代谢工程概述
第四章 代谢工程概述
生物技术制药
代谢工程发展的目标
(1) 提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量； (2) 改造细胞现存代谢途径，使其合成新产物， 这种新产物可以是中间代谢产物或修饰性的 最终产物； (3) 对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全 新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成 的新产物； (4) 优化细胞的生物学特性，如生长速率，对 某些极端环境条件的耐受性等。
生物技术制药
推理性代谢工程
推理性代谢工程（简称代谢工程）是采用重 组DNA技术通过改变细胞内有关酶量、酶活 和调节功能而改变细胞的遗传特性以改进微 生物某方面代谢活性，最大限度地提高目的 产物产率的一门技术。其实质是对代谢流量 及控制进行定量分析和在此基础上的代谢改 造。与传统的菌株改造技术不同，是一种有 目的、有理性的改造。
生物技术制药
扩展代谢途径
代谢途径的后延： 草生欧文氏菌产2-酮基古龙酸(2-KLG) 7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的合成 代谢途径的前伸： 利用乳清生产黄原胶
生物技术制药
草生欧文氏菌产2 草生欧文氏菌产2-酮基古龙酸
维生素C前体2 酮基古龙酸(2-KLG)的合成 维生素C前体2-酮基古龙酸(2-KLG)的合成 (2 草生欧文氏菌可转化葡萄糖生成2，5-二酮基葡萄糖酸(2,5DKG)。 棒杆菌2，5-二酮基葡萄糖酸还原酶可转化2，5-二酮基葡萄 糖酸生成2-酮基古龙酸。 将棒杆菌2，5-DKG还原酶转入草生欧文氏菌，这种重组的草 生欧文氏菌可直接转化葡萄糖生成2-酮基古龙酸。但目前产 量还不高。 产量不高的原因：在草生欧文氏菌中发现有2-酮基醛酸还原 酶(KR)，它能把2-酮基古龙酸转化成艾杜糖酸。 如将草生欧文氏菌总的2-酮基醛酸还原酶缺失掉，有可能提 高2-酮基古龙酸。
生物技术制药
代谢工程(幻灯片)
(2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因， 从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物 和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌 能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗 的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途 径等方法来实现。
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三、代谢工程发展趋势
传统的代谢工程是以代谢网络理论为 基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段。 代谢途径的复杂性给检测分析带来不少麻 年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上阻 碍了它的应用。 逆代谢工程
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细胞对于基质的吸收与产物的释放模型 及分析也是代谢工程的重要组成部分。 它包括物质转运过程的生化基础(如转运 蛋白机制、转运动力学、载体介导转运 中的能量偶连以及细胞转运活性的调节 等)、研究方法、过程控制(如生物工艺过 程中营养和吸收的关系、生物工艺过程 中产物的分泌控制、干扰代谢流的结合 以及转运过程的建模)等。
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(2)基因操作 利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络 的核心是在分子水平对基因簇进行遗传操作， 其中最典型的形式包括对靶基因或基因簇的克 隆、表达、修饰、敲除、调控、构建特殊的基 因转移系统以及重组基因在目的细胞染色体上 的稳定整合。 在代谢工程的一些应用实例中，代谢流的 控制和分析也可绕过基因操作，直接通过发酵 和细胞培养的工艺和过程参数控制提高细胞代 谢流，并强制使代谢流流向期望的目标产物。
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(2) 分析技术 在获得大量生化反应基本数据的基 础上，采用化学计量学、分子反应动力学 和化学 程学的研究方法并结合先进的计算 机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的 动态特征与控制机理，以确定代谢改造的 思路。这些分析手段包括能准确测定细胞 内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制 过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组 合法以及代谢网络优化技术等。
代谢工程
代谢工程科技名词定义中文名称：代谢工程英文名称：metabolic engineering定义：通过基因工程的方法改变细胞的代谢途径。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；新陈代谢（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布代谢工程书籍图代谢工程（Metabolic engineering）是生物工程的一个新的分支。
代谢工程把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析——综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。
