实验十一 食品中黄曲霉毒素B1的检测
实验十一-食品中黄曲霉毒素B1的检测
4．植物油：
用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移 于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶 液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油 4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再 加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲 醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液 重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下 按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。
二、实验原理：
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉 毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应， 多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入 酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。
三、仪器与试剂
（一）试剂盒组成 1、 AFB1抗原包被16孔×6条形带框酶标板； 2、抗体； 3、酶标二抗； 4、空白对照液； 5、底物（1mg×4）； 6、底物液A； 7、底物液B； 8、终止液； 9、PBS一T洗液； 10、一次性手套。 （二）仪器 1、酶标仪； 2、离心机。
5．其它食品：可按照G8 5009有关章节提供的方法操 作，最终提取物（相当于4.0g样 品）应收集于2.0m1 甲醇一PBS(20＋80)中。
（二）样品测定
1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）； 底物液A: 9mI蒸溜水稀释（1:9）； 抗体: 7.0mL洗液稀释（1:140）； 酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）； 阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻
3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）：
样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确 加人100.0mL甲醇水(55 ＋45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封 严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于 125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧 杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏 斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现 象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加 5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一 并于蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。
对食品中黄曲霉毒素B1的检测方法及分析
２０１０ ＮＯ．２３S c i enc e a nd T ech n ol o gy I nno v at i on Her a l d研 究 报 告1 黄曲霉毒素B t测定原理与步骤方法在食品中黄曲霉毒素B1检测方法很多,有些样品如薯类及部分酱料、油类样品受样品杂质干扰的影响,因而使方法的灵敏度降低。
目前通常采用双向展开法,可以提高了检测方法的灵敏度,如测定了一份薯类样品,按灵敏度由原法的25ppb提高到5ppb,同时测定了含杂质较多的花生油、酱油及曲种等样品,情况亦是如此。
而原法灵敏度为5ppb的样品(如花生及部分花生油样品等)用双向展开法展开,其灵敏度亦可以进一步提高,有的可提高到1.25ppb。
今将双向展开法的原理及操作步骤介绍如下。
1.1原理因无水乙醚不能推动黄曲霉毒素B-(以下简称B。
)。
在用乙醚将薄层板横展时,可以把干扰的杂质推到样品点的旁边,而不像用乙醚纵展时,有时在样品的过道中留有部分杂质的底色。
在乙醚横展后再用丙酮:氯仿纵展,可以使样品在B1标准点相应处的杂质底色大量的减少.从而提高了原有方法的灵敏度。
1.2试剂(补充的)无水乙醚,分析纯,在无水乙醚中加入少许无水硫酸钠贮存。
1.3操作步骤主要补充双向展开法的操作步骤,其它参照B1测定法。
1.3.1滴加方法由于在具体测定条件下,用无水乙醚展开后Bt仍有很少的移动(因无水乙醚中含微量的水或醇以及空气中的湿度太大等均可以使B,移动),因此在滴加时必需同时滴加两块层析板。
在一块5×20cm的薄层板上距下端3cm的基线上滴加以下两个点:第1个点离左边边距0.8～1cm处滴加B。
标准液Ⅲ(0.04微克/毫升)10微升;第2个点离第一个点的间隔距离约1.8～2.0cm处滴加样液20微升。
在另一块上的滴加样式完全与第一块相同,祗在第二个样品点上再滴加B1标准液Ⅲ0.04(微克/毫升)10毫升。
1.3.2展开方法①横展:在展开槽内的长边放置玻璃支架一个,再加无水乙醚10毫升。
