酵母基因工程
酵母双杂技术的原理和应用
酵母双杂技术的原理和应用一、酵母双杂技术的原理酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面：1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。
通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。
2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。
同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。
3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补DNA库中的DNA发生相互作用。
然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。
二、酵母双杂技术的应用酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面：1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。
这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。
2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。
这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。
3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作用的蛋白，从而推断目标基因的功能。
这有助于揭示基因的调控机制和功能。
4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。
5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。
第十五章--酵母基因工程
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15.1.2 发展现状
o 在酵母基因工程中发展和应用较多的酵母: 酿酒酵母 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 烷烃利用型降脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） o 应用:改造酵母本身用以提高发酵性能和表达异源 蛋白两方面。
15.1.3 发展趋势
1．解决酵母基因工程中还存在的缺陷 2．在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的 发展方向 3．利用酵母基因工程筛选更多的新药 4．改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 5．酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注
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15.2 酵母表达系统
15.2.1 酵母表达载体
典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭 质粒。 o 原核部分：大肠杆菌中ori和抗生素抗性序列。 o 酵母部分：维持复制的元件，如附加型的2μm质 粒复制起点序列，或染色体的自主复制序列 （auto-replication sequence, ARS），或整合 型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以 及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。 o 分泌型表达载体还要带有信号肽序列
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② 整合型载体
o 整合在酵母细胞染色体基因组DNA上，稳定性高, 但拷贝数量低。 o 不含酵母的复制起始区，而是含与受体菌株基 因组有某种程度同源性的一段DNA序列，能有效 介导载体与宿主染色体之间发生同源重组，使 载体整合到宿主染色体上并随同酵母染色体一 起复制。
外源基因整合靶位点—酵母rDNA单元 o 酵母rDNA单元大小为9.1kb，每个单元包含 有35S rRNA前体和5S rRNA基因，这两个转 录单元之间有非翻译区（NTS），在非翻译 区含有DNA复制原点，如图15-1所示。 o 在rDNA单元中有两个HOT区（激活rDNA间的 重组）和一个TOP区（抑制rDNA间的重组）。 o 如果所取rDNA片段只有HOT区，就容易发生 重组，整合拷贝就容易丢失。 o 如果所取的rDNA片段既有HOT区，又有TOP 区，或者两者都不存在，整合拷贝间就不 容易重组，整合拷贝就很稳定。
酵母菌作为模型生物在研究中的应用
酵母菌作为模型生物在研究中的应用酵母菌是一种单细胞真菌，广泛应用于科学研究中。
