(优选)分子生物学实验原理与常见问题解答
分子生物学大实验习题及解答(精)
分子生物学大实验习题及解答一、名词解释1、genome；2、基因芯片；3、持家基因；4、Operon；5、感受态细胞；6、逆转录酶；7、PCR技术；8、转化；9、重组DNA技术；10、基因沉默；11、hnRNA；12、复制子；13、反义RNA；14、衰减子；15、拟基因；16、RNA编辑；17、颠换；18、拓扑异构酶；19、变性；20、转座子二、基础理论单项选择题1、DNA连接酶的作用为（）A、合成RNA引物B、将双螺旋解链C、去除引物、填补空隙D、使双螺旋DNA链缺口的两个末端连接2、DNA复制中RNA引物的主要作用是( )。
A、引导合成冈奇片段B、作为合成冈奇片段的模板C、为DNA合成原料dNTP 提供附着点D、激活DNA聚合酶3、下列哪一种蛋白不是组蛋白的成分（）A、 H1B、H2A 、H2BC、 H3、H4D、 H54、DNA的变性：（）A、包括双螺旋的解旋B、可以由低温产生C、是可逆的D、是磷酸二酯键的断裂5、转录需要的原料是:（）A、 dNTPB、 dNDPC、 dNMPD、 NTP6、在原核生物复制子中以下哪种酶除去RNA引发体并加入脱氧核糖核甘酸：A、DNA聚合酶ⅢB、 DNA聚合酶ⅡC、DNA聚合酶ⅠD、外切核酸酶MFl7、下真核生物复制起始点的特征包括（）A、富含GC区B、富含AT区C、 Z DNAD、无明显特征8、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（）A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同B、分子大小不同C、分子极性不同D、溶解度不同9、DNA复制时不需要以下哪种酶？（）A、 DNA指导的DNA聚合酶B、RNA指导的DNA聚合酶C、拓扑异构酶D、连接酶10、1、证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是：肺炎链球菌在老鼠体内的毒性和T2噬菌体感染大肠杆菌。
这两个实验中主要的论点证据是：（）A、从被感染的生物体内重新分离得到DNA，作为疾病的致病剂B、DNA突变导致毒性丧失C、生物体吸收的外源DNA（而并非蛋白质）改变了其遗传潜能D、DNA是不能在生物体间转移的，因此它一定是一种非常保守的分子11、利用自己的位点专一重组酶把自己从寄主基因组中的一个地方移到另一个地方的遗传元件叫（）A、启动子B、转座子C、T-DNAD、顺反子12、原核DNA合成酶中（）的主要功能是合成前导链和冈崎片段A、DNA聚合酶ⅠB、DNA聚合酶ⅡC、DNA聚合酶ⅢD、引物酶13、在基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒以便于重组和筛选。
分子生物学实验中常见的问题与对策-9
分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。
2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。
3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。
4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。
另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。
5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。
对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。
6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。
7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。
9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。
10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。
PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。
2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。
另外，不要使⽤过多菌体。
经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。
分子生物学实验常见问题分析及对策
分子生物学实验常见问题分析及对策-141、Southern杂交技术成败主要取决于哪两个因素？答：Southern杂交技术的成败主要取决于两个因素：首先，用于探针的DNA纯度要高，否则影响特异性。
其次是探针DNA的放射性比强度要高，因为增加放射性强，可提高检测水平。
2、Southern杂交技术中的DNA的消化和电泳有哪些注意点？答：①选择的限制性内切酶应提供某种信息，通常消化前DNA中间长度至少应该三倍于消化产生的DNA 中间长度；②高分子的DNA容易造成消化不均匀，所以要用大体系酶切；而若酶切体系太大，消化后不方便上样，则可以对DNA进行浓缩，用乙醇沉淀DNA；③电泳电泳前，除乙醇，并且70℃水浴，这样也可以破坏限制性片段黏性末端之间的碱基配对；④消化后的DNA可以在4℃保存，但是电泳加样前需加热至56℃2~3分钟，破坏黏性末端碱基对；⑤酶切后，电泳上样前最好通过荧光测量法测DNA消化产物的浓度；⑥电泳前要保证DNA分散均匀，并且若是大分子量的DNA，要用大口径吸头吸取；⑦过夜电泳，低电压慢迁移率；⑧电泳后将凝胶用溴化乙锭染色，读胶，用透明荧光尺读取迁移距离；⑨电泳后的凝胶可以再4℃保存，但是不可超过一天。
3、Southern杂交技术中的膜转移有哪些注意点？答：①凝胶、膜、吸水纸大小要适中，差不多大，不能太大，防止造成短路。
并且各层之间不能有气泡；②凝胶、膜都要做好标记，不能搞混；③转膜前要对凝胶中DNA片段进行变性、洗涤等工作，若目的DNA片段大于15kb，则变形前还要进行短暂脱嘌呤处理，使DNA产生缺口，提高转移效率；④不带电膜需用中性缓冲液，同时凝胶经变性后需用中性缓冲液洗涤；若是带点膜需用碱性缓冲液，则凝胶可直接进行转移，不需要变性。
4、Southern杂交技术中杂交部分的主要因素有哪些，分别有什么关系？答：杂交步骤中主要因素有膜上的DNA量、探针量以及结合效率等；杂交的灵敏度可达到0.1pg，杂交信号强度与探针特异性活性呈正比，与探针长度呈反比。
分子生物学习题库与参考答案
分子生物学习题库与参考答案一、单选题（共49题，每题1分，共49分）1.可以实现体细胞克隆的技术是:A、基因编辑B、聚合酶链式反应C、诱导多能干细胞D、体细胞核移植正确答案：D2.在PCR反应中,引物与模板的结合温度约为:A、37°CB、55°CC、72°CD、95°C正确答案：B3.大肠杆菌对于基因克隆的主要作用是:A、提供连接酶B、合成引物C、表达目的蛋白D、作为宿主正确答案：D4.将单链DNA合成双链的酶是:A、连接酶B、DNA聚合酶C、裂解酶D、RNA聚合酶正确答案：B5.可以增加靶标DNA拷贝数的技术是:A、PCRB、电泳C、测序D、印迹杂交正确答案：A6.在Southern杂交中起探针作用的是:A、DNAB、RNAC、载体D、引物正确答案：A7.编码氨基酸顺序信息的DNA序列称为:A、启动子B、基因C、外显子D、启动密码子正确答案：B8.可以自我复制的核酸是:A、mRNAB、rRNAC、tRNAD、miRNA正确答案：B9.DNA聚合酶在PCR反应过程中不需要的元素是:A、铜离子B、镁离子C、锰离子D、钾离子正确答案：A10.启动子序列通常位于:A、转录起始点上游B、编码区C、基因内含子D、终止子上游正确答案：A11.可以直接导入植物细胞的方法是:A、阳离子脂质体法B、农杆菌法C、微粒射击法D、电穿孔法正确答案：B12.DNA的组成单位是:A、氨基酸B、核苷酸C、核糖D、脱氧核糖正确答案：B13.农杆菌可以将T-DNA转入植物细胞的原因是:A、具有连接酶B、具有限制性内切酶C、具有转座子D、可以与植物细胞膜融合正确答案：C14.DNA测序中的Sanger方法利用了:A、引物延伸终止B、核酸杂交C、蛋白质切割D、荧光标记正确答案：B15.可以用于克隆目的基因的载体是:A、慢病毒B、质粒C、线性DNA分子D、mRNA正确答案：B16.属于真核生物的模型生物是:A、小鼠B、酵母C、果蝇D、以上所有正确答案：D17.可以将质粒DNA转入宿主细胞的是:A、限制性内切酶B、DNA连接酶C、显微注射器D、电穿孔仪正确答案：C18.可以直接将外源基因导入植物细胞的是:A、电穿孔法B、微注射法C、生物炮法D、农杆菌法正确答案：D19.检测蛋白质的方法不是:A、Western印迹B、质谱C、Northern印迹D、免疫印迹正确答案：C20.对DNA进行切割的酶类包括:A、分裂酶B、连接酶C、制限酶D、聚合酶正确答案：C21.可以直接检测蛋白质的方法是:A、PCRB、Northern blotC、Western blotD、Southern blot正确答案：C22.提供能量驱动翻译反应的化学键是:A、糖苷键B、磷酸酯键C、硫磷键D、氢键正确答案：B23.