筛选功能(强)启动子
启动子
（ ……T89A89T50A65A100…… ） 的 TATA 区 和 -35 bp 处
（……T85T83G81A61C69A52……）的 TTGACA 区。现已查明，-10位的 TATA 区和
-35位的 TTGACA 区是 RNA 聚合酶与启动子的结合位点，能与 σ 因子相互识别而具
有很高的亲和力。
遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）
以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布
百科名片
RNA 聚合酶特异性识别和结合的 DNA 序列。 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控 制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基 因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由核苷酸组成。启 动 子 本 身 并 不 控 制 基 因 活 动 ， 而 是 通 过 与 称 为 转 录 （ transcription ） 因 子 的 这 种 蛋 白 质 （proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA 聚合酶 polymerases) 的活动。这种酶指导着 RNA 复制。
顺序(consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。
转录单元
转录单元(transcription unit) 是一段从启动子开始至终止子(terminator)结束的 DNA 序列，RNA 聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一 条 RNA 链。在细胞中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。
因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”， 指挥着酶（enzymes）(RNA 聚合酶 polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的 RNA
基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果评估
基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果评估摘要：近年来，基因启动子活性检测技术在克隆表达研究中得到了广泛应用。
本文通过系统综述已有文献，并结合实验研究结果，评估了基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果。
研究发现，基因启动子活性检测技术可通过定量及定位分析启动子活性，从而提高克隆表达效率和精确性。
然而，在选择合适的启动子，优化实验条件和解读数据方面仍存在一些挑战和限制。
因此，进一步的研究和优化仍然需要进行。
引言：基因启动子是调控基因转录的关键序列。
准确评估基因启动子的活性对于克隆表达和基因功能研究具有重要意义。
传统的基因启动子活性检测方法存在一些局限性，如低灵敏度、低通量和复杂操作等。
近年来，随着新技术的出现，基因启动子活性检测在克隆表达研究中得到了广泛应用。
本文旨在评估基因启动子活性检测技术在克隆表达上的效果，为相关领域的研究提供参考和指导。
一、基因启动子活性检测技术的原理和方法1. 荧光素酶报告基因系统荧光素酶报告基因系统是一种常用的基因启动子活性检测方法。
它利用荧光素酶作为报告基因，通过测量其活性来反映启动子的活性水平。
这种方法具有高灵敏度、高通量和低背景的优点，被广泛应用于克隆表达研究。
2. 可视化报告基因系统可视化报告基因系统是另一种常用的基因启动子活性检测方法。
它利用可视化标记（如荧光蛋白和β-半乳糖苷酶等）作为报告基因，使启动子活性的检测结果可以直观地观察和分析。
可视化报告基因系统具有直观、快速和定量化分析的优点，在基因启动子活性检测中得到了广泛应用。
二、基因启动子活性检测技术在克隆表达中的应用1. 提高克隆表达效率通过基因启动子活性检测技术可以筛选出活性高的启动子，从而提高克隆表达效率。
研究发现，活性高的启动子与高表达水平存在正相关关系，选择合适的启动子可以显著提高克隆表达效果。
2. 精确调控克隆表达水平基因启动子活性检测技术可以定量分析启动子的活性水平，从而实现精确调控克隆表达水平。
如何找一个基因的启动子序列呢
1、UCSC（1）网址：在Genome里选择物种，比如human，search里输入你的基因名PTEN，点击Go（2）出现新的页面，看到“Known Gene Names”下面的PTEN了吧，点它（3）又回到了和（1）类似的页面，此时，点击sequence（4）出现一个新的页面，选中promoter，同时可以输入数值修改具体的序列区域，比如Promoter including 2000 bases upstream and 100 downstream，即表示启动子-2000～＋100区域（5）点击“get sequence”，出现页面中最上面的序列“>uc001kfb.1 (promoter 2000 100) PTEN - phosphatase and tensin homolog”就是你要的人PTEN启动子-2000～＋100区域的序列了2、Ensembl（1）网址：在“Search Ensembl“标题下search后的下拉框中选中物种名homo sapiens（人），for框中输入基因名PTEN，点击Go（2）出现的新页面中比较乱，但不要管它，直接寻找“Ensembl protein coding gene ”字样的，对，也就是第二个，点击它（3）新出现的页面也很乱，不过依然不用管它，看到左侧有点肉色（实在不知道怎么描述了）的那些选项了吗，对，就是“Your Ensembl”下面那一堆，在里面找“Genomic sequence”，点它（4）现在的界面就一目了然了，在“5' Flanking sequence”中输入数值确定启动子长度（默认为600），比如1000，点击update；（5）出现的序列中，标为红色的就是基因的外显子，红色之间黑色的序列就是内含子，而第一个红色自然就是第一外显子了，那么从开始的碱基一直到第一个红色的碱基间自然就是启动子-1000~+1的序列啦这样，你不仅查到了启动子，连它的外显子、内含子序列也全部搞定了3、SIB-EPD（1）网址：（2）具体使用方法大同小异，就是输入物种名、基因名，限定启动子序列区域不过有了前两个，我想已经足够用了，个人感觉SIB-EPD的库容量太小，很多基因查不到我以前回的贴，总结一下ensembl一般也和NCBI的一致，你的情况可能例外。
