透明质酸的分离纯化
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透明质酸的分离纯化
①透明质酸简介 ②制备方法 ③分离纯化
生物化工——潘启胜
透明质酸简介
透明质酸（hyaluronic acid，简称HA ）又名玻璃酸，是一种
线性大分子黏多糖，由（1-β-4）D-葡萄糖醛酸（1-β-3）N-乙酰基-D氨基葡萄糖的双糖单位重复连接组成，商品透明质酸一般为其钠盐， 即透明质酸钠，如图。它存在于动物的各种组织细胞间质中，该物质 是在1934 年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中 分离出来。
小结
从发酵液中分离纯化HA 往往是由多种分离纯化方法联合完成的，单一的分离 纯化方法并不能达到很高的纯化程度，并且每种分离纯化方法也都存在一定的局限 性。 如：在乙醇分离法中，乙醇用量是HA 溶液体积的2 倍，当用于大规模生产时 处理量非常大，进行乙醇分离的车间及设备要采取防爆措施，这势必增加了操作的 危险性和生产成本，因此尚需找到一个替代或减少乙醇用量的更好的方法。 又如：CPC、CTAB 等季铵盐用于直接沉淀发酵液，用量大，成本高，也容易 引起其它多糖和蛋白质的沉淀，影响产品纯度。 因此，只有根据制备目标选择适宜的分离纯化方法，并对工艺过程进行优化， 才能获得高纯度、高分子量的HA。
分离工艺
①乙醇分离
除去发酵液中的菌体后，需要将HA 分离出来，这是一个初步纯化的过程。 乙醇沉淀是分离各种多糖常用的一种方法，可以使HA 有效脱水、脱色，的浓缩，将其作为一种主体技术分离、提纯发 酵液中的HA 也有一定可行性。 HA
③壳聚糖分离
酶解纯化
加入蛋白酶能够使HA 与蛋白质的络合状态解除，HA 更多地游离于溶液中， 使其易于纯化。常用的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，链酶蛋白酶等，链 酶蛋白酶对接近糖蛋白质链肽键上的作用效果优于木瓜蛋白酶，而胃蛋白酶 的水解作用不够彻底，往往需要配以其它酶才能见效。
过滤法纯化
过滤法纯化易于实现工业化，能有效滤除菌体和蛋白质，对分子量影响相对 要小。
微生物发酵法
生物发酵法具有产品不受原料资源限制、生产成本低、工艺简单等特点， 是今后研究开发的方向。发酵法采用的菌种多为兽疫链球菌、马链球菌等， 基因工程菌发酵也见诸报道。利用微生物发酵法生产HA ,其产品的质量和数 量主要取决于三个方面:一是菌种的选育,二是培养基的优选及发酵工艺的优 化,三是HA 的分离纯化。
利用壳聚糖带相反电荷的吸附作用将HA 分离下来的方法
纯化工艺
①季铵盐纯化 ②酶解纯化 ③过滤法纯化 ④离子交换层析纯化 ⑤凝胶过滤柱层析纯化
季铵盐纯化
氯化十六烷基吡啶（CPC）是一种季铵盐类阳离子表面活性剂，它能与
黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀， 而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起HA 与CPC复合物解离所需的盐浓度 远比其它黏多糖与CPC复合物解离所需浓度要低，利用此性质可达到纯化 HA的目的。采用CPC 进行纯化的优点是操作简单，但CPC 回收困难，单位 价格较高，所以应用成本较高。 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）纯化HA 的作用机制与CPC 相似，但 成本相对较低。
分离纯化
分离纯化的主要目的是获得纯度较高的HA，目前国内外一般以葡糖醛酸含 量表示HA 的纯度，保健食品及化妆品级HA 的葡糖醛酸含量为35%～45%，药 用级为42%～48% 。 分离纯化方法很多，在不同阶段所适用的分离纯化技术不尽相同，但总体上 分离纯化工艺过程可以概括为如下流程： 发酵液→预处理→分离（初步纯化）→纯化→干燥→成品 → → → → →
预处理
预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。 对于一些非透明质酸酶缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以 杀灭透明质酸酶，减少HA 分子量的降低。 杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的杀菌剂包括三氯乙酸、氯 仿等。 通过有效除菌可以改善分离效果，使HA 分离得率提高，同时也可以去除 部分杂蛋白。
透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的 生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解 质扩散及运转，促进创伤愈合等，因而被广泛应用于医学、化妆品等 领域。
透明质酸 医药级透明质酸 透明质酸保湿品
透明质酸原液
皮肤中的作用
透明质酸的制备
动物组织提取法
制备透明质酸的常用原料有鸡冠、脐带、眼玻璃体、猪皮等，主要工艺过 程包括提取、除杂和分级分离。不同组织透明质酸的提取纯化过程有一定的 差别。动物组织提取法是当今生产透明质酸最主要的方法，但存在浓度不高、 效率低、成本高、原料来源受限制等缺点。
离子交换层析纯化
在进入HA 纯化阶段后，离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术往 往被采用。与化学方法相比，离子交换层析分离条件温和，不引起分子结构 的变化，己经成为分离提取生物大分子的有效方法
凝胶过滤柱层析纯化