编码线粒体蛋白质的基因主要位于:A、细胞质DNAB、线粒体DNAC、细胞核DNAD、质粒DNA正确答案：B24.下列DNA酶类能切断磷酸二酯键的是:A、连接酶B、DNA聚合酶C、替代酶D、制限酶正确答案：D25.在制备重组DNA时,使用琼脂糖的目的是:A、提供营养B、连接DNA段C、物理分离片段D、催化连接反应正确答案：C26.是mRNA而不是tRNA或rRNA的特征是:A、可翻译成蛋白质B、可与核糖体结合C、含有多肽链D、富含无义密码子正确答案：A27.对蛋白表达的后翻译调控方式是:A、剪接体B、RNA编辑C、蛋白质水解D、磷酸化正确答案：C28.编码tRNA的基因位于:A、线粒体B、核糖体C、细胞核D、细胞质正确答案：C29.单克隆抗体技术利用的真核细胞是:A、诱导的多能干细胞B、杆状病毒感染的淋巴细胞C、转化的肿瘤细胞D、融合瘤细胞正确答案：D30.原核生物基因组中不含有的序列是:A、终止子B、编码区C、启动子D、外显子正确答案：D31.制备cDNA文库常用的反转录酶来源于:A、大肠杆菌B、反刍动物C、艾滋病毒D、枯草杆菌正确答案：C32.编码氨基酸的三联密码所在的核酸是:A、mRNAB、rRNAC、tRNAD、盖帽RNA正确答案：C33.参与DNA复制的关键酶是:A、RNA聚合酶B、连接酶C、DNA聚合酶D、选择酶正确答案：C34.编码rRNA的基因通常组织成:A、基因簇B、可变剪接体C、假基因D、反义基因正确答案：A35.编码 rRNA 的基因位于:A、线粒体DNAB、质粒DNAC、细胞核DNAD、细胞质DNA正确答案：C36.将DNA上的遗传信息转录为RNA的过程称为:A、翻译B、转录C、复制D、修复正确答案：B37.PCR技术依赖的关键酶是:A、连接酶B、聚合酶C、裂解酶D、制限酶正确答案：B38.编码氨酰tRNA合成酶的RNA是:A、mRNAB、rRNAC、tRNAD、siRNA正确答案：B39.可以实现定点诱变的技术是:A、CRISPR/Cas9B、ZFNsC、TALENsD、以上均可正确答案：D40.利用生物信息学分析推测基因功能的方法是:A、突变分析B、蛋白质互作C、序列比对D、同源建模正确答案：C41.可以改变染色体DNA序列的技术是:A、基因敲除B、基因转染C、基因沉默D、基因编辑正确答案：D42.下列不属于PCR反应体系的组成部分是:A、DNA模板B、聚合酶C、dNTPD、琼脂糖正确答案：D43.检测目的蛋白表达的方法不是:A、Southern blottingB、Western blottingC、Eastern blottingD、Northern blotting正确答案：A44.从cDNA库中可以获得的是:A、所有DNA片段B、编码区序列C、非编码区序列D、全部基因组序列正确答案：B45.可以直接克隆cDNA的是:A、质粒B、YACC、λ噬菌体D、人工染色体正确答案：A46.病毒载体导入宿主细胞的方法是:A、共转化B、显微注射C、电穿孔D、吸附感染正确答案：D47.可以识别启动子序列的转录因子是:A、β因子B、α 因子C、σ 因子D、Rho因子正确答案：C48.可以直接提取基因组DNA的方法是:A、PCRB、Northern blotC、Southern blotD、盐析法正确答案：D49.基因敲除实验中所用对照组应为:A、目的基因缺失组B、野生型组C、质粒载体组D、siRNA处理组正确答案：B二、多选题（共35题，每题1分，共35分）1.PCR反应的原料不包括:A、引物B、载体酶C、聚合酶D、dNTPE、模板DNAF、琼脂糖G、无橡皮管封闭正确答案：BFG2.对DNA序列进行PCR扩增需要以下原料:A、模板DNAB、载体酶C、引物D、连接酶E、脱氧核苷三磷酸F、DNA聚合酶G、以上ACF正确答案：G3.质粒载体应具有下列哪些特征:A、大片段插入区B、可自主复制C、含有筛选位点D、与宿主互作E、含有克隆位点F、编码病毒蛋白G、低拷贝数正确答案：BCE4.在制备cDNA文库时需要用到的关键酶包括:A、连接酶B、PCR酶C、限制性内切酶D、RNA聚合酶E、反转录酶F、RNase HG、链化酶正确答案：EF5.编码氨基酸序列的核酸为:A、rRNAB、mRNAC、tRNAD、mRNA前体E、单链RNAF、双链RNAG、环状RNA正确答案：B6.制备重组质粒的主要步骤是:A、载体线性化B、消化插入片段C、连接反应D、感受态细胞制备E、转化宿主细胞F、克隆鉴定G、所有以上步骤正确答案：G7.对肿瘤基因组的检测可以应用:A、Southern印迹B、Northern印迹C、Western印迹D、Eastern印迹E、基因检测F、测序G、基因芯片正确答案：AEFG8.基因表达调控的机制包括:A、转录水平调控B、RNA水平调控C、翻译水平调控D、蛋白活性调控E、基因增幅F、肽链释放G、以上AD均可正确答案：G9.参与翻译过程的RNA包括:A、mRNAB、rRNAC、tRNAD、siRNAE、snRNAF、反义RNAG、以上ABC均参与正确答案：G10.编码氨基酸序列的核酸为:A、rRNAB、mRNAC、tRNAD、cDNAE、基因F、反义链G、互补链正确答案：B11.PCR反应的原料组成包含:A、模板 DNAB、上游引物C、下游引物D、DNA聚合酶E、脱氧核苷三磷酸F、缓冲液G、以上ABDEF正确答案：G12.基因敲入的方法可以包括:A、siRNAB、基因敲除C、ZFNsD、TALENsE、CRISPR/Cas9F、Cre-Lox重组系统G、反义RNA抑制正确答案：CDEF13.编码脱氧核糖的DNA单链为:A、编码链B、反义链C、互补链D、下游链E、正义链F、上游链G、载体链正确答案：B14.基因编辑技术包括:A、ZFNs技术B、TALENs技术C、CRISPR/Cas技术D、基因敲除E、RNAi技术F、慢病毒介导G、以上所有正确答案：ABC15.制备重组DNA的步骤包括:A、载体选择B、插入DNA获得C、双酶切D、连接反应E、转化F、筛选G、以上全部正确答案：G16.参与制备cDNA文库的关键酶类有:A、连接酶B、限制性内切酶C、聚合酶D、反转录酶E、核酸酶F、RNase HG、以上DE正确答案：G17.制备重组质粒的关键步骤不包括:A、载体的选择B、消化载体及插入片段C、连接反应D、PCR扩增插入片段E、转化感受态细胞F、筛选重组克隆G、测序验证正确答案：D18.启动子序列的特征包括:A、定位于基因转录起始点上游B、通常为AT富集区C、具有内含子D、与编码区互补E、与编码区反向验配F、与编码区部分重叠G、保守性非常低正确答案：AB19.直接参与蛋白质翻译的分子包括:A、DNAB、mRNAC、rRNAD、tRNAE、RNA聚合酶F、释放因子G、所有以上分子正确答案：BCDF20.制备重组质粒需要下列步骤:A、载体选择B、消化载体和插入DNAC、连接反应D、感受态细胞制备E、转化宿主细胞F、克隆筛选G、以上全部正确答案：G21.检测mRNA的方法包括:A、Northern杂交B、Western印迹C、Southern印迹D、荧光in situ杂交E、实时定量PCRF、RNA序列表达谱分析G、以上ABDF正确答案：G22.启动子通常位于:A、翻译起始点上游B、转录终止点下游C、翻译终止点下游D、基因内含子E、编码区F、转录起始点上游G、终止子下游正确答案：F23.编码氨基酸序列信息的核酸为:A、DNAB、RNAC、mRNAD、tRNAE、rRNAF、cDNAG、质粒正确答案：C24.基因敲入的技术可以包括:A、siRNAB、基因敲除C、ZFNsD、TALENsE、CRISPR/Cas9系统F、Cre-Lox重组系统G、反义DNA正确答案：CDEF25.制备重组 DNA 需要以下技术:A、载体准备B、PCR 扩增插入片段C、引物设计D、双酶切连接E、宿主细胞转化F、筛选重组克隆G、以上全部正确答案：G26.编码氨基酸序列的核酸为:A、DNAB、mRNAC、rRNAD、tRNAE、miRNAF、cDNAG、基因正确答案：B27.编码mRNA的DNA单链被称为:A、编码链B、上游链C、下游链D、正义链E、反义链F、互补链G、载体链正确答案：E28.Polymerase Chain Reaction (PCR) 的关键步骤不包括:A、模板变性B、引物与模板杂交C、新链延伸合成D、反向转录E、新链变性F、产物检测G、增幅后转化正确答案：D29.Polymerase Chain Reaction (PCR) 的关键步骤包括:A、模板预变性B、引物与模板退火C、新链延伸合成D、产物检测E、反义链合成F、连接酶反应G、以上全部正确答案：ABCD30.编码氨基酸的三联密码存在于:A、DNA双链上B、mRNA分子上C、tRNA分子上D、rRNA上E、盖帽RNA上F、启动子区域G、终止子区域正确答案：C31.抑制基因在体细胞中的表达方法有:A、siRNAB、基因敲除C、反义RNAD、CRISPR/Cas9E、基因激活F、启动子激活G、剪切反应激活正确答案：ABD32.检测mRNA表达水平的技术是:A、北方印迹B、西方印迹C、南方印迹D、东方印迹E、In situ杂交F、免疫组化G、芯片杂交正确答案：AEG33.编码氨基酸的三联密码存在于:A、DNA双链上B、mRNA分子上C、tRNA分子上D、rRNA 上E、盖帽RNA上F、启动子区域G、终止子区域正确答案：C34.可以提高基因在异源表达载体中的表达水平的方法不包括:A、扩增子克隆B、终止子序列调控C、引入变位信号D、改良启动子序列E、引入选择标记F、优化文库构建方法G、优化编码序列正确答案：F35.可以提取基因组DNA的方法有:A、PCR扩增B、Northern印迹C、Southern印迹D、过滤法E、质谱法F、限制性酶切G、盐析法正确答案：CG三、判断题（共38题，每题1分，共38分）1.基因敲入可以使用双链DNA分子实现。
