高效液相色谱--仪器分析实验教案

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高效液相色谱原料及教案

三、HPLC系统
HPLC系统一般由储液器、输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。工作流程是：储液器中的流动相被高压泵打入系统样品溶液经进样器进入流动相，呗流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解析的分配过程，各组分在移动速度上
Inject
t
R
W
W
Time
1/2
B
理论塔板数和理论塔板高度的计算方法
理论塔板数 N = 16(tR/WB)2 = 5.54(tR/W1/2)2 理论塔板高度 HETP = L/N
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易(tR/W1/2)2
标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。峰面积(peak area，A)——峰与峰底所包围的面积。
应用最普遍的反相色谱
反相色谱：基于分子的极性分离洗脱次序：极性高的先被洗脱常用的流动相：水和有机溶剂如甲醇、乙腈应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相： C18、C8、苯基等基团反相色谱固定相多为键合相
正相色谱与反相色谱的比较
二、基本概念
1．色谱图和峰参数
色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

高效液相色谱分析实验讲义

高效液相色谱分析实验一、实验目的1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法3．评价色谱柱效4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；5．学习未知样品的定量分析方法。

二、实验原理不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。

色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等1．色谱定性分析方法（1）利用保留值与已知物对照定性A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）2．色谱定量分析方法⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。

⑵常见的色谱定量分析方法主要有：a 归一化法。

特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。

b内标法。

特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。

c 标准曲线法（外标法）。

简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。

d 内标标准曲线法。

三、仪器与试剂LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯四、高效液相色谱仪操作步骤1. 流动相的预处理用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。

2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。

排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。

高效液相色谱实验

高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习《基础分析化学实验（第二版）》137－140页。

【目的】(1) 了解高效液相色谱仪的工作原理；(2) 学习评价液相色谱反相柱的方法。

【原理】高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。

它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。

色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。

而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。

评价色谱柱的性能参数主要有：（1）柱效（理论塔板数）n式中t r 为测试物的保留时间，W 1/2为色谱峰的半峰宽。

（2）容量因子k’式中t 0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。

(3) 相对保留值（选择因子）α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。

(4) 分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间，W b1、W b2分别为两峰的底宽。

对于高斯峰来讲，W b =1.70W 1/2。

为达到好的分离，我们希望n 、α和R s 值尽可能大。

一般的分离（如α=1.2，R s =1.5），需n 达到2000。

柱压一般为104 kPa 或更小一些。

本实验采用多核芳烃作测试物，尿嘧啶为死时间标记物，评价反相色谱柱。

【仪器和试剂】Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i 进样器，440检测器和记录仪组成）色谱柱：5 cm ×4.6 mm I.D., YWG-C 18H 37 (ODS)，10 μm流动相：甲醇－水(80+20)样品I ：含尿嘧啶 (0.010 mg ·mL －1)、萘 (0.010 mg ·mL －1)、联苯 (0.010 mg ·mL －1)、菲（0.006 mg ·mL －1）的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液。

《仪器分析》教案课件PPT-第5章高效液相色谱法PPT文档

四、尺寸排阻色谱法（SEC）（sizeexclusionchromatography）
2017-动相为液体，固定相为固体吸附剂。根据不同组分在固定相上的吸附能力不同而加以分离。
吸附剂
溶质溶剂
2017-6-620
吸附剂
二、液液分配色谱法（LLC）
流动相和固定相都是液体。分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
第五章高效液相色谱法
HighPerformanceLiquidChromatography HPLC
气相色谱中的“气相”代表什么意思？气相色谱：流动相是气体液相色谱：流动相是液体
2017-6-62
第一节高效液相色谱法的特点
一、高效液相色谱法（HPLC）特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分
尺寸排阻色谱法的分离机制：体积排阻效应
样品分子凝胶珠
流动相
溶质在两相间不是靠其相互作用力的不同来进行
分离；而是按照分子大小进行分离的；大分子物质先洗脱出来，小分子
2017-6-626物质后洗脱出来
孔道
凝胶珠内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；
2017-6-611
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六通阀
高压泵
进样前
色谱柱
进样中（Load）
进样后（Inject）
4.色谱柱色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱内径 4.6mm或3.9mm，长度15～30cm，不锈钢柱，填料颗粒5～10μm，柱效为 7000～10000理论塔板数/m。

