因子
三.培养基的物理性质
表面张力和泡沫
原代培养
表面张力有利于培养物粘着于底物上面。在悬浮培养中， 传代培养 减少泡沫的产生，加防泡沫硅 。
渗透压
细胞的衰退 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有
一定耐受性。
一、细胞原代培养
从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖
一定的代数后（一般10代以内）停止生长。
材料来源之一。
(2)单层细胞培养：
在动物培养中，一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形
成致密的细胞单层。
优点：
①更换新鲜培养液比较容易。一般1-3天换液一次，细胞长成 单层后进行传代 ②可用于观察某些因子对细胞生长的影响 ③容易表达某些产物
（2-3天）
(3)悬浮细胞培养：（1）使细胞呈悬浮状态在培养液中连续生 长（小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞）（2）通过机械搅拌使细胞保 持悬浮状态，选择得到悬浮生长的细胞进行悬浮培养。
《动物体细胞培养》课件
基因编辑与转基因技术
动物体细胞培养可用于基因编辑和转 基因技术的操作，实现基因的敲除、 敲入和转录调控等。
干细胞研究
动物体细胞培养可用于干细胞的研究 ，包括胚胎干细胞和成体干细胞的分 离、扩增和诱导分化等。
动物体细胞培养的历史与发展
历史回顾
动物体细胞培养技术自20世纪50年代发展至今，经历了从简 单培养到复杂培养的过程，技术手段不断改进和完善。
特点
可以获得具有高度相似性和稳定性的 细胞系，用于药物筛选和疾病模型建 立等。
04
动物体细胞培养的挑战与解
决方案
细胞污染问题
总结词
细胞污染是动物体细胞培养中常见的问 题，它会影响实验结果和细胞的健康状 况。
VS
详细描述
细胞污染通常由微生物、支原体、其他细 胞等引起。为了解决这一问题，需要在实 验过程中严格控制环境卫生，定期进行消 毒和检查，以及使用高质量的试剂和耗材 。
动物体细胞培养在生物工程领域的应用前景
总结词
动物体细胞培养在生物工程领域的应用前景 广阔，有助于推动畜牧业、生物制药和生物 材料等领域的发展。
详细描述
通过动物体细胞培养技术，可以生产出具有 特定功能的生物材料和药物，如生长因子、 抗体等。同时，在畜牧业中，动物体细胞培 养技术的应用将有助于提高动物产量和品质 ，降低生产成本。此外，动物体细胞培养还 可以用于基因编辑和基因治疗等领域的研究
发展趋势
随着生物技术的不断发展，动物体细胞培养将朝着更加高效 、安全和可控的方向发展，同时与其他技术的结合将为科学 研究提供更多可能性。
02
动物体细胞培养的基本原理
细胞周期与细胞分裂
细胞周期
描述细胞从一次分裂完成开始， 到下一次分裂完成所经历的全过 程。
新教材高中生物第2章第2节动物细胞工程一动物细胞培养pptx课件新人教版选择性必修3
及应用(生命观念、科学思维、社会责任)
知识导图
课前·新知导学
动物细胞培养的条件
1．动物细胞培养的概念 从动物体中取出相关的组织，将它分散成___单__个__细__胞___，然后在适 宜的培养条件下，让这些细胞___生__长___和___增__殖___的技术。
2．动物细胞培养的条件 (1) 营 养 ： 动 物 细 胞 培 养 所 需 的 营 养 有 ___糖__类____ 、 氨 基 酸 、 无 机 盐、维生素等，将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的 培养基，称为__合__成__培__养__基__。通常需要在培养基中加入__血__清____等一些 天然成分。 (2)无菌、无毒的环境：对_培__养__液___和所有_培__养__用__具___进行无菌处理 以及在_无__菌__环__境___下进行操作。培养液需要__定__期__更__换__，以便清除代谢 物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
5．应用 (1)将正常的__造__血__干__细__胞____移植到病人体内，恢复病人的_造__血___和 免疫功能，用来治疗白血病等疾病。 (2)__神__经__干__细__胞____在治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病方面 (如帕金森病、阿尔茨海默病等)有重要的应用价值。 (3)用___i_P_S_细__胞____治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也 取得了新进展。
(3)温度、pH和渗透压 ①适宜的温度条件：_3_6_._5_℃___±0.5 ℃。 ②适宜的pH条件：__7_.2_～__7_._4__。 ③CO2的主要作用是维持__培__养__液__的__p_H___。
动物细胞培养液中为什么要加动物血清？ _____________________________________。 【答案】血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等物质，而且 还含有多种未知的促生长因子，能促进细胞的生长、增殖
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3、细胞传代操作 （1）先用酒精棉擦拭需要放入超净台的物品，然后将物品 放入超净台进行操作。 （2）无菌取样，通常检测细胞密度、活度、葡萄糖、乳酸 ，根据实验优化等还需要检测其他各项生化指标。 （3）根据预先实验设计的传代密度或者稀释比例来添加新 鲜培养基进行传代，记录代次。 （4）在进行方瓶、滚瓶等大瓶传代时，需要两名实验员密 切配合操作，并由监控员协助进行物品传递等工作。因此 熟练各环节的细节操作对于保证无菌来说非常重要。
2