分子实验 常见问题及分析
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
6.
尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
DNA提取常见问题
核酸分离、纯化
多酚的去除：
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β -巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合
分子生物学实验常见问题分析及对策-20
分子生物学实验常见问题分析及对策-20质粒的提取常见问题与对策Q1: 提质粒没有明显的沉淀，能说明是没有提出来吗？跑完电泳还是没有条带能证明质粒没提出来吗？A: 提质粒的时候没有明显的沉淀，也有可能是由于你加的乙醇量少或异丙醇量不足或质量有问题。
或者质粒太少了难以用肉眼看出。
跑完电泳还是没有条带也有可能是跑胶时配置胶出问题，或染色剂不够，或者你加的质粒量少。
要具体情况再分析Q2:质粒条带很暗而且通常只有一条带是什么问题？A:没有用试剂盒提取的话可能考虑技术问题。
如果常做质粒的提取，且用的是试剂盒，还出现这种情况，就要从质粒本身着手考虑了：首先做个PCR鉴定一下，确保有质粒的情况下，很可能质粒是低拷贝的，如此就要用大量的细菌来提取质粒。
一般的用可以用水煮法提(1ml菌液离心,沉淀加50μl DEPC 水,100度水煮3-4分钟,离心取上清夜,含有大量的质粒)用1-2μl作为模板跑PCR效果很好。
Q3: 用分光光度计测得的质粒浓度很高，但是跑出来的电泳却看不到条带，这是什么原因？A: 三种可能：1）可能EB有问题，应同时检查同一块胶上其它样品是否有条带。
2）计算OD260/280比例，有可能为蛋白污染所致。
3）稀释后上样的浓度过低。
Q4: 提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？A: 质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。
经常会出现。
2）两条带，超螺旋/闭环/开环任意两种。
3）一条带，超螺旋。
至于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了。
1）进行分子克隆的操作，构建载体。
这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。
所以在这种情况下，没必要评比谁好谁不好。
2）进行细胞转染。
因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是： 3）、2）、1）。
Q5: 如何降低质粒变性超螺旋的含量？A: 理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。
分子生物学实验理论及操作答案
实验答案一、基本原理题1、限制性内切酶有那些特点？①能识别双链分子的某种特定核苷酸序列②使每条DNA链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开2、限制性内切酶有那些类型，我们DNA重组时常用的是哪类？答：限制性内切酶主要分成三大类。
第一类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA 重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。
第二类限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
这种酶的切割可以有两种方式。
一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。
第三类限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。
它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。
但这几个核苷酸对则是任意的。
因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。
这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处。
3、何为细菌的限制修饰系统？是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要有限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
细菌的限制修饰系统包含三个连锁基因：（1）hsd R：编码限制性核酸内切酶（2）hsd M：编码限制性甲基化酶（3）hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达大多数限制性内切酶常常伴随有1~2种修饰酶（DNA甲基化酶），后者能保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。
分子生物学实验问答题答案中文名称(1)
.中文名称：重组DNA技术。
英文名称：recombinant DNA technique;recombinant DNA technology定义1：用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。
包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。
重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）又称遗传工程，在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。
这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。
因此它不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。
2.列出分子生物学常用仪器的名称，用途。
答：①恒温气浴摇床：常用于液体摇匀以培养微生物、细菌和细胞等。
注意要依据不同的用途设置不同的参数。
②超净工作台：常用于为微生物学实验提供无菌操作环境。
注意操作时关掉紫外灯，避免给人类带来伤害。
③低温台式高速离心机：常用于分离纯化蛋白、病毒、细胞等。
使用时不能随便移动离心机或打开盖子；离心机运行时要处于锁定状态；离心管的放置要处于平衡状态。
④微量移液管：用于计量和转移微量液体的专用仪器。
操作时注意避免枪头的污染；调节刻度时不宜超过最大量程；使用完后将刻度调到最大收藏。
⑤电泳仪：可对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分的提取制备。
操作时不可把导线极性接反；当电泳仪进入工作状态后，避免人体与其各部分的接触，不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行；若使用时出现异常，要立刻切断电源。
⑥PCR仪：用于扩增DNA片断。
操作时应注意盖子要盖紧，按正确步骤进行。
⑦高压高温灭菌锅：用于杀菌消毒。
使用时应严格按照规程操作，避免发生安全事故。
3. 如何正确使用微量移液器。
一、标准操作适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。
分子生物学实验复习题附答案（最新整理）
分⼦⽣物学实验复习题附答案（最新整理）分⼦⽣物学复习题实验⼀DNA的制备（1）为什么分⼦⽣物学实施时要担⼼EB？溴化⼄锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化⼄锭可以嵌⼊碱基分⼦中，导致错配。
具有⾼致癌性(接触致癌)（2）DNA加样缓冲液的⽤途是什么？由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产⽣不利的影响，在抽提缓冲液中需加⼊抗氧化剂或强还原剂(如巯基⼄醇)以降低这些酶类的活性。
线状DNA⼤⼩/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1（4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么DNA分⼦在pH值⾼于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。
DNA分⼦在电场中通过琼脂糖凝胶⽽泳动，除了电荷效应以外，还有分⼦筛效应。
由于DNA分⼦可⽚段的相对分⼦质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分⼦质量不同或构象不同的DNA分离。
