L-丝氨酸的酶法合成及分析

4、显色： 用喷雾器将茚三酮溶液喷洒在薄板上（注意 喷雾器和薄板要保持一定距离，不要使硅胶 层吹散，且应喷洒均匀），用热吹风吹干 （或置于105℃烘箱中烘干），即可观察到紫 红色的氨基酸斑点。用铅笔圈出氨基酸斑点， 量出溶剂前沿的距离及各斑点中心与起点之 间的距离，并计算各氨基酸的Rf值。Rf值为迁 移率（rate of flow, Rf），在恒定条件下，每 种氨基酸有其一定的Rf值。
5、 反应时间确定：在5个250ml三角瓶中分别 加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸 至终浓度为10 mmol/L，再加入甲醛至终浓度 10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L， 四氢叶酸至终浓度5 mmol/L，37℃，190rpm 摇床反应时间分别为0h,8h,16h,24h,36h。反应 液进行L-丝氨酸浓度测定。
主要用途 1.作生化试剂和食品添加剂。 2.营养增补剂，在化妆品中作为皮肤营养添加 剂。 3. 可供生物化学和营养学研究之用，也可作 为合成环丝氨酸的原料。
原理 本项目主要研究丝氨酸 羟甲基转移酶催化甘氨 酸生成L-丝氨酸。丝氨酸 羟甲基转移酶（SHMT） 在生物体内是由GlyA 基 因编码的，此酶能在四 氢叶酸(THF)、甲醛及磷 酸吡哆醛5′-PLP 存在下， 催化甘氨酸生成L-丝氨酸。 其反应过程右图所示。
谢谢观看！
原理 薄层层析是一种微量而快速的层离方法。这种层 析方法是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板 上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品 溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当 的溶剂进行展开即为薄层层析。本实验中硅胶作 为一种固相支持物，它与水有较强的亲和力而与 有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在硅胶上的水 是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的 各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时， 它们就能被分离开。
2、甲醛浓度确定：在5个250ml三角瓶中分别 加入上面收集的上清酶液100ml，加入甲醛至 终浓度分别为0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L和20mmol/L，再加入甘氨 酸至终浓10mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度 0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L， 37℃，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝 氨酸浓度测定。
材料 1．仪器 薄层板：6×15cm（×2）、毛细管（×4）、 烧杯50mL（×1）、药匙（×1）、量筒10mL （×1）、小尺子（×1）、层析缸（×1）、 电吹风（×1）、喷雾器（×1）、烘箱 （200℃）
2. 试剂 （1） 标准氨基酸溶液，制备下列各氨基酸的 11.76mol/L(90%)异丙醇溶液各10mL。 ① 0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于 11.76mol/L(90%)异丙醇溶液至10mL ② 0.01mol/L甘氨 酸：称取甘氨酸7.5mg溶于11.76mol/L(90%)异丙醇溶 液至10mL。 ③ 0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶 于11.76mol/L(90%)异丙醇溶液至10mL。 （2）硅胶G（C.P.,层析用）。 （3）粘合剂：0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）:取 CMCNa5g溶于1000mL蒸馏水中，然后煮沸，静置冷却， 弃沉淀，取上清液备用。 （4）层析溶剂：正丁醇（分析纯）﹕冰醋酸（分析 纯）﹕水＝60﹕20﹕20（V/V），临用时配制。 （5）显色剂：0.025mol/L(0.5%)茚三酮-丙酮溶液:称取 茚三酮（A.R.）0.5g溶于无水丙酮（A.R.）至100mL。
王圆 生物制药1313 2013040928
中文名称：L-丝氨酸 外文名称： L-Serine 中文别名：L-2-氨基-3-羟基丙酸 分子结构：
分子式:C3H7NO3
分子量:105.09
物性性质 1. 性状：有左旋体和消旋体两种，左旋体是白色 六角棱柱状晶体，味甜；消旋体是白色单斜棱柱 状晶体。 2. 密度（g/mL,25/4℃）：1.415 3. 相对蒸汽密度（g/mL,空气=1）：未确定 4. 熔点（ºC）： 223～228℃(分解) 5.溶解性：左旋体，溶于水，不溶于无水乙醇和 乙醚；消旋体。略溶于水，不溶于无色乙醇、乙 醚。