6.目的基因的表达
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列 拼接而成的杂合启动子。 拼接而成的杂合启动子。
启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
成一个操纵子 – 操纵子—原核生物转录单位
– 启动序列决定转录活性大小 – 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 • 负性调节 为主 • 正性调节 • 真核生物： 真核生物： • 顺式作用元件（cis-acting element）-顺式作用元件（ ） 指可影响自身基因表达活性的DNA序列。 自身基因表达活性的 序列。 指可影响自身基因表达活性的 序列 – 非编码序列 – 启动子 – 调控元件 位于远端调控区的顺式作用元 调控元件: 增强子,沉默子 件(增强子 沉默子 增强子 沉默子)
发热量低、需氧低、 发热量低、需氧低、适当的发酵温 度和细胞形态； 度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 容易进行DNA重组技术操作； DNA重组技术操作 产物的产量、产率高， 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类： 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆 菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、 第二类为真核细胞：常用有酵母、 丝状真菌、哺乳动物细胞等。 丝状真菌、哺乳动物细胞等。
Lac 表达系统 负调节因子 lac I 表达系统:
在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白， 与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
功能突变体筛选及其在基因功能研究中的应用
功能突变体筛选及其在基因功能研究中的应用随着基因组学和生命科学领域的发展，越来越多的基因和基因产物的功能需要通过实验验证来确定。
其中，功能突变体筛选被广泛应用于分析基因功能和相关的细胞和生物过程。
本文将探讨功能突变体筛选的概念、策略、应用和未来发展方向。
一、概念功能突变体(allele)是指由于基因组重组、基因组突变、突变、诱变等因素导致的基因或基因产物变异。
在遗传学和分子生物学中，对功能突变体的研究可用于揭示基因和蛋白质的功能、表达和互作方式等信息。
突变体筛选是指通过基因组重组、基因编缉、人工合成等手段制备一系列突变体，然后通过对突变体的筛选和实验观察，找到与所研究基因或功能相关的特定突变，从而进一步揭示相关性的实验方法。
二、策略目前常用的突变体筛选策略主要包括四种，分别是：1.靶点法：针对特定功能或基因，设计相应的突变体序列，并通过不同实验方法(如蛋白质相互作用，酶活性测定等)筛选出相关性突变体。
2.产物法：根据某一特定蛋白质或化合物的质量或活性的变化，找到相应的突变体。
3.细胞筛选法：通过细胞中的特定表型变化，如荧光光谱变化、增值或死亡，从而筛选出与目标基因或产物相关的突变体。
4.深度筛选法：通过对研究对象进行大规模突变体制备和筛选，全面系统地分析了其表型、基因、蛋白质以及代谢及信号传递通路等少数特定产物筛选出像“冰山一角”的突变体。
三、应用功能突变体筛选在生物、医学等研究领域有着广泛的应用。
如：1.基因功能研究：通过对基因产物功能的探究，了解了基因产物与细胞过程的相关性，对基因功能的分析与揭示发挥了重要作用。
2.治疗疾病：通过对突变体的筛选和研究，了解病变基因或特定基因突变的作用，并为治疗相关疾病提供了新的线索。
3.基因启动子研究：针对某一特定基因启动子的序列而设计突变子，进一步探究其表达、修饰等特点，从而为基因启动子的研究提供理论基础。
4.新物种发现：通过分离、鉴定和筛选新物种产物去了解新物种的生物学、化学和生态学性质。
启动子名词解释
启动子名词解释启动子是一种基因组中的特殊序列，它在转录过程中起到了重要的作用。
启动子位于基因的上游区域，通常位于转录起始点的附近。
它的主要功能是为RNA聚合酶提供一个结合位点，从而启动基因的转录过程。
启动子的结构和序列对基因的表达水平和模式起着决定性的作用。
在本文中，我们将讨论启动子的结构、功能以及它在基因调控中的重要性。
启动子的结构。
启动子通常由一系列特定的DNA序列组成，这些序列被称为转录因子结合位点。
这些结合位点是一些特定的蛋白质（转录因子）的结合位点，它们能够与RNA聚合酶和其他调控因子相互作用，从而调控基因的转录。
启动子的结构是非常复杂的，它通常由多个转录因子结合位点组成，这些结合位点之间存在着复杂的相互作用关系。
此外，启动子的结构还受到DNA甲基化、染色质结构和其他表观遗传学修饰的影响。
启动子的功能。
启动子的主要功能是为RNA聚合酶提供一个结合位点，从而启动基因的转录。
在转录过程中，转录因子能够与启动子上的结合位点相互作用，从而招募RNA聚合酶和其他调控因子，形成一个转录复合物。
这个复合物能够在启动子上形成一个开放的DNA结构，从而使RNA聚合酶能够进入并开始转录过程。