DNA⽚段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反⽐，因此通过已知⼤⼩的标准物移动的距离与未知⽚段的移动距离时⾏⽐较，便可测出未知⽚段的⼤⼩。
但是当DNA分⼦⼤⼩超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。
此时电泳的迁移率不再依赖于分⼦⼤⼩，因此，就⽤琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分⼦⼤⼩不宜超过此值。
（5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？溴化⼄锭是⼀种⾼度灵敏的荧光染⾊剂,可插⼊DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成⼀种荧光络合物。
在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄⾊的荧光。
⽤溴化⼄啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。
（6）制备基因组DNA时⽤到的以下试剂分别起什么作⽤？CTAB等离⼦型表⾯活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋⽩，使核蛋⽩解聚，从⽽使DNA得以游离出来氯仿有机溶剂，能使蛋⽩质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)⽔溶性很强，经离⼼后即可从抽提液中除去细胞碎⽚和⼤部分蛋⽩质。
分子生物学实验的常见问题与解决方案范文
分子生物学试验的常见问题与解决方案范文一、Southern 杂交问题 1：电泳后觉察凝胶中DNA 集中，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：〔1〕在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶准时处理使凝胶枯燥；〔2〕琼脂糖的质量应当较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。
问题 2：传统方法中转膜不完全的问题如何抑制？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至 24 小时以上,也不能使大分子DNA 良好地转移出去,因此,转膜不完全。
向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶根本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向全都,故可以良好地完成 DNA 的转移, 它不需要特别的仪器,转移速度较快,转移效率高。
利用地高辛标记探针进展Southern 杂交时，对于大于 15kb 的DNA 片断，转膜之前用盐酸进展脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。
假照试验转膜过程中同时含有大于 15kb 的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半局部浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
另外，等承受琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，试验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF 基由于构件，建立转基因小鼠。
转基因小鼠的检测承受剪取鼠尾DNA 做Southern 进展鉴定。
2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳 8 小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置 3 小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20 分钟，转置中和液(0.5MTriHCl，0.15MNaCl)20 分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置 30 分钟。
分子生物学习题及问题详解
核酸一、填空题1. 碱基互变异构是指碱基的酮式与烯醇式或氨基式与亚氨基式异构体发生互变的现象，如果这种现象在DNA 复制的时候发生，如此可以导致碱基错配。
然而，在生理pH 下，碱基主要以酮式或氨基式形式存在。
2．DNA 双螺旋中只存在 2 种不同碱基对。
A 总是与_T___配对，G 总是与 C 配对，此规如此称为Chargaff 法如此。
但在RNA 双螺旋中，还含有第三种碱基配对，它是GU 。
3．X 线衍射证明，核苷中碱基与核糖环平面相互垂直。
4．一个双链RNA 分子与一个双链DNA 分子的差异有分别含U 与T 、核糖与脱氧核糖和A 型与 B 型双螺旋。
5．核酸在260 nm 附近有强吸收，这是由于碱基环上的共轭双键。
6．给动物食用3H 标记的胸苷，可使DNA 带有放射性，而RNA 不带放射性。
如果要让RNA 带有放射性，应该给动物食用3H 标记的尿苷。
7．Tm 是指DNA 热变性时候的熔链温度，双链DNA 中假设GC 含量多，如此其Tm 值高。
DNA 样品的均一性愈高，其熔解过程的温度X围愈窄。
DNA 所处溶液的离子强度越低，其熔解过程的温度X围越宽，熔解温度越低，所以DNA 应保存在较高浓度的盐溶液中。
8．双链DNA 热变性曲线通常呈S 形，这种曲线说明DNA 的变性具有协同效应；在DNA 发生热变性后，在pH 2以下，或pH 12 以上时，其A260 增加，同样条件下，单链DNA 的A260 不变。
9．核酸分子中的糖苷键均为β-N-糖苷键型，但假尿苷中的糖苷键为β-C-糖苷键。
核苷酸之间通过3,5-磷酸二酯键连接形成多聚物。
10. 细胞内总含有T 的RNA 是tRNA ，它是通过U 的后加工形成的。
11. DNA 双螺旋的构型可以有三种，它们分别为 B 型，A 型，Z 型。
B-DNA 的螺距为3.4 nm，每圈螺旋的碱基对数为10 ，细胞里的B-DNA 每圈螺旋的实际碱基对数为10.4 。
分子生物学问答题
分⼦⽣物学问答题问答题第⼆章⼀、⽤于基因重组的载体需要具有哪些条件？1）具有⾃主复制能⼒，保证重组DNA分⼦可以在宿主细胞内得到扩增2）具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染⾊体DNA分开，便于分离提纯3）分⼦质量相对较⼩，易与操作，并能够容纳较⼤分⼦质量的⽬的基因4）具多个单⼀限制性内切酶位点，便于⽬的基因克隆5）有⼀个或多个筛选标记（如对抗⽣素的抗性、营养缺陷型或显⾊表型反应等）6）具有较⾼的遗传稳定性⼆、限制性内切酶主要分为⼏个类型？各有什么特点？限制性内切酶主要分为三种类型，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。
Ⅰ型和Ⅲ型酶⼀般都是⼤的、多亚基的蛋⽩质复合物，同时具有内切酶活性和甲基化酶活性。
均需ATP ⽔解供能。
Ⅰ型酶能够识别特异的核苷酸序列，但是切割位点是随机的，Ⅲ型限制酶从距离识别位点⼀侧约25bq处单链切割DNA分⼦。
识别序列是⾮对称的，现在已知的酶数量相当少。
Ⅰ型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中⽤处不⼤。
Ⅱ型限制性核酸内切酶只有⼀种多肽，通常以同源⼆聚体形式存在，核酸内切酶活性和甲基化作⽤活性是分开的。
⽆需ATP⽔解供能，仅需Mg2﹢参与。
具有序列特异性，可对靶DNA进⾏精确切割，在DNA 重组技术中有特别⼴泛的⽤途。
三、影响限制性内切酶作⽤的因素有哪些？DNA第底物的纯度、DNA的甲基化程度、DNA分⼦的结构、酶切反应的温度、酶切反应的时间、酶切反应的缓冲体系等四、DNA连接酶主要有哪些应⽤？1）作为DNA重组技术的重要⼯具酶，催化两个具有黏性末端或平末端的DNA⽚段5’-P和3’-OH之间形成磷酸⼆酯键，组成新的重组DNA分⼦。
2）在DNA复制中发挥接合缺⼝的作⽤，这种单链缺⼝是由复制叉上的不连续性所产⽣3）在DNA损伤修复、遗传重组、及DNA链的剪接中起缝合缺⼝的作⽤五、反转录病毒载体有哪些优点？1）具有⼴泛的哺乳动物细胞宿主2）可主动感染分裂细胞3）感染细胞后，病毒基因组反转录⽣成双链DNA，可整合到宿主染⾊体中，与染⾊体同时复制，持续表达外源基因4）基因组⾃⾝含有完整⾼效的调控元件六、腺病毒载体有哪些优点？1）可插⼊⼤⽚段外源基因，可达35kb2）宿主范围⼴，尤其⼈类是腺病毒的⾃然宿主3）不仅可感染分裂期细胞，也可感染⾮分裂细胞4）病毒滴度⾼，可达10^9-10^11pfu/ml5）可原位感染组织，如肺等6）重组载体进⼊细胞后并不整合到宿主染⾊体DNA上，⽽是游离于染⾊体外瞬时表达，安全性好七、腺病毒载体有哪些不⾜？①病毒基因组较⼤，构建载体较复杂②⼏乎可感染所有细胞，缺乏特异性③载体不发⽣整合，导致⽬的基因只能短暂表达，因此需要重复应⽤，可能诱发机体的免疫反应第三章①化学合成法已知⽬的基因的核苷酸序列，或根据基因产物的氨基酸序列推导出其核苷酸序列，可利⽤全⾃动DNA合成仪化学合成该⽬的基因。