一、基本概念
1、细胞培养：动植物细胞在体外条件下存活和生长，此 时细胞不再形成组织，主要是指用来生产次生代谢产物为 目的的大规模细胞培养技术。 2、动物细胞体外培养的生长类型：贴附型和悬浮型。 3、动物细胞大规模培养技术：是建立在贴壁培养法和悬 浮培养法的基础上，融合了固定化培养、流式细胞术、生 物反应器技术等而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载 体培养、微囊化培养、中控纤维培养等。
液氮中长期保存。
温度降低原则：达到4度，然后达到-20度冷冻状态，再转移 到-70度，18h后，在液氮中保持。
9
2、细胞复苏操作 （1）登记要取用的细胞。 （2）快速取出细胞放于准备好的37度水浴中，快速溶解 。
（3）将溶解的冻存管细胞离心，根据细胞特性，选择合 适的离心强度。
（4）酒精棉擦拭冻存管后放于超净台，将细胞沉淀用新 鲜培养基重悬后臵于离心管中进行离心。洗涤步骤，去除 DMSO。 （5）细胞用新鲜培养基传入培养瓶中。
化学限定培养基---不含蛋白水解物，均为已知化学结构。
5
三、基本过程
1、从整个操作过程来说包括： （1）细胞小瓶培养---传代操作 （2）细胞大规模培养---转瓶、反应器操作 （3）细胞冻存和复苏---原则
பைடு நூலகம்
2、从细胞生长过程来说包括：
（1）延迟期（潜伏期）---传代初期，细胞增殖缓慢。 （2）指数生长期（对数生长期）---细胞快速繁殖期。 （3）停滞期（平台期）---细胞数量不变， 但仍进行代谢活动，进行分泌表达。
7
五、细胞传代的准备工作
1、无菌操作间的清洁 2、超净工作台的清洁 3、培养器皿的准备：洗刷 包扎、灭菌
4、培养基的配制、除菌过滤及无菌验证
8
六、细胞培养的基本操作
1、细胞冻存操作 冻存细胞：1*107cells/ml*1ml/管 冻存液配制：（培养基：血清：DMSO=7：2：1） 冻存程序：4℃、30~60min -70 ℃、过夜 -20 ℃、1~2h
11
4、生物反应器培养细胞的基本操作流程 （1）反应罐安装、调试电极、管路连接。
（2）反应罐洗刷、灭菌。
（3）检查灭菌管路、连接电极线。
（4）通过取样口抽出罐内灭菌水。
（5）将补料、收料容器连接到反应罐上，接种细胞到罐内。 （6）设定T、DO、STIRR、pH，调节通气管路。 （7）根据实验设计，进行取样，监控密度、活度、葡萄糖等指 标，记录参数变化，适时进行补料、收料无菌操作。
12
5、大规模细胞培养方式简介：
（1）分批式培养：该方式采用机械搅拌式生物反 应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应 器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添 加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当 的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作 方式。
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（2）流加式培养：是在批式培养的基础上，采用 机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以 悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养 基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中 根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓 缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较 高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养 过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或 衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞 和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
（4）衰亡期（凋亡期）---细胞自溶、死亡。
6
四、设施设备及培养器皿
1、设施设备：无菌操作间、超净工作台、CO2培养箱、灭 菌柜、离心机、显微镜、细胞计数板、冰箱、工作台、生 物反应器、电脑等。 2、培养器皿：培养瓶、摇瓶、滚瓶、转瓶、移液管、离 心管等。 3、其它常用物品：酒精灯、镊子、止血钳、纱布、脱脂 棉、胶塞等。
3
二、基本条件
1、无菌无毒的培养环境。
2、恒定适宜的培养温度。
3、合适的气体环境和pH。
4、充足的营养，包括多种氨基酸、维生素、辅酶、 核酸、嘌呤、嘧啶、生长因子。
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细胞培养基介绍
天然培养基---血清 无血清培养基---人工合成化合物，成分确定的培养基， 例如CHO325。 无蛋白培养基---不添加蛋白， 但可能包含动物或植物来源的成分。
动物细胞体外培养知识
基础知识要点
一、动物细胞培养的基本概念 二、细胞培养的基本条件 三、细胞培养的基本过程 四、细胞培养的设施设备及培养器皿 五、细胞传代的准备工作 六、细胞培养的基本操作 七、细胞库 八、大规模细胞培养提高表达量需要解决的问题 及实验方法 九、细胞培养需要注意的问题