目录发展前沿展开编辑本段发展为了满足人类对生物的特定需求而对微生物进行代谢途径操作，已有将近半个世纪的历史了。
在氨基酸、抗生素、溶剂和维生素的发酵法生产中，都可以找到一些典型实例。
操作的主要方法是，用化学诱变剂处理微生物，并用创造性的筛选技术来检出已获得优良性状的突变菌株。
尽管这种方法已被广泛地接受并已取得好的效果，但对突变株的遗传和代谢性状的鉴定是很不够的，更何况诱变是随机的，科学不足技巧补！DNA重组的分子生物学技术的开发把代谢操作引进了一个新的层面。
遗传工程使我们有可能对代谢途径的指定酶反应进行精确的修饰，因此，有可能构建精心设计的遗传背景。
DNA重组技术刚进入可行阶段不久，就出现了不少可用来说明这种技术在定向的途径修饰方面的潜在应用的术语。
如分子育种（1981年），体外进化（1988年），微生物工程或代谢途径工程（1988~1991年），细胞工程（1991年）和代谢工程（1991年）。
尽管不同的作者提出不完全相同的定义，这些定义均传达了与代谢工程的总目标和手段相似的含义。
我们曾经把代谢工程定义为，代谢工程就是用DNA重组技术修饰特定的生化反应或引进新的生化反应，直接改善产物的形成和细胞的性能的学科。
这样定义代谢工程强调了代谢工程工作目标的确切性。
生物工程的代谢工程
生物工程的代谢工程生物工程是一门综合性的学科，它涉及生物学、化学、工程学等多个领域的知识。
生物工程的核心目标之一是通过改造生物体的代谢途径，实现有针对性的代谢工程。
代谢工程作为生物工程领域的重要分支，旨在通过调控代谢途径中的关键酶、通路和代谢产物，实现对生物体功能的精准调控和优化。
一、代谢工程的意义和应用领域代谢工程在生物医药、能源生产和化学品合成等领域具有广泛的应用前景。
通过代谢工程，可以设计和构建新型代谢途径，生产具有特定功能的代谢产物，满足人类对药物、医疗材料和工业原料的需求。
例如，通过代谢工程可以合成抗肿瘤药物、抗生素、抗病毒药物等，为生物医药行业提供更多创新药物的来源。
在能源领域，代谢工程可以通过改良微生物或植物的代谢途径，实现高效可持续的能源生产。
例如，利用代谢工程技术，可以通过发酵微生物生产生物柴油、生物乙醇等可再生能源，减少对传统化石能源的依赖，降低能源的排放和对环境的影响。
此外，代谢工程还可以应用于化学合成领域，通过改造微生物代谢途径，生产化工原料和精细化学品。
以生产乙二醇为例，传统合成乙二醇的过程复杂且环境污染，而通过代谢工程技术，可以利用微生物将廉价的废弃物转化为乙二醇，实现可持续化生产。
二、代谢工程的关键技术和方法代谢工程的重要技术和方法包括代谢途径设计、基因工程、系统生物学和高通量筛选等。
1. 代谢途径设计代谢途径设计是代谢工程的核心环节，它涉及对代谢通路及其调控机制的深入了解和分析。
通过理解代谢途径中的酶催化反应、底物与产物的转化关系，可以设计出新的代谢途径，实现对代谢产物的高效合成。
2. 基因工程基因工程是代谢工程的重要手段，它涉及对生物体基因组的改变和调控。
通过改变目标基因的表达水平、调节酶活性或设计新的功能酶，可以实现对代谢途径的重构和优化。
3. 系统生物学系统生物学是利用数学和计算机模拟手段，研究生物体整体代谢网络的行为和特性。
通过建立数学模型，可以对代谢途径进行模拟和预测，为代谢工程的优化和设计提供理论指导。
代谢工程名词解释
代谢工程名词解释
代谢工程
代谢工程是一门研究利用生物技术手段对生物体代谢进行优化和调控的学科。
它综合运用生物学、生物化学、分子生物学、计算机科学等多学科知识，利用基因工程、蛋白工程、酶工程等技术手段，旨在通过调节代谢途径、改变代谢产物生成、提高生物反应器效率等方法，达到提高生产效率、生产新化合物或降低资源消耗的目的。
代谢途径
代谢途径是生物体内进行物质转化和能量转换的路线。
常见的代谢途径包括糖分解途径、脂肪酸合成途径、氨基酸代谢途径等。
通过对代谢途径的研究，代谢工程可以发现调控点并进行优化，从而实现对特定化合物的高效生产。
基因工程
基因工程是利用DNA重组和修改技术来改变生物体的遗传信息。
在代谢工程中，基因工程常用于改变代谢途径中的限速酶活性、优化底物转化率等。
通过定向改变特定基因的表达水平或引入外源基因，可以实现对代谢产物的调控。
蛋白工程
蛋白工程是通过改变蛋白质的结构和功能来改变生物体的代谢性能。
代谢工程中常利用蛋白工程技术改变代谢途径中的酶的催化性能，提高酶的稳定性和活性。
蛋白工程手段包括点突变、重组蛋白表达等。
酶工程
酶工程是通过改变酶的结构和功能来改变生物体的代谢性能。
代谢工程中常利用酶工程技术改变代谢途径中的催化酶的特性，提高底物转化效率和产物选择性。
酶工程手段包括蛋白工程、酶的固定化等。
代谢工程
通过转移代谢途径、构建新的代谢途 径等方法来实现。
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三、代谢工程发展趋势
传统的代谢工程是以代谢网络理论为 基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段 。代谢途径的复杂性给检测分析带来不少 麻 年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上 阻碍了它的应用。
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(1)改变代谢途径方法 加速限速反应
增加限速酶的表达量，来提高产物 产率。然而限速酶反应的改变可能会给 整个代谢网络带来负面影响。 改变分支代谢途径流向
提高代谢分支点某一分支代谢途径 酶活力，使其在与其它的分支代谢途径 的竞争中占据优势，从而提高目的代谢 产物的产量。
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(2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因
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1 代谢网络理论
• 代谢网络理论把细胞的生化反应以网络 整体而不是孤立地考虑。细胞代谢的网 络由上万种酶催化的系列反应系统、膜 传递系统、信号传递系统组成，并且既 受精密调节，又彼此互相协调。