分子生物实验测试题及答案
分子生物实验测试题及答案题目一：PCR技术相关知识测试问题一：请简要解释PCR技术的原理及应用。
答案一：PCR（聚合酶链反应）是一种体外体系中扩增DNA片段的核酸技术。
其原理为在适宜的反应条件下，利用DNA聚合酶酶（如Taq聚合酶）的功能，经过若干个循环反应，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术广泛应用于基因定量、DNA测序、基因突变检测等分子生物学领域。
问题二：请简单描述PCR扩增反应的三个主要步骤。
答案二：PCR扩增反应包括三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。
1. 变性：在PCR反应开始时，将反应混合物加热至95°C，使DNA双链解旋为两条单链。
2. 引物结合：将反应温度降至目标序列的引物结合温度，引物与目标序列互补碱基序列特异结合。
3. 延伸：将反应温度升至DNA聚合酶的最适合活性温度，使引物沿DNA模板延伸合成新的DNA链。
问题三：在PCR反应中，引物的作用是什么？答案三：在PCR反应中，引物是扩增目标序列的起始序列，其作用是为DNA聚合酶提供结合引导，并在延伸过程中合成新的DNA链。
问题四：为什么PCR反应需要高温变性步骤？答案四：PCR反应需要高温变性步骤是为了使DNA双链解旋为两条单链，以便引物与目标序列能够特异性结合，从而进行下一步的延伸反应。
题目二：电泳技术相关知识测试问题一：请简述凝胶电泳的原理及应用。
答案一：凝胶电泳是一种常用于分离和分析DNA、RNA和蛋白质等生物分子的方法。
其原理是利用带电荷的生物分子在电场作用下在凝胶基质中迁移的特性，通过电泳迁移速度的差异实现分离。
凝胶电泳广泛应用于分子生物学研究中，如DNA片段大小测定、RNA分离和鉴定、蛋白质分离等。
问题二：请简单描述琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别。
答案二：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是常用的两种凝胶电泳方法，其区别主要体现在凝胶基质的材料和分辨率上。
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作为凝胶基质，适用于DNA的分析，其分辨率相对较低，适合分析较大分子量的DNA片段。
分子实验常见问题
分子生物学实验常见问题分析及对策一、各种常见PCR1.PCR反应扩不出条带，出现假阴性，可能原因：（1）模版：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，且含量低；Buffer 对样品不合适；引物设计不当或者发生降解；模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。
引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（5）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
分子生物学简答题汇总
分子生物学简答题汇总
本文档汇总了一些分子生物学的简答题，旨在帮助读者更好地理解和复分子生物学的基础知识。
以下是一些常见的问题及其简洁的答案：
1. DNA是什么？DNA是什么？
DNA（脱氧核糖核酸）是一种双链螺旋结构的分子，它携带了细胞内遗传信息的蓝图。
2. DNA的组成单位是什么？DNA的组成单位是什么？
DNA的组成单位是核苷酸，每个核苷酸由一个磷酸、一个脱氧核糖和一个氮碱基组成。
3. DNA复制是什么过程？DNA复制是什么过程？
DNA复制是指在细胞分裂过程中，DNA双链被解开，然后通过配对规则合成两个全新的DNA分子的过程。
4. 什么是基因？什么是基因？
基因是DNA上的一段特定序列，它携带了编码特定蛋白质的信息。
5. 什么是转录？什么是转录？
转录是指在细胞中，DNA的信息被转录成RNA的过程。
RNA 分子可以携带基因的信息进入细胞质。
6. 什么是翻译？什么是翻译？
翻译是指在细胞中，RNA的信息被翻译成蛋白质的过程。
蛋白质是细胞中许多生化反应和功能的关键组成部分。
7. RNA和DNA有什么区别？RNA和DNA有什么区别？
DNA是双链螺旋结构，而RNA是单链结构。
此外，DNA中的碱基酸配对规则是A对T，C对G，而RNA中是A对U，C对G。
8. 什么是突变？什么是突变？
突变是指DNA序列的改变，可能会导致基因表达的变化或功能异常。
以上是一些分子生物学的简洁答案，希望对您的学习和复习有所帮助。
如果您有更多问题或需要深入了解，请随时告诉我。
分子生物学题库(附参考答案)
分子生物学题库（附参考答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1.关于切口平移法下述不正确的是A、可标记线性 DNAB、可标记松散螺旋 DNAC、可标记超螺旋 DNAD、可标记存在缺口的双链 DNAE、可标记随机引物正确答案：E2.在 pH 为下述何种范围时，Tm 值变化不明显A、pH 为 5~9B、pH 为 3~5C、pH 为 5~6D、pH 为 8~11E、pH 为 4~5正确答案：A3.关于SYBR Green Ⅰ 的描述，不正确的是A、荧光染料的成本低B、适用于任何反应体系C、操作亦比较简单D、特异性强E、不需要对引物或探针进行预先特殊的荧光标记正确答案：D4.PCR 反应过程中，退火温度通常比引物的Tm 值A、低5℃B、低15℃C、高5℃D、高15℃E、相等正确答案：A5.以下关于原癌基因说法不正确的是A、普遍存在于人类或其他动物细胞基因组中的一类基因B、在生物进化过程中不稳定C、在控制细胞生长和分化中起重要作用D、容易在多种因素作用下激活成活性形式的癌基因E、活性形式的癌基因才引起细胞癌变正确答案：B6.关于真菌，以下描述正确的是A、真菌种类繁多，其中大多数对人类有害B、浅部真菌感染对治疗有顽固性，对机体的影响相对较小C、近年真菌病的发病率有明显下降趋势D、病原性真菌根据其入侵组织部位深浅的不同分为浅部真菌和内部真菌E、真菌感染对人体的危害不大正确答案：B7.标记的参与杂交反应的核酸分子称为A、变性B、探针C、杂交D、复性E、复杂性正确答案：B8.不符合分子诊断特点的是A、灵敏度高B、特异性强C、样品获取便利D、检测对象为自体基因E、易于早期诊断正确答案：D9.在下列何种情况下可考虑进行基因连锁检测方法进行基因诊断A、基因结构变化未知B、点突变C、基因片段缺失D、表达异常E、基因片段插入正确答案：A10.关于抑癌基因的说法正确的是A、呈隐性作用方式B、抑癌基因又称为肿瘤分化抑制基因C、可以使细胞丧失生长控制和正性调控功能D、是一类可编码对肿瘤形成起促进作用的蛋白质的基因E、正常情况下促进细胞增殖、抑制细胞分化正确答案：A11.变性梯度凝胶电泳的描述中错误的是A、使 DNA 双链分子局部变性B、采用梯度变性凝胶C、变性难易由核苷酸组成决定D、突变检测率高E、可确定突变位置正确答案：E12.DNA 自动化测序技术中，不正确的荧光标记方法A、用荧光染料标记引物5’端B、用荧光染料标记引物3’-OHC、用荧光染料标记终止物D、使用一种或四种不同荧光染料标记E、使荧光染料标记的核苷酸渗入到新合成的 DNA 链中正确答案：B13.PCR 中的脱氧核苷三磷酸不包括A、dATPB、dTTPC、dCTPD、dGTPE、dUTP正确答案：E14.一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称A、变性B、复杂性C、探针D、复性E、杂交正确答案：E15.珠蛋白生成障碍性贫血的主要原因是A、珠蛋白链合成速率降低B、珠蛋白基因突变导致氨基酸序列改变C、血红蛋白破坏加速D、出现异常血红蛋白 SE、铁代谢异常正确答案：A16.众多肿瘤中遗传因素最突出的一种肿瘤是A、肺癌B、肝癌C、乳腺癌D、结直肠癌E、前列腺癌正确答案：D17.为封闭非特异性杂交位点，可在预杂交液中加入A、ssDNAB、1 ×SSCC、10×SSCD、5×TBECE、50×TAE正确答案：A18.不属于脆性 X 综合征分子诊断人群的是A、有 FraX 体格或性格阳性征象者B、发育迟缓或自闭症的患者C、没有 FraX 家族史D、已明确母亲为携带者的婴儿E、未诊断的 MR 家族史正确答案：C19.病毒的遗传物质是A、DNAB、RNA 和蛋白质C、DNA 或 RNAD、RNA 和 DNAE、DNA 和蛋白质正确答案：C20.Alu家族属于A、可变数目串联重复序列B、短串联重复序列C、长散在核原件D、短散在核原件E、DNA 转座子正确答案：D21.检测融合基因、确定染色体易位的首选方法是A、FISHB、RT-PCRC、实时定量 PCRD、PCRE、DNA 芯片正确答案：D22.母亲血浆中的胎儿 DNAA、占母亲血浆总 DNA 的 50%以上B、可用于检测胎儿从母亲遗传而来的线粒体 DNA 突变C、确定RhD 阳性孕妇所怀胎儿的RhD 情况D、确定胎儿是否从母亲遗传了X 连锁的基因突变E、血友病 A 的产前诊断正确答案：C23.