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（5）灌流式培养：是把细胞和培养基一起加入反 应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地 将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注 新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于 取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在 反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取 出了部分细胞。
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（3）半连续式培养：又称为重复分批式培养或换 液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮 培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间 隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培 养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变 。
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（4）连续式培养：是一种常见的悬浮培养模式， 采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细 胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期 的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向 生物反应器连续添加新鲜培养基，同时，含有细 胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以 保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限 延续下去。
3、细胞传代操作 （1）先用酒精棉擦拭需要放入超净台的物品，然后将物品 放入超净台进行操作。 （2）无菌取样，通常检测细胞密度、活度、葡萄糖、乳酸 ，根据实验优化等还需要检测其他各项生化指标。 （3）根据预先实验设计的传代密度或者稀释比例来添加新 鲜培养基进行传代，记录代次。 （4）在进行方瓶、滚瓶等大瓶传代时，需要两名实验员密 切配合操作，并由监控员协助进行物品传递等工作。因此 熟练各环节的细节操作对于保证无菌来说非常重要。
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一、基本概念
1、细胞培养：动植物细胞在体外条件下存活和生长，此 时细胞不再形成组织，主要是指用来生产次生代谢产物为 目的的大规模细胞培养技术。 2、动物细胞体外培养的生长类型：贴附型和悬浮型。 3、动物细胞大规模培养技术：是建立在贴壁培养法和悬 浮培养法的基础上，融合了固定化培养、流式细胞术、生 物反应器技术等而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载 体培养、微囊化培养、中控纤维培养等。
液氮中长期保存。
温度降低原则：达到4度，然后达到-20度冷冻状态，再转移 到-70度，18h后，在液氮中保持。
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2、细胞复苏操作 （1）登记要取用的细胞。 （2）快速取出细胞放于准备好的37度水浴中，快速溶解 。
（3）将溶解的冻存管细胞离心，根据细胞特性，选择合 适的离心强度。
（4）酒精棉擦拭冻存管后放于超净台，将细胞沉淀用新 鲜培养基重悬后臵于离心管中进行离心。洗涤步骤，去除 DMSO。 （5）细胞用新鲜培养基传入培养瓶中。
化学限定培养基---不含蛋白水解物，均为已知化学结构。
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三、基本过程
1、从整个操作过程来说包括： （1）细胞小瓶培养---传代操作 （2）细胞大规模培养---转瓶、反应器操作 （3）细胞冻存和复苏---原则
பைடு நூலகம்
2、从细胞生长过程来说包括：
（1）延迟期（潜伏期）---传代初期，细胞增殖缓慢。 （2）指数生长期（对数生长期）---细胞快速繁殖期。 （3）停滞期（平台期）---细胞数量不变， 但仍进行代谢活动，进行分泌表达。
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五、细胞传代的准备工作
1、无菌操作间的清洁 2、超净工作台的清洁 3、培养器皿的准备：洗刷 包扎、灭菌
4、培养基的配制、除菌过滤及无菌验证
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六、细胞培养的基本操作
1、细胞冻存操作 冻存细胞：1*107cells/ml*1ml/管 冻存液配制：（培养基：血清：DMSO=7：2：1） 冻存程序：4℃、30~60min -70 ℃、过夜 -20 ℃、1~2h
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4、生物反应器培养细胞的基本操作流程 （1）反应罐安装、调试电极、管路连接。
（2）反应罐洗刷、灭菌。
（3）检查灭菌管路、连接电极线。
（4）通过取样口抽出罐内灭菌水。
（5）将补料、收料容器连接到反应罐上，接种细胞到罐内。 （6）设定T、DO、STIRR、pH，调节通气管路。 （7）根据实验设计，进行取样，监控密度、活度、葡萄糖等指 标，记录参数变化，适时进行补料、收料无菌操作。