内蒙古职校仪器分析检测技术教案：高效液相色谱仪的维护

仪器分析检测技术电子教案
教学活动名称
高效液相色谱仪的维护
教学时间
教学地点
授课顺序
学时数
4学时
指导教师
教学目的
1.使学生掌握高效液相色谱仪的维护
2.使学生能解决日常工作中仪器简单的问题
教学活动安排
1.让学生预习高效液相色谱仪的维护。
2.课堂对学生提问，根据学生回答情况教师讲解和举例。
3.课后布置习题让学生练习。
三．柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：
硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100-200ml;l四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。
3.泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。
4.输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)

• 间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆满的选择性分离。
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成流动相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进样阀
色谱柱
检测器
检测器
二、仪器操作（一）开机前的准备
• 在开机前应详细阅读仪器使用说明书，了解仪器的参数、熟悉仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度：用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器
（二）进样装置常见的进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。

高效液相色谱实验

实验1气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定一、目的要求1.了解气相色谱仪的基本结构、工作原理与操作技术；2.学习选择气相色谱分析的最佳条件，了解气相色谱分离样品的基本原理；3.掌握根据保留值，作已知物对照定性的分忻方法。

4.掌握归一化法测定混合物各组分的含量。

二、基本原理气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。

由于物质的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定时间的流动后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。

根据出峰位置，确定组分的名称，根据峰面积确定浓度大小。

对—个混合试样成功地分离，是气相色谱法完成定性及定量分析的前提和基础。

而其中气相色谱分离条件的选择至为关键。

主要涉及以下几个方面：1.载气对柱效的影响：载气对柱效的影响主要表现在组分在载气中的扩散系数D m(g)上，它与载气分子量的平方根成反比，即同一组分在分子量较大的载气中有较小的D m(g)。

根据速率方程：（1）涡流扩散项与载气流速无关；（2）当载气流速u小时，分子扩散项对柱效的影响是主要的，因此选用分子量较大的载气，如N2、Ar，可使组分的扩散系数D m(g)较小，从而减小分子扩散的影响，提高柱效；（3）当载气流速u较大时，传质阻力项对柱效的影响起主导作用，因此选用分子量较小的气体，如H2、He作载气可以减小气相传质阻力，提高柱效。

2.载气流速（u）对柱效的影响：从速率方程可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，所以要使理论塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。

对于选定的色谱柱，在不同载气流速下测定塔板高度，作H-u图。

由图可见，曲线上的最低点，塔板高度最小，柱效最高。

[药学]生物技术本科仪器分析学实验教案

药学生物技术本科仪器分析学实验教案一、实验课程名称：高效液相色谱法测定药物含量1. 实验目的：（1）掌握高效液相色谱（HPLC）的基本操作步骤。

（2）学会使用高效液相色谱仪进行药物含量测定。

（3）理解高效液相色谱法的原理及其在药物分析中的应用。

2. 实验原理：高效液相色谱法（HPLC）是一种利用高压将液体流动相泵入装有固定相的色谱柱，根据药物分子与固定相之间的相互作用力的差异，实现药物的分离和测定。

3. 实验步骤：（1）准备高效液相色谱仪，并检查仪器是否正常工作。

（2）准备对照品溶液和供试品溶液。

（3）设定色谱条件，包括流动相组成、流速、柱温等。

（4）进样并启动仪器，记录色谱图。

（5）计算药物含量。

二、实验课程名称：紫外-可见光谱法测定药物浓度1. 实验目的：（1）掌握紫外-可见光谱法的基本操作步骤。

（2）学会使用紫外-可见分光光度计进行药物浓度测定。

（3）理解紫外-可见光谱法的原理及其在药物分析中的应用。

2. 实验原理：紫外-可见光谱法（UV-Vis Spectroscopy）是利用药物分子对紫外或可见光的吸收特性，通过测定吸光度与药物浓度之间的关系，实现药物浓度的测定。