作为一种模型生物，他们的简单结构和基因组使得他们成为了基因工程、生物学和医学的理想标准。
今天，我们将探讨一下酵母菌作为模型生物在研究中的应用。
1. 酵母菌的简介酵母菌是真菌界的一种单细胞生物，其名字来源于其在酿造过程中的作用。
它们可以通过无性和有性生殖繁殖，生长极其迅速，只需要十几小时就能分裂，因此酵母菌也被称为毒酒菌。
2. 酵母菌在基因工程中的应用酵母菌的基因组十分简单，只包含6000个左右的基因，而人类基因组则包含3亿多个基因，因此人类的基因研究需要花费大量的时间和精力，而酵母菌则成为了基因工程领域的重要工具。
科学家可以通过人为调整酵母菌基因组，研究基因在细胞生长和发育过程中的作用。
研究表明，酵母菌中的一些基因与健康和疾病相关，因此可以通过对酵母菌的研究来寻找人类疾病的治疗方法。
3. 酵母菌在生物学研究中的应用酵母菌也被广泛用于生物学研究。
在细胞分裂、DNA复制、细胞凋亡等领域中，酵母菌是研究者经常使用的模型生物之一。
他们的分裂周期短，因此可以更容易地观察研究对象。
通过对酵母细胞的观察，科学家可以更好地了解细胞分裂、细胞衰老等基本细胞活动的发生和机制。
4. 酵母菌在医学研究中的应用除了基因工程和生物学外，酵母菌也在医学研究中起着重要的作用。
酵母菌能够模拟许多人类疾病，如癌症、帕金森病和阿尔茨海默病等。
科学家可以通过对酵母菌进行基因改造，将与人类疾病相关的基因注入进去，然后观察研究其对酵母菌的影响和机制。
这种方法被称为“酵母菌疾病模型”，已经被广泛应用于研究许多疾病的治疗方法。
5. 酵母菌在深度学习中的应用近年来，酵母菌还被应用于计算机领域，特别是在深度学习算法中的应用。
科学家通过对酵母菌的生长过程进行监控和分析，建立了酵母菌生长的数值模型，提高了深度学习训练模型的精度和速度。
总之，作为一种模型生物，酵母菌在科学研究中发挥着举足轻重的作用。
酵母菌在基因工程中的应用
酵母菌在基因工程中的应用酵母菌是一类单细胞真核生物，是生物科学研究中的一种常见模式生物。
它们普遍存在于自然界中，可以在发酵食品的制备以及生命科学研究领域发挥着重要的作用。
在基因工程领域中，酵母菌更是被广泛应用，成为了基因工程领域的重要工具之一。
下面我们就来看看，酵母菌在基因工程领域中都有哪些应用吧。
一. 酵母菌作为表达宿主酵母菌是一类常见的蛋白表达宿主，能够快速高效地表达蛋白质，是一种常见的蛋白质产生工具。
一般来说，通过基因工程手段将需要表达的蛋白质的基因导入酵母菌中，利用其自身繁殖特性，迅速高效地表达出需要的蛋白质。
此外，在表达蛋白质的过程中，酵母菌的生长条件相对简单，可以通过温度、氧气、营养等因素的控制来实现高效的表达。
二. 酵母菌在药物研究中的应用当前，越来越多的药物研发都依赖于基因工程技术，而酵母菌则成为了药物研发中的重要工具之一。
通过将需要研发的靶点基因导入酵母菌中，可以模拟药物对生物体内靶点的作用过程。
此外，还可以通过酵母菌对药物副作用的研究，为药物的准确作用机制提供参考。
三. 酵母菌在癌症研究中的应用对于癌症的研究一直以来都是生物学家们所关注的重要问题之一。
而酵母菌则成为了癌症研究中的重要研究工具之一。
通过将癌症相关基因导入到酵母菌中，并通过对其复制、修复和细胞凋亡等过程的研究，可以更好地理解癌症的发生机制和治疗过程，为癌症的诊断和治疗提供更好的参考。
四. 酵母菌在基因组研究中的应用对于生命科学研究而言，基因组研究是一项重要的研究领域。
而目前，酵母菌的基因组研究也在不断地发展。
利用酵母菌基因组研究这一工具，可以揭示基因与生物型之间的关系，探寻基因突变造成遗传性疾病的可能机制，还可以帮助人们更好地理解基因间相互作用，促进基因工程技术的发展。
总之，随着基因工程技术的不断发展，酵母菌作为一种常见的模式生物，也在越来越多的领域中发挥着重要的作用。
通过其快速高效的蛋白表达能力以及对生物学过程的模拟研究，酵母菌为人们揭示了生物世界中的许多秘密。
第七章 酵母基因工程
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
第十五章：酵母菌基因工程选编
③易进行载体DNA的导入。DNA转化技 术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率；
④培养条件简单，容易进行高密度 发酵；
⑤能将外源基因表达产物分泌到培 养基中；
⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻 译后的修饰功能。
2.缺陷在于：
①表达效率相对低； ②酵母常有密码子偏爱性，真核基
因在其中表达时需要人工修正。
2.含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建
①ARS为酵母菌中的自主复制序列，大 小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp 就有一个ARS元件。
②由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而 由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp。