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5、大规模细胞培养方式简介：
（1）分批式培养：该方式采用机械搅拌式生物反 应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应 器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添 加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当 的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作 方式。
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（2）流加式培养：是在批式培养的基础上，采用 机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以 悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养 基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中 根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓 缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较 高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养 过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或 衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞 和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
（4）衰亡期（凋亡期）---细胞自溶、死亡。
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四、设施设备及培养器皿
1、设施设备：无菌操作间、超净工作台、CO2培养箱、灭 菌柜、离心机、显微镜、细胞计数板、冰箱、工作台、生 物反应器、电脑等。 2、培养器皿：培养瓶、摇瓶、滚瓶、转瓶、移液管、离 心管等。 3、其它常用物品：酒精灯、镊子、止血钳、纱布、脱脂 棉、胶塞等。
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二、基本条件
1、无菌无毒的培养环境。
2、恒定适宜的培养温度。
3、合适的气体环境和pH。
4、充足的营养，包括多种氨基酸、维生素、辅酶、 核酸、嘌呤、嘧啶、生长因子。
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细胞培养基介绍
天然培养基---血清 无血清培养基---人工合成化合物，成分确定的培养基， 例如CHO325。 无蛋白培养基---不添加蛋白， 但可能包含动物或植物来源的成分。
动物细胞体外培养知识
基础知识要点
一、动物细胞培养的基本概念 二、细胞培养的基本条件 三、细胞培养的基本过程 四、细胞培养的设施设备及培养器皿 五、细胞传代的准备工作 六、细胞培养的基本操作 七、细胞库 八、大规模细胞培养提高表达量需要解决的问题 及实验方法 九、细胞培养需要注意的问题
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（5）灌流式培养：是把细胞和培养基一起加入反 应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地 将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注 新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于 取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在 反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取 出了部分细胞。
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（3）半连续式培养：又称为重复分批式培养或换 液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮 培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间 隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培 养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变 。
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（4）连续式培养：是一种常见的悬浮培养模式， 采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细 胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期 的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向 生物反应器连续添加新鲜培养基，同时，含有细 胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以 保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限 延续下去。