关于人工合成的寡核苷酸探针，下列描述不正确的是A、特异性高B、可依赖氨基酸序列推测其序列C、分子量小D、可用于相似基因顺序差异性分析E、可用末端转移酶进行5’端标记正确答案：E24.以下哪种方法是检测耐药基因突变的金标准 ( )A、PCR 技术B、荧光定量 PCR 技术C、PCR-RFLP 技术D、PCR-SSCPE、DNA 测序技术正确答案：E25.5’-末端的 DNA 探针标记主要依靠的酶是A、T4 多聚核苷酸激酶B、末端转移酶C、AKPD、DNA pol ⅠE、DNA pol正确答案：A26.第三代测序技术测定人全基因组的目标：A、30 分钟的测序时间及 5 万美元的测序价格B、3 小时的测序时间及 5 千美元的测序价格C、30 分钟的测序时间及 5 千美元的测序价格D、3 分钟的测序时间及 5 千美元的测序价格E、3 小时的测序时间及 5 万美元的测序价格正确答案：D27.GeneXpert 全自动结核杆菌检测技术现可进行哪种药物的耐药检测A、乙胺丁醇B、利福平C、链霉素D、异烟肼E、吡嗪酰胺正确答案：B28.不是自动 DNA 测序仪主要系统之一的是A、测序反应系统B、电泳系统C、荧光检测系统D、探针荧光标记系统E、电脑分析系统正确答案：D29.下列哪一种病毒的遗传物质为 RNA ( )A、乙肝病毒B、乳头瘤状病毒C、疱疹病毒D、人类免疫缺陷病毒E、腺病毒正确答案：D30.关于 TaqMan 探针技术的描述，不正确的是A、R 基团与Q 基团相距较远，淬灭不彻底，本底较高B、易受到Taq DNA 聚合酶5’→3’核酸外切酶活性的影响C、操作亦比较简单D、不需要进行寡核苷酸熔解曲线分析，减少了实验时间E、解决了荧光染料技术非特异性的缺点正确答案：C31.下列属于抑癌基因的是 ( )A、sisB、rasC、c-erb-2D、mycE、p53正确答案：E32.荧光定量 PCR 反应中，Mg2+的浓度对 Taq 酶的活性是至关重要，以 DNA 或 cDNA 为模板的 PCR 反应中最好的 Mg2+浓度是A、0.2~0.5mMB、1~2mMC、2~5mMD、6~8mME、0.5~2mM正确答案：C33.有关 HPV 描述错误的是A、核酸类型为 DNAB、结构蛋白 L1 和 L2 是包膜上的主要和次要蛋白C、HPV 对皮肤和黏膜上皮细胞具有高度亲嗜性D、病毒核酸合成主要发生在棘层和颗粒层E、大多数宫颈癌组织中病毒以整合状态存在正确答案：B34.K-ras 基因最常见的激活方式是A、插入突变B、点突变C、缺失突变D、基因扩增E、染色体重排正确答案：B35.下列 DNA 序列中的胞嘧啶易发生甲基化修饰的是A、5’-CCCCCT-3’B、5’-GGGGCC-3’C、5’-CGCGCG-3’D、5’-GCACAC-3’E、5’-CTCTCCC-3’正确答案：C36.下列哪种病毒在复制过程中可产生 RNA-DNA 杂交体A、HIVB、HPVC、HBVD、HCVE、流感病毒正确答案：A37.绝大多数β-地中海贫血系由位于第 11 号染色体上的β-珠蛋白基因中的基因突变所致，下列方法中不能用于分子生物学检验的技术是A、PCR-ASOB、PCR-RDBC、基因芯片D、多重 PCRE、MOEA-PCR正确答案：D38.多基因家族的特点描述错误的是 ( )A、由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因B、通常由于突变而失活C、假基因与有功能的基因是同源的D、所有成员均产生有功能的基因产物E、可以位于同一条染色体上正确答案：D39.关于 DNA 芯片原位合成法的描述错误的是：A、也称在片合成B、直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针C、包括光导原位合成法D、包括原位喷印合成法E、包括直接点样法正确答案：E40.下列方法中不能分辨野生型和突变型基因的是A、PCR-SSCPB、变性梯度凝胶电泳C、熔解曲线分析D、逆转录 PCR正确答案：D41.下列哪些技术不适用于鉴定菌种亲缘性：A、随机扩增DNA 多态性分析B、连接酶链反应C、PCR-RFLPD、多位点测序分型E、DNA 测序技术正确答案：B42.下列不是目前用于 O157：H7 型大肠埃希菌分子生物学检验方法的是A、常规 PCRB、多重 PCRC、荧光定量 PCRD、基因芯片技术E、DNA 测序正确答案：E43.未知突变的检测，下列最准确的方法是A、PCRB、RFLPC、核酸杂交D、序列测定E、ASO正确答案：D44.任意引物 PCR 的特点描述错误的是A、需预知靶基因的核苷酸序列B、通过随机引物与模板序列随机互补C、扩增后可直接得到靶基因的多态性指纹图谱D、可用于基因组 DNA 图谱构建E、可用于临床致病菌的流行病学检测、分型正确答案：A45.巢式 PCR 错误的是A、是对靶 DNA 进行二次扩增B、第二次扩增所用的模板为第一次扩增的产物C、巢式 PCR 可提高反应的灵敏度和特异性D、常用于靶基因的质和 (或) 量较低时E、第二对引物在靶序列上的位置应设计在第一对引物的外侧正确答案：E46.下列不是细菌感染性疾病分子生物学检验技术的是A、PCR-SSCPB、real-time PCRC、ELISAD、PFGEE、PAPD正确答案：C47.通过酶联级联反应检测每次核苷酸聚合所产生的ppi 的测序方法是A、化学降解法B、寡连测序C、焦磷酸测序D、边合成边测序E、双脱氧终止法正确答案：C48.以 SDA 技术检测结核杆菌时扩增靶点是A、SDAB、IS6110 和 18SrRNAC、IS6110 和 5SrRNAD、IS6110 和 16SrRNAE、IS6110 和 15SrRNA正确答案：D49.STR 法医鉴定的基础是A、基因多态性B、碱基配对原则C、蛋白质空间结构D、孟德尔遗传定律E、基因扩增技术正确答案：D50.关于 APC 基因说法不正确的是A、是一种抑癌基因B、定位于染色体 5q21 上C、通过编码 APC 蛋白发挥作用D、APC 蛋白在细胞周期进程、细胞生长调控及维持自身稳定中起着重要作用E、APC 蛋白在肿瘤发生发展的全过程中并不稳定正确答案：E51.Northern 印迹杂交可以用于A、快速确定是否存在目的基因B、不仅可以检测 DNA 样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C、检测靶分子是 RNAD、用于基因定位分析E、用于阳性菌落的筛选正确答案：C52.描述 PCR-RFLP 技术在耐药突变检测方面错误的是：A、分型时间短B、技术简便C、突变要存在限制性内切酶酶切位点D、目前被广泛应用于耐药监测E、只能检测特定的突变位点正确答案：D53.单基因遗传病分子诊断的主要应用是A、产前诊断B、携带者筛查C、携带者诊断D、症状前诊断E、耐药基因检测正确答案：A54.结核分支杆菌的基因组特征是A、单链 DNAB、双链 DNAC、单正链 RNAD、单正链 RNA 双聚体E、单负链 RNA正确答案：B55.下列关于细菌感染性疾病的分子生物学检验说法错误的是A、可以检测不能或不易培养、生长缓慢的病原菌B、可以实现对感染细菌的广谱快速检测C、可以对细菌进行基因分型D、可以检测病原菌耐药基因E、其检验技术都是 PCR 及其衍生技术正确答案：E56.最早应用于 HLA 基因分型的方法是A、RFLP 分型技术B、PCR-SSCP 技术C、测序技术D、PCR-SSO 技术E、PCR-SSP 技术正确答案：A57.编码 HIV 衣壳蛋白的是A、gag 基因B、vif 基因C、pol 基因D、tat 基因E、env 基因正确答案：A58.关于核酸探针的种类下列不正确的是A、cDNA 探针B、寡核苷酸探针C、基因组 DNA 探针D、RNA 探针E、双链 DNA 探针正确答案：E59.下列关于引物设计的原则中，错误的是A、两条引物的Tm 值相差尽量大B、G+C 的含量应在 45%~55%之间C、尽量避免引物二聚体的出现D、反应体系中引物的浓度一般在0.1~0.2μmol/L 之间E、5’端可加修饰基团正确答案：A60.多重 PCR 的描述中正确的是：A、同一个模板，多种不同的引物B、相同的引物，多种不同的模板C、多个模板，多种引物D、引物的Tm 值、反应时间和温度、反应缓冲液等尽量不一致以区分不同产物E、同一反应内各扩增产物片段的大小应尽可能相同或接近正确答案：A61.PCR 反应体系的描述错误的是A、模板B、一条引物C、dNTPD、DNA 聚合酶E、缓冲液正确答案：B62.关于 FISH 在白血病的应用中说法正确的是A、主要用于白血病的初诊和复发的检测B、只适用于体液、组织切片标本C、FISH 只能检测处于分裂中期的细胞D、FISH 的灵敏度高于 PCRE、FISH 是检测融合基因、确定染色体易位的首选方法正确答案：A63.mtDNA 中基因数目为A、39 个B、27 个C、22 个D、37 个E、13 个正确答案：D64.硝酸纤维素膜最大的优点是( )A、本底低B、高结合力C、共价键结合D、非共价键结合E、脆性大正确答案：A65.要制订一个能够简洁准确的 DNA 测序方案，首先应考虑A、DNA 片段大小B、测序方法C、实验条件D、测序目的E、测序时间正确答案：E66.寡核苷酸探针的最大的优势是A、易分解B、易标记C、杂化分子稳定D、可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列E、易合成正确答案：D67.