③上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数 最高可达200个，但是经过几代培养 后，质粒丢失率达50%-70%，主要由 于分配不均匀所致。
三．抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬 酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影 响蛋白质的生物活性。整个糖单位 由糖基核心和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿 酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修 饰和加工系统对来自高等动物和人的异 源蛋白活性表达是极为有利的，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很 难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基 化缺陷菌株非常重要。
②YAC载体的装载量建
①YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母 片段只提供选择性标志，没有复制起点。
②转化率低（只有1-10转化子/微克DNA）， 但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。
一．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
酵母基因工程技术的综述与进展展望
酵母基因工程技术的综述与进展展望引言:酵母是一类常见的真核生物，广泛存在于自然界中。
由于酵母具有独特的细胞结构和代谢特性，成为许多科学研究的理想模型生物。
基因工程技术的发展使得研究者们能够通过编辑和改造酵母的基因组，来实现多种生物学和应用学的目标。
本文将对酵母基因工程技术的现状进行综述，并展望未来的发展前景。
一、酵母基因工程技术的发展历程酵母基因工程技术的研究始于20世纪70年代。
最早的酵母基因工程是通过改变酵母细胞的遗传背景，来研究基因功能。
而后，随着重组DNA技术的引入，酵母基因工程迅速发展起来。
1981年，科学家们成功地将人类基因插入到酵母细胞中，这是一个重大突破。
随后的几十年间，酵母基因组测序的完成以及基因敲除和基因重组技术的发展进一步推动了酵母基因工程技术的成熟。
二、酵母基因工程技术的应用领域1. 功能基因组学研究：通过酵母基因组的全面敲除和突变，可以研究基因的功能和相互作用。
这有助于更好地理解酵母细胞的生物学过程，也有助于揭示生物学中的一些基本原理。
2. 药物筛选和开发：酵母作为模型生物，在药物筛选和开发领域具有重要地位。
通过构建酵母表达外源蛋白的系统，可以进行大规模的化合物筛选，以寻找新的药物靶点和治疗方法。
3. 工业应用：酵母在生物技术和食品工业中具有广泛的应用。
例如，酵母可以被用于生产酒精、酵母提取物和酵母蛋白等。
通过基因工程技术改造酵母菌株，可以增加产量和改良产品的品质。
三、酵母基因工程技术的挑战与限制尽管酵母基因工程技术在许多领域中取得了显著进展，但仍然面临一些挑战和限制。
1. 基因组稳定性：酵母细胞往往会发生基因组重排和位点突变等现象，这导致基因敲除和基因重组等操作的结果不一致。
因此，在酵母基因工程中，确保基因组的稳定性仍然是一个关键问题。
2. 效率和选择性：目前的酵母基因工程技术中，基因敲除和基因重组等操作的效率相对较低，并且选择性也较差，这限制了其在实际应用中的广泛推广。
酵母单杂交的原理及应用
酵母单杂交的原理及应用1. 引言酵母单杂交是一种基因工程技术，通过将不同的酵母菌株进行杂交，实现基因的转移和重组。
这种技术在生物医药领域和食品工业等多个领域有广泛的应用。
本文将介绍酵母单杂交的原理，以及其在生物学研究和应用领域的具体应用。
2. 酵母单杂交的原理酵母单杂交是基于两个重要的生物学现象：酵母菌的性别和重组。
酵母菌是一种真核生物，有两种性别：雄性和雌性。
酵母菌的重组是指在有性生殖过程中，两个父本酵母菌的基因经过交换，重新组合成新的基因。
酵母单杂交的原理如下： - 首先，选择两个具有不同性别的酵母菌株。
- 将这两个株种分别培养在不同的培养基中，分别生成没有交配伴侣的单倍体细胞。
- 利用化学或物理方法将两种单倍体细胞融合在一起，形成杂交细胞。
- 将杂交细胞培养在适宜的培养基中，使其进行有性生殖。
- 在有性生殖的过程中，两个亲本酵母的基因进行交换和重组，形成新的基因组。
重组的结果可能是基因突变、基因删除、基因重复等。
- 通过筛选和鉴定，筛选出具有特定性状的酵母单杂交子代。
3. 酵母单杂交的应用3.1 用于基因功能研究酵母单杂交可以用于揭示基因的功能和相互作用关系。
通过将感兴趣的基因与其他酵母菌基因进行单杂交，可以确定该基因的功能和参与的生物过程。
此外，酵母单杂交也可以用于酵母基因组的大规模互作网络研究，帮助科学家理解复杂的生物调节网络。
3.2 用于疾病研究与药物筛选许多疾病与基因突变有关，通过酵母单杂交可以研究基因突变对蛋白质功能的影响，从而揭示疾病机制。
此外，酵母单杂交还可以用于药物筛选。
通过将药物与酵母菌基因进行单杂交，可以评估药物对基因的作用和效果，为新药的发现提供线索。
3.3 用于产酵母菌株的改良与优化酵母单杂交可以用于改良和优化产酵母菌株的特性。