4、 pH确定：在5个250ml三角瓶中分别加入 上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨酸至终 浓度为10 mmol/L，再加入甲醛至终浓度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度0.5mmol/L，四 氢叶酸至终浓度5 mmol/L，并调节不同的pH 为6.0,7.0,8.0,9.0,10.0，37℃，190rpm摇床反 应16h。反应液进行L-丝氨酸浓度测定。
材料、试剂、仪器： 1、原料：细菌破碎上清液 2、主要试剂 甘氨酸、甲醛、四氢叶酸、氯化钠、葡萄糖、 无水乙醇、氯化钙、氢氧化钠 3、主要仪器 电子天平，无菌超净工作台，高速离心机、恒 温培养箱
方法 1、甘氨酸浓度确定：在5个250ml三角瓶中分 别加入上面收集的上清酶液100ml，加入甘氨 酸至终浓度分别为6 mmol/L、8mmol/L、 10mmol/L、12mmol/L和14mmol/L，再加入甲 醛至终浓度10 mmol/L，磷酸吡哆醛至终浓度 0.5mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L， 37℃，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝 氨酸浓度测定。
（2）硅胶G（C.P.,层析用）。 （3）粘合剂：0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）: 取CMCNa5g溶于1000mL蒸馏水中，然后煮沸， 静置冷却，弃沉淀，取上清液备用。 （4）层析溶剂：正丁醇（分析纯）﹕冰醋酸 （分析纯）﹕水＝60﹕20﹕20（V/V），临用时 配制。 （5）显色剂：0.025mol/L(0.5%)茚三酮-丙酮溶液: 称取茚三酮（A.R.）0.5g溶于无水丙酮（A.R.）至 100mL。
步骤 1、制板 称取层析用的硅胶G3g加9mL0.5%羧甲基纤维素 钠（CMCNa）,在烧杯中调成均匀糊状，迅速地 倾在1块6×15cm的玻璃板上（玻璃板要清洁平 整，无油污），小心将玻璃板轻轻振荡和倾斜， 使硅胶均匀铺在玻璃板上。室温下静置半小时， 移至105℃烘箱中烘烤1h，选择厚薄均匀平整的 板使用。 （活化：制得的硅胶板如果长时间暴露在外面， 在使用前应放入110℃烘箱中烘烤30分钟，去除 ，必须加入粘合计如煅 石膏、淀粉或羧甲基纤维素钠（CMCNa）， 其中以羧甲基纤维素钠的效果为最好。市售 的硅胶G和氧化铝G均已含有粘合剂（煅石 膏），可直接加水调匀后铺层，但效果稍差。 加粘合剂的薄层板常称硬板，不加粘合剂的 薄层板常称为软板。
2．在操作过程中，手必须洗净，只能接触薄 板上层边角；不能对着薄板说话，以防唾液 掉在板上。 3．配制展层剂时，要用纯溶剂，应现用现配， 以免放置过久其成分发生变化（酯化）。
4. 层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧 烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。 硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。 硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅 胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量 超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可 作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化，当硅 胶加热至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附 的水分即能被除去。当温度升高至500℃时，硅 胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键， 从而丧失了因氢键吸附水分的活往，就不再有吸 附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。 所以硅胶的活化不宜在较高温度进行。
2、点样： 活化后的硅胶板室温冷却后，在距底边2cm水 平线上以间距1cm的宽度确定4个点样点（注 意点样点尽量靠近板中心），用毛细管吸取 氨基酸样品溶液，垂直轻轻接触薄层表面， 每次加样后原点扩散直径大约2-3mm，干后 再点一次。
3、展层： 将薄板有样品的一端浸入扩展剂，扩展剂液 面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。 当展层剂前沿达薄板3/4高度时，停止展层， 取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热 风吹干。
3、磷酸吡哆醛浓度确定：在5个250ml三角瓶 中分别加入上面收集的上清酶液100ml，加入 磷酸吡哆醛至终浓度分别为0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1mmol/L， 再加入甘氨酸至终浓度10 mmol/L，甲醛至终 浓度10mmol/L，四氢叶酸至终浓度5 mmol/L， 37℃，190rpm摇床反应16h。反应液进行L-丝 氨酸浓度测定。