凝胶过滤层析常在纯化阶段的后期被采用，需要根据不同分离纯化目的和HA 分子量大小选择合适的分子筛。
①透明质酸简介 ②制备方法 ③分离纯化
生物化工——潘启胜
透明质酸简介
透明质酸（hyaluronic acid，简称HA ）又名玻璃酸，是一种
线性大分子黏多糖，由（1-β-4）D-葡萄糖醛酸（1-β-3）N-乙酰基-D氨基葡萄糖的双糖单位重复连接组成，商品透明质酸一般为其钠盐， 即透明质酸钠，如图。它存在于动物的各种组织细胞间质中，该物质 是在1934 年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中 分离出来。
小结
从发酵液中分离纯化HA 往往是由多种分离纯化方法联合完成的，单一的分离 纯化方法并不能达到很高的纯化程度，并且每种分离纯化方法也都存在一定的局限 性。 如：在乙醇分离法中，乙醇用量是HA 溶液体积的2 倍，当用于大规模生产时 处理量非常大，进行乙醇分离的车间及设备要采取防爆措施，这势必增加了操作的 危险性和生产成本，因此尚需找到一个替代或减少乙醇用量的更好的方法。 又如：CPC、CTAB 等季铵盐用于直接沉淀发酵液，用量大，成本高，也容易 引起其它多糖和蛋白质的沉淀，影响产品纯度。 因此，只有根据制备目标选择适宜的分离纯化方法，并对工艺过程进行优化， 才能获得高纯度、高分子量的HA。
分离工艺
①乙醇分离
除去发酵液中的菌体后，需要将HA 分离出来，这是一个初步纯化的过程。 乙醇沉淀是分离各种多糖常用的一种方法，可以使HA 有效脱水、脱色，的浓缩，将其作为一种主体技术分离、提纯发 酵液中的HA 也有一定可行性。 HA
③壳聚糖分离
酶解纯化
加入蛋白酶能够使HA 与蛋白质的络合状态解除，HA 更多地游离于溶液中， 使其易于纯化。常用的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，链酶蛋白酶等，链 酶蛋白酶对接近糖蛋白质链肽键上的作用效果优于木瓜蛋白酶，而胃蛋白酶 的水解作用不够彻底，往往需要配以其它酶才能见效。
过滤法纯化
过滤法纯化易于实现工业化，能有效滤除菌体和蛋白质，对分子量影响相对 要小。
微生物发酵法
生物发酵法具有产品不受原料资源限制、生产成本低、工艺简单等特点， 是今后研究开发的方向。发酵法采用的菌种多为兽疫链球菌、马链球菌等， 基因工程菌发酵也见诸报道。利用微生物发酵法生产HA ,其产品的质量和数 量主要取决于三个方面:一是菌种的选育,二是培养基的优选及发酵工艺的优 化,三是HA 的分离纯化。
利用壳聚糖带相反电荷的吸附作用将HA 分离下来的方法
纯化工艺
①季铵盐纯化 ②酶解纯化 ③过滤法纯化 ④离子交换层析纯化 ⑤凝胶过滤柱层析纯化
季铵盐纯化
氯化十六烷基吡啶（CPC）是一种季铵盐类阳离子表面活性剂，它能与
黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀， 而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起HA 与CPC复合物解离所需的盐浓度 远比其它黏多糖与CPC复合物解离所需浓度要低，利用此性质可达到纯化 HA的目的。采用CPC 进行纯化的优点是操作简单，但CPC 回收困难，单位 价格较高，所以应用成本较高。 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）纯化HA 的作用机制与CPC 相似，但 成本相对较低。
分离纯化
分离纯化的主要目的是获得纯度较高的HA，目前国内外一般以葡糖醛酸含 量表示HA 的纯度，保健食品及化妆品级HA 的葡糖醛酸含量为35%～45%，药 用级为42%～48% 。 分离纯化方法很多，在不同阶段所适用的分离纯化技术不尽相同，但总体上 分离纯化工艺过程可以概括为如下流程： 发酵液→预处理→分离（初步纯化）→纯化→干燥→成品 → → → → →
预处理
预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。 对于一些非透明质酸酶缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以 杀灭透明质酸酶，减少HA 分子量的降低。 杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的杀菌剂包括三氯乙酸、氯 仿等。 通过有效除菌可以改善分离效果，使HA 分离得率提高，同时也可以去除 部分杂蛋白。
透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的 生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解 质扩散及运转，促进创伤愈合等，因而被广泛应用于医学、化妆品等 领域。
透明质酸 医药级透明质酸 透明质酸保湿品
透明质酸原液
皮肤中的作用
透明质酸的制备
动物组织提取法
制备透明质酸的常用原料有鸡冠、脐带、眼玻璃体、猪皮等，主要工艺过 程包括提取、除杂和分级分离。不同组织透明质酸的提取纯化过程有一定的 差别。动物组织提取法是当今生产透明质酸最主要的方法，但存在浓度不高、 效率低、成本高、原料来源受限制等缺点。
离子交换层析纯化
在进入HA 纯化阶段后，离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术往 往被采用。与化学方法相比，离子交换层析分离条件温和，不引起分子结构 的变化，己经成为分离提取生物大分子的有效方法
凝胶过滤柱层析纯化
凝胶过滤层析常在纯化阶段的后期被采用，需要根据不同分离纯化目的和HA 分子量大小选择合适的分子筛。