通过筛选和鉴定具有特定性状的酵母单杂交子代，可以选择出高产酵母菌株或改良后的酵母菌株。
这对于酿酒、发酵食品和酶工程等产业具有重要意义。
基因工程研究与训练高产酿酒酵母
基因工程研究与训练高产酿酒酵母富有活力的酿酒酵母是酒类生产中至关重要的元素。
它们被用于发酵过程中，转换糖类物质为乙醇和二氧化碳，是酒中香味和口感的产生者。
然而，传统的酵母进行发酵周期较长，且产量相对较低。
基因工程的发展，为此提供了一条新途径，它可以通过改造酵母细胞的基因，创造出更加高产，更加稳定的酿酒酵母。
基因工程研究基因工程技术是一种用于改变或操作生物体遗传信息的方法。
对于酿酒酵母工程来说，这种方法可以被用来创造出更加强大的酿酒酵母菌株。
对酵母细胞的基因进行编辑，可以使其拥有更加高产的特性，以及更加稳定的品质。
这项技术不断发展，提高酒类生产的效率和成品质量的同时，也为相关领域的发展注入新的活力。
以西斯酿酒酵母为例，这是一种常用的酿酒酵母，但通常需要比较长的温度周期来完成发酵过程。
通过基因工程的手段，可修改酵母细胞的基因，使其产率更高，代谢速率更快。
这样可以大大缩短发酵时间，提高产品产量和品质。
训练高产酿酒酵母除了基因工程技术，训练高产酿酒酵母也是创造更强大的菌株的另一种方法。
一个成功的酵母菌株训练过程包括以下几个步骤：1. 选择目标酵母：训练酵母之前，必须选择一种具备较高发酵能力的初代菌株，作为训练的目标。
2. 静态训练：将目标酵母菌株置于对它来说非常适宜的环境中。
在较短的时间内使其发展繁殖，逐渐使其进入发酵状态。
这种方法可以提高酵母的发酵能力。
3. 动态训练：在静态训练给出的条件基础上，增加外部压力如利用离心力、沉淀、酸性烁杯中培养等方式来逼迫酵母反应并提高其发酵能力，加快发酵周期。
4. 选优汰劣：在训练过程中，将表现不佳的菌株逐渐淘汰，只保留和满足需求的菌株，最后得到高效、高产的酵母菌株。
结论可以预见，随着基因工程技术的不断发展，酿酒酵母生产将会有一个新的革命性的突破，将会大幅提高生产效率，改进产品制造流程和品质。
因此，在这个永远充满变化的行业里，基因工程和训练高效酿酒酵母都是不可或缺的工具，让我们拭目以待酒类生产业的蓬勃发展！。
第8章-酵母基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件
酵母菌是比较成熟的真核生物表达系统。
作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求
①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能 力。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标 记基因，构建出来的质粒称为YIp。目的基因表达盒通常插 在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入 酵母菌特定的染色体DNA区域。
酵母附加体质粒YEp：含有酿酒酵母2m质粒DNA复 制有关的序列，该载体在酵母细胞中稳定，拷贝数 可达60-100。转化效率高（b）。
REP1
A
IR
ori IR
同源重组
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质
B
粒类似。
FLP REP2
第一节 酵母基因工程表达体系 --------载体
酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以 在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（ shuttle vector）。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因序列一般整合入受体的染色体DNA上。其外源基因 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在该系统中获得成功表达。
多型汉逊酵母表达系统
多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上（可连续整合100多 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
第十二章 酵母基因工程-PPT精选文档
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌 (Yeast) 是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
B
REP2
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 • 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
aph
cat
dhfr
cup1
suc2
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
第十二章
酵母基因工程
1974 1978
Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导
酵母菌的基因工程-精品文档
酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于：
1. 安全无毒，不致病； 2. 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3. 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化， 多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。
5.2.3 酵母菌的转化系统 酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳 定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下， 转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但 是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率 的严重制约。 原生质转化法德一个显著特点是，一个受体 细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化 的原生质占转化子总数的25%-33%。
5.2 酵母菌的基因工程
发展历程
1. 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿 酒酵母中存在质粒。 2. 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因 导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷， 标志着酵母表达系统的建立。 3. 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人 干扰素。 4. 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。 5. 2019年在全世界科学家的通力合作下，完成了 第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变
突变
产生的异源蛋白
增加产量（倍数）
作用位点
酵母分子生物学与基因工程研究
酵母分子生物学与基因工程研究酵母是一种单细胞真菌，广泛存在于自然界中，是一种极其重要的生物资源。
在生命科学中，酵母因具有不同寻常的遗传和分子生物学特性而成为一个实验科学家和生物技术研究人员的常用模型。
酵母分子生物学和遗传学的研究已经深化了对细胞周期、蛋白合成、遗传调控和细胞衰老等基本问题的理解。
同时，经过多年的研究，我们也发现，酵母很容易进行基因工程，因而被广泛应用于基因工程研究中。
一、酵母分子生物学研究在酵母分子生物学领域的研究中，人们主要关注酵母的遗传和生化特性，实现对酵母细胞的细致控制和扰动。
其中最重要的研究方向是研究细胞周期、蛋白合成、遗传调控和细胞衰老等基本问题。
1. 细胞周期细胞周期是细胞分裂和增殖的基本过程。
在酵母中，细胞周期通过调节细胞分裂周期的步骤来进行。
酵母细胞在离子和氧气充足的情况下生长很快，其细胞周期仅为2至4小时。
如果细胞受到应激，细胞周期的长度可能会变长，这是因为生长阶段被严重延迟，同时分裂阶段也需要时间来进行。
因此，酵母的细胞周期可以被建模和对其进行数据分析。
这有助于把酵母作为一个模型细胞使用，并对细胞分裂周期进行研究。
2. 蛋白合成蛋白合成是细胞生命周期中最重要的基本过程之一。
酵母呈现了很多不同类型的蛋白质合成模式，包括编码激活特定结构的蛋白质，以及在酵母细胞死亡、肿瘤和其他疾病中起作用的重要酶类的合成。
因此，进行酵母蛋白质合成研究能够进一步加深对细胞生长和分裂的理解。
3. 遗传调控酵母被广泛地应用于生物学研究的原因之一就在于它们的积累很快。
通过遗传杂交和新基因引入等方案，可以确保酵母具有人工引入的基因。
基因诱变和细胞群集分析在酵母敲除和过度表达中也被广泛应用。
因此，酵母的研究有助于理解遗传调控的机制。
4. 细胞衰老酵母的寿命很短，通常仅为数天或数周。
它们的寿命不受疾病、能量饥饿和其他外部因素的干扰。
因此，研究酵母序列和药物等因素对细胞衰老的影响可以为人类提供有关寿命和衰老机制的信息。
生物技术概论论文-酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用
酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用随着科技的发展，食品生物技术在食品工业发展中的地位和作用越来越大，已经渗透到食品工业的方方面面，特别是基因工程技术等技术在21世纪的食品工业中充当重要的角色。
而工程菌就是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系，是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。
主要应用于治理海洋石油泄漏，生产基因工程药物，酵母基因工程中等方面。
而酵母基因工程中，酵母基因工程菌就是菌类细胞株系用的是酵母菌，能够发挥着一定的功能，可以提高发酵的效率。