• 各种代谢都不是孤立进行的，而是相互 作用、相互转化、相互制约的一套完整 、统一、灵敏的调节系统。
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代谢中间产物作为生物合成的前体及 能量供应者，转向终产物的碳流的大小将 最终决定终产物的产率。中间代谢产物的 代谢流改变会受到细胞的抑制，并引起胞 内功能的严重改变。传统的代谢工程对中 间产物的生理作用考虑较少，从而使产率 远远达不到所计算的理论最大产率。
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• 弹性系数和流量控制系数是代谢控制分 析研究的两个主要指标。
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4 代谢工程的研究手段
• 代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工 程等领域的最新成果。因此，在研究方法和技 术方面主要有下列三大常用手段： (1)检测技术 常规的化学和生物化学检测手段都可用于 代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的 物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反 应进程和性质的酶促反应动力学分析方法;测定 同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的 光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和 气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据这些 检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态， 并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠 的原始数据。
[新版]代谢工程学
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代谢工程学代谢工程学（Metabolic engineering）又称途径工程，一般定义为通过某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性，或是利用重组DNA技术来创造新的化合物。
它使指利用基因工程或是分子生物学技术，将生体内之代谢路径改变，通常改变生体内化学反应之酶。
代谢工程技术目前以微生物利用为主，改变工业微生物之代谢路径，生产所需要的化学物质，如抗生素。
这一概念由美国学者BaileyJE于1991年首先提出。
其将代谢工程定义为：用重组DNA技术来操纵细胞的酶运输和调节功能从而改进细胞的活性。
Stephanopouls等认为，代谢工程是一种提高菌体生物量或代谢物产量的理性化方法。
Cameron等的定义则精炼一些，即用重组DNA技术有目的地改造中间代谢。
目录[隐藏]∙ 1 研究内容∙ 2 研究意义∙ 3 参考文献代谢工程学-研究内容与其他传统的工程领域相比，途径工程同样强调解析与组合两个特定的步骤，然而在很大程度上途径操作过程基本上是分子生物学原理的一种技术表现形式，真正意义上的工程方面的成份并不占主导地位。
严格地讲，生化反应过程的有关内容并不能定义为途径工程。
更多更显著的工程成份只是反映在途径工程的分析部分，如怎样辨认能反映细胞生理状态的主要参数？怎样利用这些信息组织一个代谢网络的控制设计，并确定合理靶点以修饰构建特定的物种？怎样进一步评估基因或酶的真实修饰效果，以实施新一轮的途径修饰直到最佳状态的确立？取代普通的定向靶点筛选程序，怎样预测一个合理的过程以确定途径操作的最有效靶点？上述问题是途径工程分析部分应解决的问题。
途径工程的一个崭新观点是关注代谢途径的组合而非单一的反应，因此它必须考察完整的生化反应网络，重视途径和目标产物的热力学可行性、代谢流及其控制。
从传统的单一酶反应分析向相互作用的生化反应系统转移是这一组合观点的精髓，其中代谢网络的概念尤其重要，只有这样，生物体代谢运动和细胞功能的图视效果才能被强化。
代谢工程概述
当代生物技术伎俩主要包含基因工程(Gene Engineering)、细胞工程(Cell Engineering)、发酵 工程(Fermentation Engineering)、酶工程(Enzyme Engineering)和生化工程(Biochemical Engineering)，当代生物技术在化工、医药卫生、农 林牧渔、轻工食品、能源和环境等领域都将发挥主要 作用，可促进传统产业改造和新型产业形成，对人类 社会产生深远影响。其中发酵工程是生物技术主要组 成部分，是生物技术转化成产品主要步骤。20世纪90 年代提出代谢工程发展快速，被视为继传统蛋白质多 肽单基因表示（第一代基因工程）、基因定向突变（ 第二代基因工程）之后第三代基因工程。
、代谢物、效应物和其它参数所施加通量控制程 度进行定量表述。
代谢控制关键参数确定以后，人们需要实施这些 改变从而最有效地到达预定目标。在实施通量控 制策略中，不论采取哪种路线，为取得最正确结 果，都应将基因修饰和环境条件改变结合起来使 用。
代谢工程概述
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第二节 代谢工程研究内容
代谢工程实质在于对代谢网络进行定量分析，而且在 此基础上进行代谢改造（代谢网络重组），以最大程 度地提升代谢产物产率。
代谢工程概述
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代谢工程一些基本定义
代谢通量定义为：输入代谢物反应生成输出代 谢物速率。
胞内代谢通量确实定称为代谢通量分析（ metabolic flux analysis，MFA） ，其在代谢 工程处于中心地位。