食品中黄曲霉毒素B1的测定
实验六食品中黄曲霉毒素B1的测定一、实验目的与要求学习薄层层析法测定粮食中黄曲霉毒素B1原理及步骤。
二、实验原理样品中AFT B1经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后,在波长365nm紫外光下产生荧光,根据其在薄层板上显示荧光的强度与标准品AFT B1最低检出量产生的荧光强度比较来测定样品中AFT B1的含量。
三、实验仪器与试剂仪器:玻璃板:5×20cm;涂布器;色谱展开槽(25×6×4cm);紫外光灯: 100-125W,带有波长365nm滤光片;微量注射器:20uL,10uL各一支试剂:三氯甲烷(AR);正己烷(AR 沸程30-60)或石油醚(沸程60-90);甲醇(AR);苯(AR);乙腈(AR);无水乙醚(AR);丙酮(AR)。
(以上试剂应重蒸,并应经检验对薄层色谱测定无干扰)苯-乙腈(98:2)混合溶液;甲醇-水(55:45)混合溶液;三氟乙酸(AR);氯化钠(AR);无水硫酸钠(AR);硅胶G(薄层色谱用)。
5%次氯酸钠溶液:称取100g漂白精,加入500mL水,搅匀。
另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3.10H2O)溶于500mL温水中,倒入上述溶液中,搅匀,澄清过滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中,用作消毒剂。
黄曲霉毒素B1标准贮备液:用百万分之一的微量分析天平精密称取1-1.2mgAFT B1标准品,先加入2mL乙腈溶解后,再用苯稀释至100mL,避光置于4℃冰箱中保存。
使用前用紫外分光光度计测定其浓度,再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10ug/mL。
(在350nm测定AFT B1的苯-乙腈溶液的吸光度,其摩尔消光系数为19800,可根据朗伯-比尔定律求出其浓度)。
黄曲霉毒素B1标准应用液I(1ug/mL):吸取1.0mL10ug/mL的黄曲霉毒素B1标准贮备液于10mL容量瓶中,加苯-乙腈混合溶液定容。
黄曲霉毒素B1标准应用液II(0.2ug/mL):吸取1.0mL 1ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液I于5mL容量瓶中,加苯-乙腈混合溶液定容。
食品中黄曲霉毒素B1 检测方法研究
仪，主要包含了传感和自动化识别两大系统。由于综合应用 质也可能会产生影响，降低或增加待测信号，形成基质效
了数学、物理、材料、神经及生理等诸多理论，能迅速完成 应。原因主要是生物样品中内源性成分的存在或融入样品
复杂气味和气体的识别，通过气味数学模型的构建及应用， 前处理中的外源性成分的影响。所以在样品本身、基质及
关键词：食品；黄曲霉毒素 B1；检测方法
当前，人们高度重视食品安全问题，在探索和研究各类 障人们的身体健康。
食品安全检测方法方面已取得了瞩目成果。黄曲霉毒素 B1 的毒性和致癌性极强，通过污染粮食作物及其制品从而对人
畜健康构成威胁，需高度重视其检测工作的开展。基于此，
本文介绍了几种用于检测食品中黄曲霉毒素 B1 的方法。 1 食品中黄曲霉毒素 B1 检测重要性
优势
劣势
电子鼻法
响应时间短、检测速度快，测定评估范围广，能避免人为误差， 无法识别分子水平上单个可挥发物标志物
重复性好
高效液相色谱 - 质谱联用法
重现性好、灵敏度高
程序烦琐、检测周期长、成本较高
时间分辨荧光免疫分析法
操作流程短、有效期长、灵敏度高、检测便捷、 试剂盒昂贵
食品科技
食品中黄曲霉毒素 B1 检测方法研究
王 媛
（连云港市赣榆区综合检验检测中心，江苏连云港 222100）
金标免疫层析法检测黄曲霉毒素b1的方法
金标免疫层析法检测黄曲霉毒素B1的方法1.引言黄曲霉毒素B1是一种广泛存在于食品、饲料中的毒素，对人体和动物健康造成严重威胁。
对黄曲霉毒素B1进行有效的检测至关重要。
金标免疫层析法作为一种快速、准确并且易于使用的检测方法，被广泛应用于食品安全和质量控制领域。
本文将就金标免疫层析法检测黄曲霉毒素B1的方法进行探讨，并提供深度和广度兼具的分析，以期帮助您更全面地了解这一检测技术。
2.金标免疫层析法的原理金标免疫层析法是一种基于抗体和抗原之间特异性识别和结合原理的检测方法。
简单来说，它利用了抗体对特定分子的高度特异性识别能力，通过在复杂样品中将目标分子与标记有金纳米颗粒的抗体结合，从而实现对目标分子的定量和定性检测。
金标免疫层析法具有操作简便、快速灵敏、不需要仪器设备等特点，因此在食品安全领域得到了广泛的应用。
3.黄曲霉毒素B1的特性和对人体健康的危害黄曲霉毒素B1是一种热稳定性很强的毒素，它容易在食品和饲料中积累。
长期摄入受污染的食品或饲料会导致人类和动物出现急性或慢性中毒，表现为呕吐、腹泻、免疫抑制等严重症状，甚至可能导致肝癌等疾病的发生。
对黄曲霉毒素B1的检测至关重要，金标免疫层析法作为一种快速、敏感的检测方法，能够有效地帮助人们及时发现并控制食品中的黄曲霉毒素B1污染。
4.金标免疫层析法检测黄曲霉毒素B1的步骤金标免疫层析法检测黄曲霉毒素B1的步骤通常包括样品制备、抗体标记金纳米颗粒、检测纸条制备和数据读取等。
将样品进行处理，提取其中的黄曲霉毒素B1，并将其与标记有金纳米颗粒的抗体结合。
将混合物加载到检测纸条上，金标免疫层析法会在纸条上形成不同程度的色带，根据色带浓度的变化可以判断出样品中黄曲霉毒素B1的含量。
通过专门的读取设备或者肉眼观察检测纸条上色带的变化来获得测试结果。
5.金标免疫层析法的优势金标免疫层析法作为一种快速、准确、便捷的检测方法，具有以下几点优势。
它无需昂贵的仪器设备，操作简便，使用者无需专业的技术背景即可进行检测。
高效液相色谱法检测农产品中黄曲霉毒素B1的含量