3. 实验步骤：（1）准备紫外-可见分光光度计，并检查仪器是否正常工作。

（2）准备对照品溶液和供试品溶液。

（3）测定空白溶剂的吸光度。

（4）测定对照品溶液和供试品溶液的吸光度。

（5）根据吸光度与浓度之间的关系，计算药物浓度。

三、实验课程名称：原子吸收光谱法测定金属元素含量1. 实验目的：（1）掌握原子吸收光谱法（AAS）的基本操作步骤。

（2）学会使用原子吸收光谱仪进行金属元素含量测定。

（3）理解原子吸收光谱法的原理及其在药物分析中的应用。

2. 实验原理：原子吸收光谱法（AAS）是利用特定元素的原子在光源的照射下，从基态跃迁到激发态，再回到基态时发出特定波长的光，通过测定该光的强度与元素浓度之间的关系，实现金属元素含量的测定。

3. 实验步骤：（1）准备原子吸收光谱仪，并检查仪器是否正常工作。

仪器分析-高效液相色谱法

提高检测灵敏度。
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质，选择适当的流动相，如有机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量流动相组分，混合均匀，并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采用梯度洗脱技术，以提高分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源，启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制，检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用于检测环境中的有机污染物，如农药、多环芳烃等，为环境污染控制和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可以检测饮用水中的有害物质，如消毒副产物、微量有机物等，保障公众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效果和分离时间。粒径越小，分离效果越好，但分离时间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效果和载样量。长度越长，分离效果越好，但载样量越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧光检测器、电导检测器等，根据被测物质的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER

《仪器分析教程》教学课件—第10章高效液相色谱法

2020/9/1
10.2 高效液相色谱仪
10.2.4 检测系统 4.示差折光检测器
类型：偏转式、反射式和干涉型三种。
2020/9/1
仪器分析教程
10.3 液相色谱速率理论
10.3.1 涡流扩散 10.3.2 分子扩散 10.3.3 固定相传质阻力 10.3.4 流动相传质阻力 10.3.5 提高柱效的方法
根据固定液和流动相的极性不同：（1）正相液—液色谱法
固定液极性大于流动相极性的色谱法。应用：分离极性较强的化合物，如脂肪酸、甾醇类、类脂化合物磷脂类化合物等有机物。
（2）反相液—液色谱法
固定液极性小于流动相极性的色谱法。应用：是目前应用的最多最有效的液相色谱法。适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等非极性或弱极性化合物。
③分析对象
HPLC：受样品挥发度和热稳定性的限制，非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，
大约占有机物的70～80%。
GC：能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；
H mp
Cmd p2 Dm
u
②在流动相滞留区内的传质阻力项Hsm
H sm
Csmd p2 Dm
u
2020/9/1
10.3 液相色谱速率理论
5. 提高柱效的方法
1.采用粒度小而均匀、孔穴较浅的固定相担体，这是提高液相色谱柱效最有效的途径； 2.采用低粘度溶剂作流动相，以减小在柱内的流动阻力； 3.适当降低流动相流速； 4.适当提高柱温，以降低流动相粘度，增大扩散系数。 5.尽量减小连接管、检测器流通池死体积。

高效液相色谱法分析芳香类化合物全文编辑修改

精选全文完整版可编辑修改高效液相色谱法分析芳香类化合物一、实验目的：1、了解高效液相色谱仪的基本结构、原理及操作。

2、了解色谱分离的基本原理，反相分配色谱的基本规律。

3、掌握色谱的基本定性、归一化法定量方法。

二、实验原理：以液体为流动相的色谱称为液相色谱，根据在两相分离过程的物理化学原理不同可分为吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子色谱、亲和色谱等。