代谢工程概述
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代谢工程一些基本定义
代谢控制分析(MCA) *Ｍetabolic Control Analysis，简称ＭＣＡ 代谢工程一个主要目标就 是对代谢通量控制了解 。其是经过路径中酶活性
代谢工程概念
代谢工程概念一、名词解释：1代谢工程：应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。
代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。
它属于基因工程的一个重要的分支。
2代谢控制发酵技术：利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵。
3生物技术：是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。
4代谢网络的节点（Node）：微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）称作节点。
在不同条件下，代谢流分布变化较大的节点称为主节点。
根据节点下游分支的可变程度，节点分为柔性、弱刚性、强刚性三种。
5柔性节点（Flexible Node）：是节点的一种类型，是流量分配容易改变并满足代谢需求的一类节点。
（指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加）。
6强刚性节点：若一个节点的一个或多个分支途径的流量分割率受到严格控制，那么这类节点就称为强刚性节点。
（指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。
）。
7弱刚性节点：若一个节点的流量分配由它的某一分支途径的分支动力学所控制，则称该节点是弱刚性节点，介于柔性节点和强刚性节点之间。
8代谢流（Flux）：定义为流入代谢物被途径加工成流出代谢物的速率。
9途径工程（Pathway Engineering）：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。
10合成生物学：简单地说，合成生物学是通过设计和构建自然界中不存在的人工生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题的一门新兴学科。
2微生物代谢工程的基本概念
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1. 微生物细胞能为其自身提供代谢能 微生物细胞的生存方式与动物、植物
等高等生物的细胞不同，微生物细胞能独 立存在、自主生活。因此每个微生物细胞 都具有能量转换机构，这种机构可把其它 形式的能量转换成能被其自身直接使用的 能量(如 ATP、GTP 和储存在膜上的质子 运动势 ΔP )，暂且把它们称为代谢能。在 代谢能的直接支撑下，活细胞才能维持其 高度有序的状态。
为了提高产物对原料的转化率， 就要求代谢主流(根据代谢分析的结果) 经设定的载流路径流到目的产物。因 为这样的载流路径是带有主观导向性 的虚拟的载流途径，所以把它们叫做 理想载流路径。
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13.微生物代谢工程的难题
既然微生物的代谢主流对网络中 的途径有自主的选择性，而工业发酵 的目标又是要微生物的代谢主流经过 理想载流途径，流到目的产物，因此 就有必要去解决理想载流途径的设计 问题和对代谢主流的合理导向问题。
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2.细胞能量转换机构的组成
微生物细胞的能量转换机构包括： 需要代谢能来激活的代谢途径的有关的 酶和这些酶的辅酶、原核微生物的细胞 质膜和真核微生物线粒体的内膜，以及 这些膜上的电子传递链和ATP酶，还有 在能量代谢和主动输送中起辅助作用的 有关载体系统。
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3.微生物细胞代谢的电子流和电子回路
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23.限制性遗传信息之谜
可以推测在每个微生物细胞的遗传
物质中必有其限制性的生死攸关的遗传 信息，它们规定微生物细胞生命活动的 基本的代谢网络及其调节机制。这些遗 传信息是微生物细胞能够自主生活与独 立存在的依据，也是微生物对环境的有 限的适应性以及设计育种的计划往往不 能完全兑现的内在原因。
代谢工程
代谢工程：（部分）把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析——综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。
代谢工程与随机诱变育种的优势：在代谢工程中工作计划的定向性更加集中,更加有针对性。
这定向性在酶的目标的选择，实验的设计，数据的分析上起着支配的作用。
代谢工程可在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程，其不仅在解释细胞生理特性上具有重要的科学意义，而且其潜在的应用跨越了生物技术的全部领域，主要包括：(1)异源蛋白的生产；(2)扩大底物利用范围；(3)生产原来不存在的新物质；(4)对环境有害物质的降解；(5)提高菌体对环境的适应能力；(6)阻断或降低副产物的生成；(7)代谢产品生产速率和生产能力的提高；(8)植物代谢工程；(9)动物代谢工程；(10)人体和组织代谢工程一人类疾病诊断和基因治疗。
代谢途径是将一组特定的流入和流出代谢物质联系在一起的一个生化反应序列。
代谢流(物流/通量)(flux)：流入代谢物经该途径转变为流出物的速率。
代谢网络可视为由若干个串联或并联的简单子途径组成，它们通过节点相连。
节点分为柔性、强刚性及弱刚性节点三类。
柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。
强刚性节点:是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。
弱刚性节点:介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。
代谢物流分析：一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。
代谢控制分析:物流控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的物流比其他的更大些，可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，即用一途径的物流和以物流控制系数来定量表示酶活之间的关系。
代谢工程概述课件
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3、研究生物合成机制的常用方法 （1）刺激实验法 （2）同位素示踪法 （3）洗涤菌丝悬浮法 （4）无细胞抽提法 （5）遗传特性诱变法
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• 刺激实验法：在发酵培养基中，加入某些可能是 前体的物质，观察该物质在发酵过程中的被利用 情况与促进目的产物生成的效果。
• 洗涤菌丝法（或称静息细胞法）：取不同生长阶 段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分及代谢产 物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内，在一定 条件下继续观察被试验的化合物对菌体代谢和对 产物合成的影响。
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• 3、数学及计算机工具：研究代谢工程不仅需要遗 传学知识，而且需要对寄主菌的生化代谢途径和 生理学有深入的理解，所以将DNA数据库的信息 应用于代谢工程并开发出适合的软件系统是十分 必要的，Karp等构建了981个生命体化合物数据库， 为未来的发展奠定了基础。人们已在实验的基础
代谢工程
( Metabolic Engineering )
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第一节 代谢工程概述
现代生物技术手段主要包括：
• 基因工程 (Gene Engineering) • 细胞工程 (Cell Engineering) • 发酵工程 (Fermentation Engineering) • 酶工程 (Enzyme Engineering)
• （1）1988年MacQuitty指出，微生物途径工程 (Microbial Pathway engineering)是利用DNA重 组技术修饰各种代谢途径（包括生物体非固有 的代谢途径），提高特定代谢物的产量。
• （ 2 ） 1991 年 Bailey 将 代 谢 工 程 (Metabolic engineering)定义为：利用DNA重组技术优化细 胞的酶活、转运和调控功能，提高细胞活力。
代谢工程概述及应用
代谢工程的应用
菌种改良书生物技术发展的一个重要组成部分，而代 谢工程可以指导我们更好的进行改良。 目标：（1）优化细胞的生物学特性，提高细胞现存代谢 目标 途径中目的代谢物的产量及产率。 （2）拓宽对基质的利用范围，降低成本。 方法：基因工程技术和常规诱变技术 方法
应用实例： 乳酸高产菌的研究 应用实例：D-乳酸高产菌的研究
代谢工程概述及其应用
组员：徐俊 费文斌 薛刚 何剑
代谢工程基本概念
代谢工程：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞 代谢工程 代谢网络，并通过DNA重组技术对细胞的酶、转运及 调控功能进行修饰，进而完成细胞特性改造的应用性 学科。（Bailey） 代谢途径：催化总的代谢物的转化、信息传递和其他 代谢途径 细胞功能的酶促反应的集合 代谢网络：分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送体 代谢网络 系的有序组合构成代谢网络。
将高产菌株Y2-4和Y2-8传代，从上表可知其产酸能力较筛选初期有 和 传代， 将高产菌株 传代 所下降，但基本稳定，产酸变化在± 所下降，但基本稳定，产酸变化在±10%以内 以内
参考文献
Baliey J . E. Science ,1991 ,252 :1668 –1675
胡永红, 管珺, 杨文革等. 发酵法生产D-乳酸的研究进展[J]．食品与发酵工业, 2007, 33(12): 99-103. Ishida N, Suzuki T, Tokuhiro K, et al. D-lactic acid production by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006, 101: 172-177. Okino S, Suda M, Fujikura K, et al. Production of D-lactic acid by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78: 449-454. 其他主要参考许婷婷博士论文《 离子束诱变选rtp诱变育种产d乳酸大肠杆菌w3110中的丙酮酸代谢途径的改造该菌株在只含葡萄糖及无机盐的培养基中对糖的总转化率接近理论最大值达到98d乳酸产量达到485ishida等人利用酿酒酵母成功构建了一株产d乳酸的代谢工程菌在这个重组体里原先的丙酮酸脱羧酶编码区被完全去除取而代之的是d乳酸脱氢酶的两个拷贝
1.微生物代谢工程概述
2020/8/3
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• 目前代谢工程较系统的定义如下：