分析检测高效液相色谱法检测农产品中黄曲霉毒素B1的含量韩 宇（四川省甘孜藏族自治州食品药品检验所，四川康定 626000）摘 要：目的：建立高效液相色谱法联合免疫磁固相萃取法测定农产品食品中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）含量的分析方法。
方法：采用70%乙腈溶液提取花生、玉米、大豆、小麦、豌豆和绿豆样品中的AFB1，然后利用免疫磁珠净化、萃取和富集提取液中的AFB1，采用高效液相色谱法进行定量分析。
结果：方法的检出限为0.03～0.92 μg·kg-1，回收率为79.52%～97.53%。
利用该方法对市场上购买的20份花生、玉米、大豆、小麦、豌豆、绿豆样品中的AFB1进行检测，除了玉米和绿豆中未检测出AFB1外，其余实验样品中均检测出一定含量的AFB1。
结论：该方法简便、快速、准确，适用于复杂样品中黄曲霉毒素B1的测定。
关键词：高效液相色谱法；免疫磁固相萃取；黄曲霉毒素B1Determination of Aspergillus Flavus B1 in Agricultural Products by High-Performance Liquid ChromatographyHAN Yu(Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Institute for Food and Drug Control, Kangding 626000, China)Abstract: Objective: To establish a method for the determination of Aflatoxin B1 (AFB1) in agricultural products by high performance liquid chromatography combined with immunomagnetic solid phase extraction. Method: AFB1 was extracted from samples of peanuts, corn, soybeans, wheat, peas, and mung beans using a 70% acetonitrile solution, and then AFB1 was purified, extracted and enriched by immunomagnetic beads, and quantitative analysis was performed by HPLC. Result: The limits of detection were 0.03～0.92 μg·kg-1, and the recoveries were 79.52%～97.53%. AFB1 in 20 samples of peanut, corn, soybean, wheat, pea and mung bean purchased from the market was detected by this method. AFB1 content was detected in all the other samples except corn and mung bean. Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and suitable for the determination of aflatoxin B1 in complex samples.Keywords: high-performance liquid chromatography; immunomagnetic solid-phase extraction; aspergillus flavus B1黄曲霉毒素是一种由黄曲霉菌产生的有毒代谢产物，在自然界中分布广泛，在粮食和饲料等农产品中广泛存在。
生鲜乳中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定 液相色谱-柱后光化学衍生法山东标准2020版
生鲜乳中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定液相色谱-柱后光化学衍生法警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。
该区域应避光(阳光)，具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。
在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。
1 范围本标准规定了测定生鲜乳中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2含量的液相色谱-柱后光化学衍生测定方法。
本标准适用于生鲜乳中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的定量测定。
本标准方法的检出限：黄曲霉毒素B1为0.002 μg/kg，黄曲霉毒素B2为0.002 μg/kg，黄曲霉毒素G2为0.002 μg/kg，黄曲霉毒素G1为0.002 μg/kg，黄曲霉毒素M1为0.005 μg/kg，黄曲霉毒素M2为0.002 μg/kg；本标准方法的定量限：黄曲霉毒素B1为0.006 μg/kg，黄曲霉毒素B2为0.005 μg/kg，黄曲霉毒素G2为0.005 μg/kg，黄曲霉毒素G1为0.006 μg/kg，黄曲霉毒素M1为0.015 μg/kg，黄曲霉毒素M2为0.006 μg/kg。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理试样中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2用甲醇溶液提取，提取液经黄曲霉素毒素免疫亲和柱净化、富集，用高效液相色谱分离后经柱后光化学衍生，荧光检测器检测，外标法定量。
4 试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水为GB/T 6682中规定的一级水。