酵母基因工程的优点：1.是真核生物，大多具有价高的安全性。
2.繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力。
3.将原核生物中已知的分子和基因操作技术与真核生物中复杂的转运后修饰能力相结合，能方便外缘基因的操作。
4.采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导调控。
5.提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物和天然蛋白质一样或类似。
6.酵母菌可表达外源蛋白与末端前导肽融合，指导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰。
7.不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯8.移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物中使用中引起免疫反应的问题。
9.酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序，他具有比大肠杆菌更完备的基因表达控制机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力。
10.酵母可进行蛋白的N-乙酰化，C-甲基化，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要意义。
构建基因工程菌是一个复杂、繁琐的过程，因此构建酵母基因要注意：1、结构简单，易于研究2、繁殖能力强，数目多3、成本低，易于培养、4易于观察。
一．酵母基因工程菌的构建过程：1.目的基因的获取：获取目的基因是实施基因工程的第一步，有三种方法提取目的基因。
（1）从自然界中已有的物种中分离出来：.从基因文库中获取目的基因（俗称：鸟枪法）：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。
酵母同源重组原理
酵母同源重组原理酵母同源重组原理是指利用酵母细胞进行基因工程操作以获得想要的特定基因或蛋白质。
该技术的基本原理是利用酵母细胞自然的DNA重组能力，通过合成或克隆DNA片段，将目标基因或载体DNA序列纳入到酵母细胞染色体中，并让其在细胞内表达，从而实现基因工程改造的目的。
酵母是一类单细胞真菌，常见的有酿酒酵母、面包酵母等，不仅广泛应用于食品工业，还被广泛用于生物学实验中。
酵母细胞具有许多与真核生物相似的生物学特点，包括真正的核糖体、线粒体、内质网和高度保守的基因调控机制。
因此，酵母也成为了生物学研究的理想模式生物。
其中，同源重组是指将同一染色体上的两个相似的DNA序列之间的交换事件。
这种重组机制是酵母细胞通过自然方式进行基因重组的重要方式，同时也是酵母同源重组技术的原理基础之一。
通过利用酵母同源重组技术，可以将外源DNA片段集成到酵母基因组中，实现外源基因的表达。
利用酵母基因工程技术进行基因表达，主要受到以下因素的影响：1、酵母细胞和外源DNA的适应性：外源DNA序列与酵母细胞基因组的适应程度越高，在其整合过程中的成功率就越高。
2、DNA浓度和转化技术：转化DNA的浓度和质量对重组的成功率和效率具有很大的影响，因此DNA的提取方法和转化技术必须严格控制。
3、选择标记：选择标记是用于筛选欲表达基因转化体的标记物质。
在基因工程中，一般会选择具有抗性基因、荧光素酶等作为筛选标记物质。
总之，酵母同源重组技术是一种很重要的基因工程技术，它结合了酵母生物的优越性，可以实现外源基因的高效表达，并且具有特异性与背景低噪声等特点，因此在微生物学研究、基因治疗和生物制药等领域中得到了广泛应用。
基因工程与酵母菌表面展示载体构建
基因工程与酵母菌表面展示载体构建基因工程是一种利用生物技术手段对生物体的基因进行修改和重新组合的过程。
而酵母菌表面展示载体则是一种将外源蛋白质表达在酵母菌表面的工具，用于研究和应用于生物医药领域。
本文将介绍基因工程与酵母菌表面展示载体构建的相关知识和步骤。
首先，进行基因构建前的准备工作。
确定目标蛋白质的序列，为此可以利用已有的文献或数据库进行搜索和筛选。
然后选择合适的酵母菌表面展示载体进行基因的导入和表达。
酵母菌表面展示载体一般包括信号序列、载体复制源、选择标记和目标蛋白质的表达区。
其次，进行基因克隆。
将目标蛋白质的基因序列与酵母菌表面展示载体连接在一起。
这可以通过PCR扩增目标基因、线性化载体，然后利用连接酶将目标基因和载体连接。
也可以利用限制酶将目标基因和载体进行酶切，然后进行连接。
然后，将构建好的基因载体导入酵母菌细胞中。
酵母菌细胞可以利用电转化、化学转化或冷冻转化等方法进行导入。
其中，电转化是最常用的方法，它利用高压脉冲将DNA导入细胞内。
接着，进行酵母菌细胞的培养和表达。
将导入基因载体的酵母菌细胞培养在适当的培养基中，利用荧光检测、Western blot或质谱等方法确认目标蛋白质在细胞内的表达情况。
如果目标蛋白质表达不稳定或表达量较低，可以尝试优化培养条件、选择合适的诱导剂或筛选高表达株系，以提高目标蛋白质的表达水平。
最后，进行酵母菌表面展示验证。
利用荧光显微镜、流式细胞术或ELISA等技术，检测目标蛋白质是否成功表达在酵母菌表面，并研究其在表面展示状态下的稳定性与活性。