应用重组DNA技术和应用分析生物学相 关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作， 改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能 系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活 性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设 计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。简 而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络 有目的的修饰。
2020/8/3
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代谢工程的研究内容
1 代谢流的定量和定向
（1）流量评计原理
A 基于模型动力学
B 控制理论
C 示踪实验
D 磁化转移
F 代谢平衡
（2）代谢流的定向
A 利用环境控制
B 改变细胞组成的控制
C 代谢流向的目标产物的增加
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2 细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析
（1）转运过程的生物化学 A 转运蛋白机制：载体通道泵 B 转运动力学
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• 代谢工程的主要特征就是利用DNA重组 技术，重建代谢网络，改变代谢流及分 支代谢速度，以改进代谢产物及蛋白类 产品，由于外源DNA的引入扩展了固有 的代谢途径，获得了新的化学物质。改 变转化蛋白的过程，减少不必要的废物。
2020/8/3
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• 代谢工程要解决的主要问题就是改变某 些途径中的碳架物质流量或改变碳架物 质流在不同途径中的流量分布。其目标 就是修饰初级代谢，将碳架物质流导入 目的产物的载流途径以获得产物的最大 转化率。
课件-5代谢工程
微生物技术应用——代谢工程 微生物技术应用——代谢工程
1 半个多世纪微生物生理与育种知识的累积
尽管在所有的菌种改良方案中都有某种定 向的含义， 传统的诱变是随机的 向的含义，但传统的诱变是随机的。“定向” 定向” 与随机诱变没有直接关系。 与随机诱变没有直接关系。 没有直接关系 但我们早就根据 但我们早就根据随机诱变后从突变株中筛 得的高产突变株遗传标记， 得的高产突变株遗传标记，及这些突变株的优 突变株遗传标记 良性质的实验结果， 推测代谢途径及其控制 及其 良性质的实验结果，来推测代谢途径及其控制 的机制。 的机制。
5.生化反应途径和代谢途径 5.生化反应途径和代谢途径
一系列按序进行的生物化学反应 构成生化反应途径；若这条途径在活 构成生化反应途径；若这条途径在活 细胞里运行，则为代谢途径。 细胞里运行，则为代谢途径。
6.生化反应网络和代谢网络 6.生化反应网络和代谢网络
生化反应途径按生物化学规律 汇成生化反应网络；代谢途径与跨 汇成生化反应网络； 膜输送系统按代谢规律汇成（物质） 膜输送系统按代谢规律汇成（物质） 代谢网络。 代谢网络。
2.细胞能量转换机构的组成 2.细胞能量转换机构的组成
微生物细胞的能量转换机构包括： 微生物细胞的能量转换机构包括：需 要代谢能来激活的代谢途径的有关的酶和 要代谢能来激活的代谢途径的有关的酶和 这些酶的辅酶、原核微生物的细胞质膜和 这些酶的辅酶、原核微生物的细胞质膜和 细胞质膜 真核微生物线粒体的内膜， 真核微生物线粒体的内膜，以及这些膜上 线粒体的内膜 电子传递链和ATP酶 的电子传递链和ATP酶，还有在能量代谢 载体系统。 和主动输送中起辅助作用的有关载体系统 和主动输送中起辅助作用的有关载体系统。
二、代谢工程的理论基础 （一）基本概念 （二）代谢工程要解决的问题 （三）代谢工程的研究对象、目标与依据 代谢工程的研究对象、 （四）代谢工程的实质 （五）代谢工程理论涉及的内容
代谢工程概述-PPT
• 现代生物技术在化工、医药卫生、农林牧渔、轻 工食品、能源和环境等领域都将发挥重要作用， 可促进传统产业的改造和新型产业的形成，对人 类社会产生深远影响。其中发酵工程是生物技术 的重要组成部分，是生物技术转化成产品的重要 环节。
• 20世纪90年代提出的代谢工程发展迅速，被视为
继传统的蛋白质多肽单基因表达（第一代基因工 程）、基因定向突变（第二代基因工程）之后的
4）胞内代谢物 是细胞内其他化合物，包括不同 代谢途径的中间代谢物和用于大分子合成的结构 单元等。
离心途径
碳架物质从向心板块注入中心板块时所流经的代谢途径统称向心途径。在工业
发酵生产中，培养器中的微生物细胞的代谢是分步进行的。胞外营养物质(一 般要经胞外酶降解后)从培养介质跨膜进入细胞，(一般要)经过“向心途径” 、“中心途径”和“离心途径”等连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目 的产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞回到培养介质中。
• （ 8 ） 1999 年 Koffasl 将 代 谢 工 程 (Metabolic Engineering)定义：利用分子生物学原理系统分析 代谢途径，设计合理的遗传修饰战略从而优化细 胞生物学特性。
• 代谢工程较系统的定义
应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传 学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功 能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以 改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作 （包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代 谢活性的实现）。 简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有 目的的修饰。