4.1 甲醇：色谱纯。
4.2 乙腈：色谱纯。
4.3 甲醇水溶液：取50 mL甲醇，加入50 mL纯水，混合均匀。
4.4 流动相：乙腈+水=20+80。
我国粮食中黄曲霉毒素B1的污染情况及检测方法研究
123食品安全黄曲霉毒素毒性强，且不易分解，能损伤人的肝脏，临床表现有胃部不适、食欲减退、恶心呕吐、腹胀及肝区触痛等。
本文详述了目前我国各类粮食中黄曲霉毒素B1的污染情况及其对人们的危害，并就目前世界上检测黄曲霉毒素B1的方法进行了总结。
一、黄曲霉毒素概述及产生条件黄曲霉毒素（AFT）是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，在其20多种衍生物中，黄曲霉毒素B1的毒性最大、致癌性最强。
黄曲霉毒素及其产生菌在自然界中分布广泛，有些菌株产生不止一种类型的黄曲霉毒素，在黄曲霉中也有不产生任何类型黄曲霉毒素的菌株。
人类健康受黄曲霉毒素的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物。
黄曲霉毒素的产生需要特定的条件，不同的玉米植株产毒能力差异很大，除基质以外，温度、湿度、空气均是黄曲霉毒素生长繁殖及产毒的必要条件。
据文献记载，黄曲霉毒素最佳生长条件为33-38℃、pH为5.0、Aw（水分活性）为0.99，其中，温度在24-28℃之间、相对湿度在80%以上，黄曲霉菌产毒量最高。
所以南方及温湿地区在春夏两季极易发生黄曲霉毒素中毒事件，甚至粮食在收获前或收获期就可能已经被黄曲霉毒素污染。
二、粮食中黄曲霉毒素的污染情况1.稻谷中黄曲霉毒素的污染情况。
作为我国人民的第一大口粮作物，稻谷在储存过程中由于储备条件不理想，可能导致黄曲霉毒素的滋生。
笔者对辽宁境内某粮库100份入库时未检测出黄曲霉毒素的储备了两年的稻谷进行了筛查，其中有13份样品检测出黄曲霉毒素。
2.玉米中黄曲霉毒素的污染情况。
玉米是我国第二大作物，也是目前饲料产品的最主要原料。
我国南方高温高湿的天气极易造成黄曲霉毒素污染，尤其梅雨季节更为黄曲霉毒素提供了滋生的温床。
相反北方低温、干燥的天气，更适宜玉米的储存。
3.小麦中黄曲霉毒素的污染情况。
小麦鲜叶中一般不我国粮食中黄曲霉毒素B1的污染情况及检测方法研究含黄曲霉毒素。
针对国标规定，小麦、面粉、发酵食品（酱油、食用醋、豆豉、腐乳制品）等的黄曲霉毒素含量应小于等于5μg/kg。
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八、思考题
1、简述ELISA方法定量检测黄曲霉毒素B1的 原理？ 2、实验对样品进行前处理的作用？ 3、影响检测准确性主要有哪些因素？ 4、酶标仪操作过程要注意些什么？
二、实验原理：
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉 毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应， 多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入 酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量。
三、仪器与试剂
（一）试剂盒组成 1、 AFB1抗原包被16孔×6条形带框酶标板； 2、抗体； 3、酶标二抗； 4、空白对照液； 5、底物（1mg×4）； 6、底物液A； 7、底物液B； 8、终止液； 9、PBS一T洗液； 10、一次性手套。 （二）仪器 1、酶标仪； 2、离心机。
2、抗体抗原反应 将抗体与等量样品提取液（溶液为甲醇一PBS）在玻 璃试管内混合振荡后室温 静置15分钟。启封酶标板， 用洗液2×3分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当 孔位加入此抗体抗原反应液及空白对照液（3孔）和阴 性对照液（3孔）,130μl／孔,37℃湿盒中孵育（或加 盖以保持相对湿度），2小时后，倒掉反应液并拍干, 用洗液3×3分钟洗板，拍干。 3、酶标记反应 加入酶标二抗，100μl／孔，37℃盒中孵育1小时后， 用洗液5×3分钟洗板，拍干。 4、显色反应 lmg底物十2.5m1底物液A ＋42μl底物液B，待底物充 分溶解后加入酶标板，100μl／孔，37℃15分钟后加 终止液40μl／孔。 5、测定 酶标仪490nm测定各孔0.D值。
4．植物油： 用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移 于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45） 溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼 油4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗 再加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层 甲醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶 液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以 下按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 5．其它食品：可按照G8 5009有关章节提供的方法操 作，最终提取物（相当于4.0g样 品）应收集于2.0m1 甲醇一PBS(20＋80)中。来自七、注意事项及说明