关于支原体的描述错误的是A、支原体是一类在无生命培养基中能独立生长繁殖的最小原核细胞微生物B、支原体有一个环状双链 DNAC、以二分裂方式进行繁殖D、其分裂与 DNA 复制同步E、解脲脲原体、人型支原体和生殖器支原体均可引起泌尿生殖道感染正确答案：D68.下列几种 DNA 分子的碱基组成比例，哪一种的Tm 值最高 ( )A、A+T=15%B、G+C=25%C、G+C=40%D、A+T=80%E、G+C=60%正确答案：A69.PCR 反应必需的成分是A、BSAB、DTTC、Tween20D、明胶E、Mg2+正确答案：E70.Southern 印迹杂交的描述正确的是A、不仅可以检测 DNA 样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B、检测靶分子是 RNAC、用于基因定位分析D、用于阳性菌落的筛选E、用于蛋白水平的检测正确答案：A71.关于非放射性探针标记，下列描述不正确的是A、对人体危害小B、可长时间使用C、酶促显色检测最常使用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶D、灵敏度不如放射性探针E、目前应用的非放射性标志物都是抗原正确答案：E72.作为芯片固相载体的材料描述正确的是A、主要有玻片、硅片等实性材料B、不使用硝酸纤维素膜、尼龙膜及聚丙烯膜等膜性材料C、这些载体材料不需要处理，其表面存在活性基团 (如羟基或者氨基)D、可以直接固定已经合成的寡核苷酸探针E、不需要对介质表面进行化学预处理--活化正确答案：A73.检测靶序列是 DNA 的技术是：A、Southern 杂交B、Western 杂交C、Northern 杂交D、Eastern 杂交E、杂交淋巴瘤正确答案：A74.目前的 DNA 自动化测序技术可以一次性读取的序列长度约A、50bpB、100bpC、500bpD、1000bpE、2000bp正确答案：D75.在人类基因组 DNA 序列中，DNA 甲基化主要发生在A、腺嘌呤的 N-6 位B、胞嘧啶的 N-4 位C、鸟嘌呤的 N-7 位D、胞嘧啶的 C-5 位E、鸟嘌呤的 C-5 位正确答案：D76.有关微卫星的描述正确的是A、散在重复序列的一种B、10~100bp 组成的重复单位C、主要存在于着丝粒区域，通常不被转录D、形式为 (CA) n/ (TG) n、 (AG) n、 (CAG) n 等E、又称为可变数目串联重复序列 (VNTR)正确答案：D77.关于逆转录 PCR 的描述，不正确的是A、首先应将 RNA 转化为 cDNA 才能进行 PCRB、除了使用DNA 聚合酶外，还应使用逆转录酶C、模板为 RNAD、oligo-d (T) 理论上可以将所有的 mRNA 进行逆转录反应E、逆转录酶不需要引物进行逆转录反应正确答案：E78.以下不是原癌基因的特点的是A、广泛存在于生物界，是细胞生长必不可少的B、在进化过程中，基因序列呈高度保守性C、通过表达产物 DNA 来实现功能D、在某些因素的作用下会形成能够致瘤的癌基因E、对正常细胞不仅无害，而且是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需正确答案：C79.PCR-ASO 描述错误的是A、需要寡核苷酸探针B、检测点突变的技术C、PCR 产物必须电泳分离D、需正常和异常两种探针E、需严格控制杂交条件正确答案：C80.下列不是片段性突变引起原因的是A、基因重排B、碱基插入C、碱基缺失D、碱基扩增E、转录异常正确答案：E81.在核酸检测体系中加入内质控，其作用不是监控的是A、试剂失效或 Taq 酶活性降低所致的假阴性B、标本中抑制物或干扰物所致的假阴性C、样本吸取错误所致的假阴性D、仪器故障如扩增仪孔间温度差异所致的假阴性E、核酸提取效率太低所致的假阴性正确答案：C82.第一代 DNA 测序技术的核心技术是A、Sanger 的双脱氧链终止法B、Maxam 和 Gilbert 的化学降解法C、荧光标记技术D、PCR 技术E、DNA 自动分析技术正确答案：A83.目前测序读长最大的测序反应：A、边合成边测序B、化学裂解法C、双脱氧终止法D、连接测序E、焦磷酸测序正确答案：C84.以下对镰刀状红细胞贫血症叙述正确的是 ( )A、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成缬氨酸残基B、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成苯丙氨酸残基C、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成丝氨酸残基D、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成异亮氨酸残基E、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成甘氨酸残基正确答案：A85.转录依赖扩增系统与其他 PCR 技术的区别是A、模板是 RNAB、模板是 DNAC、引物是 RNAD、模板和产物都是 RNAE、需要热循环正确答案：D86.HBV DNA 中最大的一个开放阅读框是A、P 基因区B、S 基因区C、X 基因区D、前 S1 基因区E、C 基因区正确答案：A87.HCV 的核酸是A、+ssRNAB、dsRNAC、dsDNAE、-ssRNA正确答案：A88.第二代测序技术一般不用到A、双脱氧链终止法B、文库接头C、高通量的并行 PCRD、高通量的并行测序反应E、高性能计算机对测序数据进行拼接和分析正确答案：A89.硝酸纤维素和PVDF 膜结合蛋白主要靠( )A、疏水作用B、氢键作用C、离子键作用D、盐键作用E、酯键作用正确答案：A90.关于梅毒螺旋体的实验室检测，下列描述正确的是A、分子生物学方法是耐药基因分析和流行学研究的首选方法B、镜检法简便，特异性高，但不能用于皮肤黏膜损害的早期诊断C、诊断梅毒的传统方法是体外培养D、血清学检查普遍用于梅毒的筛查、疗效观察和流行病学检查，对早期梅毒诊断敏感E、分子生物学方法不能早期诊断梅毒感染正确答案：A91.纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，可使比值降低的是 ( ) ：B、牛血清白蛋白C、RNAD、氯仿E、Mg2+正确答案：A92.能发出γ-射线的放射性核素是A、3HB、14CC、32PD、35SE、125I正确答案：E93.定点诱发突变可以通过以下哪个过程获得：A、PCRB、LCRC、RT-PCRD、SSCPE、ASO正确答案：A94.在人类基因组中，编码序列占的比例为A、3%B、21%C、5%D、23%E、1.5%正确答案：E95.当标本核酸量非常低难以扩增时，可采用的 PCR 技术是A、逆转录 PCRB、转录介导扩增C、原位 PCRD、巢式 PCRE、荧光 PCR正确答案：D96.聚合酶链式反应是一种A、体外特异转录 RNA 的过程B、体外翻译蛋白质的过程C、体外特异转录 DNA 的过程D、体外特异复制 DNA 的过程E、体内特异复制 DNA 的过程正确答案：C97.下列方法中能同时检测几种疟原虫混合感染的是A、竞争 PCRB、巢式 PCRC、多重 PCRD、普通 PCRE、PCR-RFLP正确答案：C98.唯一一个在结肠上皮增殖过程中起看门作用的基因是A、MCC 基因B、DCC 基因C、APC 基因D、p53 基因E、HNPCC 基因正确答案：C99.线粒体基因组与核基因组之间，下面描述不正确的是A、线粒体基因组与核基因组分别在不同的位置进行自主复制和转录，之间互不影响B、mtDNA 突变可引起编码蛋白功能障碍，影响细胞呼吸、氧化功能，进而影响核 DNA 的表达C、mtDNA 自主性复制，但复制所需的酶、调控因子等由核基因编码D、二者虽在地理位置上独立，但二者之间关系十分密切E、线粒体基因组与核基因组之间存在“交叉对话” ，相互影响，相互协调正确答案：A100.下列属于抑癌基因的是 ( )A、rasB、mycC、c-erb-2D、sisE、Rb正确答案：E。
分子实验常见问题及对策
分子生物学实验常见问题分析及对策一、各种常见PCR1.PCR反应扩不出条带，出现假阴性，可能原因：（1）模版：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，且含量低；Buffer对样品不合适；引物设计不当或者发生降解；模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。
引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（5）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
分子生物学实验思考题答案
分子生物学实验思考题答案分子生物学实验思考题答案实验一、基因组dna的提取1、为什么构建dna文库时，一定要用大分子dna?请问、文库的大小(即为数目)依赖于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目大一些也可以涵盖99%甚至以上的基因组。
而文库数目大则便利研究人员操作方式和文库的留存。
所以构筑文库必须用随身携带能力小的载体克隆尽量小的dna片段.2、如何检测和确保dna的质量？答、用凝胶电泳看，有没有质白质和rna等物质的污染，还可以测od，用od260/280来判断，当od260/od280<1.8，表示蛋白质含量较高当od260/od280>2.0，表示rna含量较高当od260/od280=1.8～2.0，表示dna较纯。