• 代谢工程的理论首先由Jay Bailey于1991年 在“Science”杂志上论述了代谢工程的应 用、潜力和设计。
• 同年，Greg Stephanopoulos和Joseph Vallino 在“Science”杂志上论述了有关“过量生 产代谢产物时的代谢工程”、“代谢网络 的刚性、代谢流的分配、关键分叉点及速 度限制步骤”等内容。
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• 现代生物技术在化工、医药卫生、农林牧渔、轻 工食品、能源和环境等领域都将发挥重要作用， 可促进传统产业的改造和新型产业的形成，对人 类社会产生深远影响。其中发酵工程是生物技术 的重要组成部分，是生物技术转化成产品的重要 环节。 • 20世纪90年代提出的代谢工程发展迅速，被视为 继传统的蛋白质多肽单基因表达（第一代基因工 程）、基因定向突变（第二代基因工程）之后的
一、基本概念
1）底物 培养基中存在的化合物，是能被细胞进一步代谢 或直接构成细胞组分。碳源、氮源、能源以及能满足细胞功 能必须的各种矿物元素均属于细胞代谢的底物。葡萄糖作为 细胞生长的主要碳源，是最常见的底物。
2）代谢产物 由细胞合成并分泌到细胞外培养基中的化合 物，可以是初级代谢产物（如二氧化碳、乙醇等），也可以 是次级代谢产物或蛋白质。 3）生物基质要素 构成生物基质大分子池的一类物质，包 括RNA、DNA、蛋白质、脂质和碳水化合物等。
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• 氨基酸和核苷酸发酵的研究进一步推动了抗生素 发酵的研究与生产，发酵由野生型发酵向高度人 为控制的发酵转移；由依赖于微生物分解代谢的 发酵转向依赖于生物合成的发酵，即向代谢产物 大量积累的方向转移。
• 代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生 物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变 和控制微生物的代谢，使得目的产物大量 的生成、积累的发酵。
• 代谢工程的理论首先由Jay Bailey于1991年在 “Science”杂志上论述了代谢工程的应用、潜 力和设计。 • 同年，Greg Stephanopoulos和Joseph Vallino在 “Science”杂志上论述了有关“过量生产代谢 产物时的代谢工程”、“代谢网络的刚性、代 谢流的分配、关键分叉点及速度限制步骤”等 内容。 • 代谢工程也被称为“途径工程”，是基因工 程的重要分支。
• 代谢工程较系统的定义
应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手 段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送 体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些 方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代 谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。 简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的 的修饰。 代谢工程要解决的主要问题就是改变某些途径中的碳 架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分 布。其目标就是修饰初级代谢，将碳架物质流导入目 的产物的载流途径以获得产物的最大转化率。
• 2、分析化学及检测方法：代谢工程的研究 对象是代谢途径，因此必须对代谢通路中 的一些酶及产物进行研究和分析。传统的 分析通路阻断的手段有：物质平衡、同位 素标记、分析障碍突变体等，目前它们仍 然是必不可少的手段，而核磁共振、流式 细胞术的应用则为这一领域的发展增添了 新的活力。
• 3、数学及计算机工具：研究代谢工程不仅 需要遗传学知识，而且需要对寄主菌的生 化代谢途径和生理学有深入的理解，所以 将DNA数据库的信息应用于代谢工程并开发 出适合的软件系统是十分必要的，Karp等构 建了981个生命体化合物数据库，为未来的 发展奠定了基础。人们已在实验的基础上 结合数学和化学的理论，发展了一些人工 智能程序。
2 、细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析
（1）转运过程的生物化学 A 转运蛋白机制：载体通道泵 B 转运动力学 C 载体媒介转运的能量方面：偶联的概念 D 细胞转运活性的调节 （2）研究方法方面 A 转运过程的实验分析 B 扩散和载体媒介转运间的区别 C 转运过程动力学分析 D 生物过程中的转运分析
• 刺激实验法：在发酵培养基中，加入某些可能 是前体的物质，观察该物质在发酵过程中的被 利用情况与促进目的产物生成的效果。 • 洗涤菌丝法（或称静息细胞法）：取不同生长 阶段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分及代 谢产物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内， 在一定条件下继续观察被试验的化合物对菌体 代谢和对产物合成的影响。
代谢工程的主要特征就是利用DNA重组技术 ，重建代谢网络，改变代谢流及分支代谢速 度，以改进代谢产物及蛋白类产品，由于外 源DNA的引入扩展了固有的代谢途径，获得 了新的化学物质。改变转化蛋白的过程，减 少不必要的废物。例如，谷氨酸发酵
代谢工程的研究内容
1、代谢流的定量和定向