还可以利用此酵母菌表面展示系统进行基因工程和酵母菌载体的进一步应用研究，比如疫苗研发、抗体筛选、高通量蛋白质互作研究等。
总结起来，基因工程与酵母菌表面展示载体构建是一项复杂而又有趣的科研工作。
通过合理的基因构建、基因导入和表达调控等步骤，可以实现目标蛋白质的可视化表达和展示，为生物医药领域的研究和应用提供了有力的工具和手段。
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酵母基因工程
一酵母基因工程的发展现状
1.酿酒酵母自身的改造
（1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母
（2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母
（3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母
（4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达
（5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母
2酵母表达异源蛋白
（1）表达水平
（2）表达质量
2酵母基因工程的发展趋势
（1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷
（2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向
（3）利用酵母基因工程筛选更多新药
（4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本
（5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注
3发展历程
1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。
2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补
了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。
3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。
4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。
5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母
全基因组的测序。
二．酵母基因工程的优点
1.安全无毒，不致病；
2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；
3.容易进行载体DNA的导入。
DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可
以取得较高的转化率；
4.培养条件简单，容易进行高密度发酵；
5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中；
6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能
三．酵母表达系统
（1）酵母表达载体
①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。
原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。
酵母部分：
1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)；
整合型载体的整合介导区。
2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列
3基因启动子和终止子序列
4信号肽序列
②载体的复制形式
附加型载体：在酵母染色体外自主复制
1酿酒酵母2μ质粒的DNA的复制元件所构建的
2酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的
整合型载体：随同酵母染色体一起复制
1含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载
体与宿主染色体之间发生同源重组。
2常用的外源基因整合靶位点：rDNA
（2）宿主
广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：
a.酵母属酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
b.克鲁维酵母属乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）
c.毕赤酵母属巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
d.裂殖酵母属非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）