本实验主要是分配色谱。

分配色谱即液液色谱，是基于样品分子在包覆于惰性载体上的固定相液体和流动相液体之间根据样品分配系数不同达到分配平衡。

反相分配色谱即流动相极性比固定相大。

反相分配色谱用的是非极性填料分析柱（如ODS-C18），流动相是极性较强溶液（如甲醇和水）。

色谱条件主要包括色谱柱、流动相组成与流速、色谱柱恒温箱温度，检测波长等。

芳香族化合物含有共轭双键，对220nm,254nm的紫外光有较强的吸收，可通过分配色谱分离检测，本实验采用反相HPLC检测。

三、实验仪器及试剂：实验仪器：Agilent 1100型液相色谱仪：真空在线脱气装置、四元梯度泵、多波长检测器。

ODS-C18柱试剂：甲醇（色谱纯），水（超纯水），苯、萘、菲的甲醇溶液，苯、萘、菲的混合液。

四、实验步骤：1、确定实验条件打开计算机，等启动完毕后依次打开输液泵、真空在线脱气装置、柱温箱、检测器开关。

（实验前已操作）通讯完毕后，设定操作条件。

流动相：甲醇/水=80/20；总流速0.500ml/min，设定在220nm，254nm两个波长进行检测30℃。

2、定性分析流动相比例设为甲醇/水=80/20，等基线平稳后依次将苯、萘、菲的甲醇溶液进样5μL，得出三种标准物质的保留时间。

将三种物质的混合溶液进样5μL同样实验条件下比较各峰的保留时间。

3、定量分析（面积归一化法）将上述混合液的定性谱图对应物质的3个峰面积积分校正因子校正后归一化计算（254nm）。

4、流动相组成对混合样保留时间的影响梯度条件1：设定开始时流动相甲醇：水=80:20，平衡至基线稳定后开始进样，完成一次梯度洗脱后，用甲醇：水=80:20的流动相平衡约10min，开始第二次梯度洗脱。

常职院仪器分析测试技术教案5-4高效液相色谱法：外标法测定叶酸片中叶酸含量

液相色谱分析法模块之任务4外标法定量教学任务□讲解样品处理方法□叶酸片中主成分的含量测定□应用外标法进行定量分析□讲解分析中的污染和仪器的维护教学方法□引探与讲练结合教学学时□每20人一个学习组，4人一台液相色谱仪，分组循环操作，整个任务需6学时。

教学设计问题：叶酸片中叶酸含量的测定方法？I汇总所查资料♦,师’共同讨论，教师总结并讲解样品处理方法教师展示测定叶酸j量测定的过程，尤其是样品处理过程学生对此过程中不!!解之处进行提问学生完成叶酸片中叶酸含量的测定操作I学生练习外标法定量，解决实例，评价药品质量I学生讨论，教师引导分析I问题：分析中的污染有哪些？教师讲解高效液相色谱仪的维护I下次课程问题：液相色谱是如何实现混合物的分离？课程引入□问题：叶酸是作为人体必须的营养成份之一，如何测定叶酸片中叶酸的含量？（上次课结束后即布置并安排学生在课后查阅资料）□学生根据所查资料提出解决方案并进行现场讨论以决定各解决方案的优劣。

（教师可事先准备几种办法以备用，如化学分析法、液相色谱法（内标法、外标法）等。

）□最后教师引出本次课程的教学内容：“采用外标法测定叶酸的含量”□药物作为一个复杂的混合物，如何对混合物进行前处理？样品处理（教师可引导学生回忆在以前实训中样品的预处理方法）样品前处理是指样品的制备和对样品中待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。