1、带手套操作。酶标板用后处理，不能重复使用。样 品提取过程中用过的玻璃仪器需要重复使用时，应作 解毒处理后,再洗涤。 2、操作时应手持酶标板板框，避免液体等沾污板底部， 以保持酶标洁度。 3、试剂盒如需分次使用，应在每次使用前根据用量稀 释试剂，每次用多少稀释多少，剩下的酶标板和试剂， 应及时封存，4℃保存备用。如需保存较长时间则应20℃保存。 但反复冻融后，将导致抗体效价下降。 4、结果判定：根据参考资料三：现行国家食品（饲料） 卫生标准中规定的AFB1允许量标准对检测样品AFB1 污染程度进行判定。 5、具体分析还要根据试剂盒的具体要求。
（二）样品测定
1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）； 底物液A: 9mI蒸溜水稀释（1:9）； 抗体: 7.0mL洗液稀释（1:140）； 酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）； 阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻 璃试管内混合振荡后静置。
五、数据处理及计算结果
1、求出各孔的0.D校正值：0.D校正值＝O.D 实测值一空白对照孔0.D值（均值）。 2、求出待测样的0.D％值：0.D％＝[O.D校正 值/阴性对照孔0.D校正值（均值）］ × 100％。 3、求出待测样AFB1含量（ng／g）：在标准 竞争抑制曲线上找到待测样0.D％值（座标Y 值）的对应点，该点座标X值的反对数（10x） 即为样品中AFB1的含量（ng／g）
四、实验步骤
（一）样品中AFB1的提取 1． 大米和小麦（脂肪含量＜3.0％）： 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250m1具塞 锥形瓶中。准确加人60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封 严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过 滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液（相当4.0g样品） 于75mL蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用2.0mL甲 醇一PBS (20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL） 溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振 荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。
2. 玉米（脂肪含量3.0～5.0％）： 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准 确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后 滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分 液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取 10.0mL （相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按上述“65℃ 水浴通风挥干”起，依法操作。 3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）： 样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确 加人100.0mL甲醇水(55 ＋45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封 严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于 125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧 杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏 斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现 象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加 5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一 并于蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。
六、使用进口试剂盒检测的主要实验步骤
1、样品提取：取5.0g样品与锥形瓶中，加入70％甲醇 25ml，振摇3min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放 出下层的甲醇水提取液，即为样品提取液。（亦可根 据样品中黄曲霉毒素含量进行适当稀释为待测样液） 2、免疫反应：红色微孔中加入蓝色试剂100μl，分别加 入标准品和样品各100μl，三次混匀，移100μl到白色 抗体孔，摇匀，室温反应10min，弃去液体，用去离 子水洗5次，用吸水纸扣干。 3、显色反应：加入绿色试剂100μl，摇匀，室温反应 10min，加入红色试剂100μl，终止反应。 4、结果检测：在450nm处用酶标仪检测。
实验二十、食品中黄曲霉毒素B1的检测
标准依据: GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测 定
一、实验目的与要求：
1、学习酶联免疫(ELISA)方法测定粮食及食品中黄曲 霉毒素B1的实验原理，掌握实验的操作要点及测定方 法 2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理，正确熟练使用 酶标仪。