e.汉逊酵母属多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想
（3）酵母DNA转化
①原生质体法：早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质
体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%
②离子溶液法:酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、
热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。
103~104个转化子/μg DNA
③电穿孔法(electroporation)和粒子轰击法(particle bombardment)：酵母
菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA。
105个转化子/μg
DNA
（4）酵母分泌外源蛋白的糖基化
1酿酒酵母分泌的多数外源蛋白均是过度糖基化的(>40个甘露糖残基)；
2巴斯德毕赤酵母分泌表达糖蛋白的寡糖链平均长度约为8~14个甘露糖残
基
3解脂耶氏酵母外源蛋白金含短的寡糖链(8~10个甘露糖残基)
酿酒酵母分泌的外源糖蛋白不适合作为药物治疗使用。
四、酿酒酵母表达系统
（1）、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
酿酒酵母是发酵工业中的主要生产菌株，是最先建立的酵母表达系统。
应用：乙型肝炎疫苗、人胰岛素、粒细胞集落刺激因子
酵母表达系统的不足
•较难进行高密度发酵：发酵时产生乙醇，影响生长代谢和基因产物表达；
•蛋白质的分泌表达能力较差；
•蛋白质的加工过程发生过度糖基化作用。
表达盒式结构组成：
•启动子常用乙醇脱氢酶启动子(P ADH1)和半乳糖诱导型启动子(P GAL)。
•分泌信号用酿酒酵母自身α-交配因子的分泌信号
•终止子用CYC1基因的转录终止子
(2)、巴斯德毕赤酵母表达系统
1、巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。
应用：乙型肝炎表面抗原、肿瘤坏死因子、表皮生长因子和链激酶
2、巴斯德毕赤酵母表达系统的优点
启动子强并受甲醇严格诱导，可用于调控外源基因的表达；
能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基化接近高等真核生物；
外源DNA 的转化、基因替换、基因敲除等操作简单易行，
外源蛋白的表达量比酿酒酵母增加10~100 倍；
容易进行工业化生产，高密度培养干细胞可达100g/L 以上。
3、巴斯德毕赤酵母的整合型载体
启动子
•基因AOX1的启动子(P
)，在它控制下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达；
AOX1
•三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(P
), 组成型启动子，不需甲醇诱导，外源基因表达量高。
GAP
选择标记
•对应于营养缺陷型受体的野生型基因：HIS4 ( 组氨醇脱氢酶基因) ；ARG4(精氨酸合成酶基因)；TRP1(色氨酸合成酶基因)；URA3 ( 尿嘧啶合成酶基因) 。
•抗性选择标记：抗生素G418 抗性基因和Zeocin 抗性基因
信号肽序列
•由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号α-交配因子
4、巴斯德毕赤酵母受体菌
X-33为野生型毕赤酵母。
GS115为HIS4突变型,是使用最广泛的巴斯德毕赤酵母宿主菌，含甲醇利用AOX1和AOX2基因，甲醇利用能力与野生型一样。
KM71为HIS4突变型,AOX1基因缺陷的菌株，在甲醇培养基中生长缓慢，广泛用于多种外源基因的表达。
5、转化方式
转化之前，将表达载体酶切线性化，使之整合于酵母基因组AOX1 或HIS4 基因位置，随酵母生长稳定存在。
转化方法：原生质体法、电击法、LiCl2和PEG法
6 、整合方式
5’AOX1 能与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因；
染色体AOX1 区与载体质粒AOX1 区发生单位点互换；
染色体HIS4 基因与载体的HIS4 基因发生置换。
7、获得高拷贝数整合转化子的方法
不同的转化方法导致产生天然高拷贝转化子。
原生质体法转化使细胞群中产生多拷贝转化子频率相对较高；
体外在载体上多次插入目的基因片段；
将载体中目的基因两端连上来自宿主rDNA 或其他非必需高重复的基因片段，通过同源重组而达到高拷贝整合的目的；
利用基因的功能筛选高拷贝整合。
8、巴斯德毕赤酵母菌株的培养条件
在甘油作碳源的培养液中，细胞迅速生长，菌体密度逐渐增大，但外源基因的表达被完全抑制；
当甘油缺失或被完全消耗，甲醇被添加到培养液中，才诱导大量产生外源蛋白；
最大的通气量可提高表达量。
9 、巴斯德毕赤酵母表达系统的缺点
分子生物学的研究基础差
不是一种食品微生物；
发酵周期一般较长。
五酵母基因工程的应用
应用举例
1利用毕赤酵母生产饲料用植酸酶
2可利用淀粉酿酒酵母的基因工程。