前处理的目的是消除基质干扰，保护仪器，提高方法的准确度、精密度、选择性和灵敏度。

样品处理是分析检测的美键环节时间，约占分析检测时间的60%。

□提取提取就是用物理的或化学的手段破坏待测组分与样品成分间的结合力，将待测组分从样品中释放出来并转移到易于分析的溶液状态，提取过程可以除去99%以上的样品基质。

经典的方法有均质提取法、振荡提取法、索氏提取法等。

□净化提取过程中，许多与待测组分溶解性相似的杂质将被•起转移出来，这些杂质会干扰对待侧组分的测定，因此需要将待测组分与杂质分离，这个分离过程称为净化。

内蒙古职校仪器分析检测技术教案：高效液相色谱分离原理及理论

仪器分析检测技术电子教案发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。

对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。

③液-固色谱法的应用常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。

2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。

①液-液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

②正相色谱和反相色谱正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。

反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。

正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

③液-液色谱法的固定相常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。

缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉。

采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。

仪器分析第三章高效液相色谱分析

主要分离机理
吸附能，氢键疏水分配作用溶质分子大小库仑力立体效应生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备各种有机化合物的分离、分析与制备高分子分离，分子量及其分布的测定无机离子、有机离子分析手性异构体分离，药物纯化蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。（ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。（3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。（ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合物。（ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好，耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

仪器分析高效液相色谱法

详细描述
离子交换色谱法适用于分离离子化合物，如氨基酸、核酸等。在分离过程中，离子交换剂对不同离子的亲和力不同，通过改变流动相的离子强度和种类，可以实现对不同离子的分离。
体积排阻色谱法
总结词
利用固定相孔径大小排除不同大小的分子进行分离。
详细描述
体积排阻色谱法适用于分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。在分离过程中，固定相的孔径大小不同，能够排除不同大小的分子，从而实现分离。该方法具有较高的分辨率和分离效果。
检测
通过检测器对分离后的组分进行检测，记录数据并进行后续
分析。
03
高效液相色谱法的分离模式
正相色谱法
总结词
利用极性固定相吸附剂，对极性物质的吸附作用进行分离。
详细描述
正相色谱法适用于分离极性物质，如醇、胺、水溶性氨基酸等。在分离过程中，固定相的极性大于流动相的极性，极性物质在固定相上的吸附力较强，因此能够得到较好的分离效果。
金属、霉菌毒素等，保障食品安全。
生物医学研究中的应用
生物分子分离纯化
高效液相色谱法可用于分离和纯化生物分子，如蛋白质、核酸等，为生物医学研究提供高质量的样品。
药物代谢和药代动力学研究
通过高效液相色谱法检测药物在体内的浓度和代谢产物，有助于了解药物的作用机制和代谢途径。
临床诊断和生物标志物分析
高效液相色谱法能够检测生物体中的生物标志物，如氨基酸、脂肪酸、激素等，为临床诊断和疾病研究提供重要信息。
食品分析中的应用
食品添加剂分析
01
高效液相色谱法可用于检测食品中的添加剂，如防腐剂、色素、
甜味剂等，确保食品质量和安全。
营养成分分析
02
通过高效液相色谱法测定食品中的维生素、矿物质和其他营养

高效液相色谱仪PPT教案

反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
常用溶剂的极性顺序：水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯> 四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
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4. 选择流动相时应注意的几个问题
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
检
塞色谱柱筛板引起柱压升高。保护柱除了可以过滤颗粒物外
测
，因为带1厘米长的填料，强保留物质就先留在保护柱的柱芯
器
填料里面，这样可以避免色谱柱被强保留物质污染。
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(4) 液相色谱检测器
分类
按检测原理：光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）热学检测器(如吸附热）电化学学检测器（如库伦、安培）电学检测器（电导、介电常数）
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自动进样器
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（3）色谱柱
色谱柱是高效液相色谱的心脏，在HPLC的使用中，保持色谱柱的柱效，延长柱子的使用寿命非常重要。
色谱柱流速方向
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