（1）流量评计原理 A 基于模型动力学 B 控制理论 C 示踪实验 （2）代谢流的定向 A 利用环境控制 B 改变细胞组成的控制 C 代谢流向的目标产物的增加
• 代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控 制机制，打破微生物正常的代谢调节，人 为地控制微生物的代谢。
• 随着代谢控制发酵理论的逐渐完善，目前已发展 出一个重要的研究分支——代谢工程。 • 它是近年来分子生物学、生物化学、化学工程学 和计算机科学的发展与交叉的产物，从而使生物 技术突飞猛进的发展，使有关的研究进入了细胞 水平。从细胞的代谢途径出发，运用工程学原理 进行代谢调控，使之向产物积累的方向发展，由 此创建了一个新兴的领域，即“代谢工程”。
第三代基因工程。
代谢工程的产生
• 微生物发酵已经有几千年的历史，早在2000多年 以前，人们就开始利用微生物进行白酒、黄酒、 葡萄酒、啤酒和清酒等的发酵，此时的发酵被称 为天然发酵时代。
• 20世纪40年代，随着抗生素青霉素的发酵生产的 大规模进行，开始了现代发酵工业时代。通过自 然选择的方法，人们用10-6的突变几率来筛选所谓 的高产菌株。由于没有代谢控制发酵理论作为指 导，直到20世纪60年代现代发酵工业仍处于盲目 阶段。
• （ 3 ） 1991 年 Tong 等 将 代 谢 途 径 工 程 (Metabolic pathway engineering) 定义：生化途径的修饰、设 计与构建。 • （ 4 ） 1993 年 Cameron 认为，代谢工程 (Metabolic Engineering) 是利用 DNA 重组技术对代谢进行目的 性修饰。 • （ 5 ） 1994 年 Pieperberg 认为代谢工程 / 途径工程 (Pathway engineering/Metabolic design)是改造细胞 代谢途径，提高天然最终产物产量或合成新产物 包括中间产物或修饰型最终产物。
• 1. 生物能支撑观点 • 微生物细胞是工业发酵产物的生产者，微生物细 胞的生长和维持需要由其自身的能量转换机构或 从其他形式的能量转化形成的生物能来支撑。因 此，工业发酵具有生物学属性。
• 2. 代谢网络观点 • 由生化反应网络和跨输送步骤组成的代谢网络既 没有绝对的起点，也没有绝对的终点。代谢网络 中任何一种中间产物(或可借助生物学、化学方法 与代谢网络联网的任何一种化合物)都可能被开发 成为工业发酵的目的产物或原料。
• 3. 细胞经济观点
• 微生物细胞的经济性是在自然选择的过程中逐渐 形成的。野生的(未经人工变异的)微生物细胞在自 然选择的过程中逐渐形成竞争型的细胞经济。 • 而工业发酵往往要以目的产物的生产为主导，调 整代谢网络中的代谢流，构建一种导向型细胞经 济。从竞争型细胞经济的转变取决于遗传和环境 因素的信息导向，这种导向必须遵循细胞经济的 基本运行规律。
1、采用遗传学手段的遗传操作
（1）基因工程技术的应用 （2）常规诱变技术的应用
2、 生物合成途径的代谢调控
（1）生物合成中间产物的定量生物测定 （2）共合成法在生物合成中的应用 （3）酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏
3、研究生物合成机制的常用方法
（1）刺激实验法 （2）同位素示踪法 （3）洗涤菌丝悬浮法 （4）无细胞抽提法 （5）遗传特性诱变法
1、胞外酶对原料的降解及营养物质进入细胞 的过程 2、经胞内降解代谢途径汇入中心代谢途径 3、中心代谢途径及其控制 4、合成代谢流及其控制 5、目的产物的跨膜及其控制
典型的理想载流途径应该由以上五段承担不同代谢分工的依次 衔接的代谢途径组成。这就是载流途径的“五段式”。在这条 载流途径上流动的代谢主流对应地也有五段，这就是代谢主流 的“五段式”。
日本东京帝国大学的教授池田菊苗，1909年 家有味之素,白水变鸡汁 中国，味精，吴蕴初，1923年
• 1956年，日本木下祝朗博士等从东京上野动物园 鸟粪中分离筛选到谷氨酸产生菌，1957年日本协 和发酵公司成功地进行谷氨酸发酵，这是整个氨 基酸发酵的开始，继而迅速掀起了一股氨基酸发 酵研究的热潮。随着对代谢发酵理论的深入研究， 转向发酵菌株本身的研究，获得了很多的氨基酸 高产菌株。 • 随后，核酸类物质发酵产生菌也以代谢控制发酵 理论为指导进行选育，并奋起直追成为后起之秀。
• （ 6 ） 1994 年 Gregory 将 代 谢 工 程 (Metabolic Engineering) 定义：代谢工程是对生化反应的代谢 网络进行目的性修饰。 • （ 7 ） 1996 年 William 将 代 谢 工 程 (Metabolic Engineering) 定义：为达到所需目的，对活细胞的 代谢途径进行修饰。 • （ 8 ） 1999 年 Koffasl 将 代 谢 工 程 (Metabolic Engineering) 定义：利用分子生物学原理系统分析 代谢途径，设计合理的遗传修饰战略从而优化细 胞生物学特性。
KEGG数据库
• http://www.genome.jp/kegg/
代谢工程的三个基本观点
• 在生物工程受到广泛重视的今天，有必要把微 生物 ( 菌种选育 ) 、微生物学过程 ( 发酵工艺 ) 和微 生物学体系(生物反应器)作为一个整体，在科学 的水平上对工业发酵进行重新审视。 • 从工业发酵的现状出发，主要根据对碳元素代 谢及其控制，菌种是化能异养型微生物，产物 是微生物细胞排出细胞的代谢中间产物的工业 发酵，提出了3个基本观点。
第二节
代谢工程的基本理论
一、基本概念
二、代谢物流及其相关特途径
碳架物质从向心板块注入中心板块时所流经的代谢途径统称向心途径。在工业 发酵生产中，培养器中的微生物细胞的代谢是分步进行的。胞外营养物质(一 般要经胞外酶降解后)从培养介质跨膜进入细胞，(一般要)经过“向心途径” 、“中心途径”和“离心途径”等连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目 的产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞回到培养介质中。