实验二、植物总rna的抽取1、rna酶的变性和失活剂有哪些？其中在总rna的抽提中主要可用哪几种？请问、存有depc,trizol，氧钒核糖核苷复合物，rna酶的蛋白抑制剂以及sds，尿素，硅藻土等；在总rna抽取中用pepc,trizol2、怎样从总rna中进行mrna的分离和纯化。
答、、利用成熟的mrna的末端具有polya尾的特点合成一段oligo(dt)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mrna从总rna中分离出来实验四、大肠杆菌感受态细胞的制取1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？请问、a）细菌的生长状态：不要用经过多次桥接或储于4℃的培育菌，最出色从-80℃甘油保与存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的od600来控制。
dh5α菌株的od600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右，这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
b）所有操作方式均应当在无菌条件和冰上展开；实验操作方式时必须格外小心，漂浮细胞时必须柔和，以免导致菌体断裂，影响转变。
c）经cacl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，d）化合物及无机离子的影响：在ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如mn2+或co2+）、dmso或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；e）所使用的器皿必须干净。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（1）模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑 制剂、DNA结合蛋白类。
一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增 加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应 特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶
0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少 影响反应产量。
PCR的基本原理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22Βιβλιοθήκη DNA 2形 成条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
模板DNA
95℃
PCR的基本原理
引物2
DNA引物
PCR反应条件
EB染色原理：
EB插入DNA碱基对之间的结合
PCR常见问题
无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性
现象无：扩阳增对产照有物条带，而样品则无
M
样品A 样品B 阳性对照
原 因
1. 纯度：含有抑制物 2. 浓度：含量低 3. 质量：RNA被降解 4. 操作：体系配制有误，
模板加入有误
对策
1. 纯化模板或者使用优质 试剂盒提取模板RNA
引物的复性温度
通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大 大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之 间完全结合
PCR过程
PCR的特点50℃
引物1
PCR的基本原理
PCR反应条件
PPCCRR过的程特点72℃
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理
Taq
Taq
Taq
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
阻止内源酶的活性：
✓ 选择合适的匀浆方法。 ✓ 选择合适的裂解液。 ✓ 控制好样品的起始量。
RNA提取原理与注意事项 PCR原理与常见问题 Real-time PCR
PCR技术的基本原理
变性--退火--延伸三个步骤
模板DNA的变性：93℃-95℃左右， 模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃ 引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性
对 策
1. 纯化模板 2. 更换Buffer 3. 适当提高退火温度 4. 适量用酶 5. 适当降低dNTP和镁离子的
浓度 6. 减少循环次数
假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原
对策
因
靶序列或扩增产物 的交叉污染
1. 开管轻柔，防止形成气溶胶；防 止靶序列吸入加样枪内或溅出离 心管外
标准的PCR反应体系（100ul体系）
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板 Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至
10ul 各200umol/L 10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ul
PCR反应五要素
模板 （template） 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） Mg2+ （magnesium）
2. 加大模板的用量 3. 重新提取RNA，并做好无
Rnase前处理 4. 重新配置扩增体系，重
新PCR
非特异性扩增
现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一
致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异 性扩增带。
原 因
1. 引物特异性差 2. 模板或引物浓度过高 3. 酶量过多 4. Mg2+浓度偏高 5. 退火温度偏低 6. 循环次数过多
（优选）分子生物学实验原理 与常见问题解答
商品化提取试剂盒原理：
异硫氰酸胍（GIT）-酚法
GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl） 作用使蛋白质变性，从而释放RNA； GIT与 β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一 定条件下（各家试剂条件不同），RNA不溶 于乙醇，而DNA和蛋白质溶于乙醇溶液，通 过滤柱时，RNA挂柱， DNA和蛋白质溶于 滤液；在逐步洗脱的过程中，RNA不断被纯 化；最后用水洗脱。
对 策
1. 重新设计引物或者使用巢 式PCR
2. 适当降低模板或引物浓度 3. 适当减少酶量 4. 降低镁离子浓度 5. 适当提高退火温度或使用
二阶段温度法 6. 减少循环次数
现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
M
1
2
原 因
1. 模板不纯 2. Buffer不合适 3. 退火温度偏低 4. 酶量过多 5. dNTP、Mg2+浓度偏高 6. 循环次数过多
RNA提取的注意事项 （外界环境中多含Rnase，且RNA极不稳定）
杜绝外源酶的污染：
RNase free DNase free
✓ 严格戴好帽子，口罩，手套。
✓ 实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆， 电泳槽，实验台面等要彻底处理。
✓ 实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须 确保 RNase-Free。
（4）dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过 低则降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降， 影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下 降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
50℃
Taq
72℃
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第第12轮轮P扩扩C增增R的基本原理
第3轮 扩P增CR反应条件
PCR过程 PCR的特点
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数