此外，启动子还能够调控基因的表达水平和模式，它能够受到外部信号的调控，从而使基因的表达适应不同的环境条件。
启动子在基因调控中的重要性。
启动子在基因调控中起着非常重要的作用。
它能够决定基因的表达水平和模式，从而影响细胞的功能和特性。
启动子的异常结构或功能可能导致基因的异常表达，从而引起一系列疾病。
因此，对启动子的研究不仅有助于理解基因的调控机制，还有助于发现新的药物靶点和疾病诊断标志物。
启动子的研究方法。
对启动子的研究是基因组学和表观遗传学研究的重要内容。
目前，研究人员利用多种方法来研究启动子的结构和功能。
其中，常用的方法包括DNA测序、染色质免疫共沉淀、甲基化特异性PCR和转录组学分析等。
这些方法能够揭示启动子的结构和功能，从而为基因调控的研究提供重要的信息。
基因工程复习资料
基因工程复习资料克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA 分子、细胞或者个体所构成的特殊的生命群体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
化学本质：DNA 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或者整合能力3.为外源基因的扩增或者表达提供条件。
基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA ）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸构成的、具有一个或者数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制与功能基因表达调控系统的工具。
目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它能够与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各类cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称之cDNA文库。
启动子的作用高中生物课本
启动子的作用高中生物课本作用和功能：启动⼦是指⼦段能使特定基因进⼦转录的DNA序列。
启动⼦可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录合成RNA。
在RNA合成RNA聚合酶辨认，并开始转录合成RNA。
在RNA合成中，启动⼦可以和调控基因转录的转录因⼦产生相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核⼦启动⼦区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继⼦控制细胞开始生产哪⼦种蛋⼦质。
启动⼦位于控制基因表达的调控序列中、基因转录起始位点的上游（朝向DNA正义链的5′⼦向），长约100一1000个碱基对。
启动⼦本⼦并⼦编译功能，但它拥有对基因翻译氨基酸的指挥作用，就像⼦⼦旗帜，其核⼦部分是⼦编码区上游的RNA聚合酶结合位点，指挥聚合酶的合成，这种酶指导RNA的复制合成。
因此该段位的启动⼦发生突变（变异），将对基因的表达有着毁灭性作用。
启动⼦代表⼦些重要的元件可以与其他调节区域（如成。
因此该段位的启动⼦发生突变（变异），将对基因的表达有着毁灭性作用。
启动⼦代表⼦些重要的元件可以与其他调节区域（如增强⼦、沉默⼦、边界元件或绝缘⼦）合作⼦致，以主导基因转录的⼦平。
分类诱导型启动⼦：表达载体采用诱导型启动⼦，只有在诱导剂存在的条件下才能表达⼦的产物。
这种⼦法有助于避免菌体生长前期⼦表达对菌体生长的影响，⼦可减少菌体蛋⼦酶对⼦标产物的降解。
特别适合解决有毒蛋⼦的表达。
组成型启动⼦："能够使基因在所有组织中都能启动表达的启动⼦称为组成型启动⼦。
组成型启动⼦的调控不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性。
"⼦般来⼦于管家基因，可连续不断地启动基因的表达。
U6 启动⼦：U6 是⼦型启动⼦，⼦般发现是启动⼦⼦段，不带PolyA 尾的序列。
由Ⅲ类 RNA 聚合酶启动⼦ U6 启动⼦转录产生shRNA，经剪切后产生成熟 siRNA，产生⼦扰效果。
这⼦类启动⼦在腺病毒和慢病毒⼦扰载体的构建中应用很多。
启动子强度定义-概述说明以及解释
启动子强度定义-概述说明以及解释1.引言1.1 概述启动子是基因组DNA序列上的一段区域，它在转录过程中发挥着至关重要的作用。
它是RNA聚合酶结合的起点，将基因转录为mRNA分子，进而被翻译成蛋白质。
启动子的强度是指启动子驱动转录的效率和速率。
在基因的表达调控中，启动子强度的高低决定了该基因在细胞中的转录水平。
因此，对于研究基因表达和功能的科学家来说，理解和定义启动子强度是非常重要的。
通过对启动子序列的分析和比较，我们可以发现不同启动子之间存在差异，这些差异可能影响到该启动子的强度。
在研究中，科学家们通过实验和计算方法来测定和定义启动子的强度。
然而，启动子强度的定义仍然是一个具有挑战性的问题。
不同实验室和研究者使用的方法和标准可能存在差异，导致不同研究结果的比较和统一性的问题。
因此，为了更准确地定义启动子强度，需要进一步研究、讨论和制定标准。
本文将探讨启动子强度的定义和作用，对已有的研究进行总结和归纳，同时展望未来的研究方向。
通过对启动子强度的深入理解，有望为基因表达调控的研究提供更多的科学依据和方法。
1.2文章结构1.2 文章结构本篇文章旨在探讨启动子强度的定义及其在基因表达调控中的作用。
为此，文章将从以下几个方面展开论述。
首先，我们将在引言部分进行概述，介绍基因表达调控的重要性以及启动子在这一过程中的作用。
通过对基因表达调控的背景和需求的分析，引出了对启动子强度进行定义的必要性。
接着，我们将详细讨论启动子的定义和作用。
首先，我们会介绍启动子的概念和结构，以及它在基因转录过程中的具体功能。
然后，我们将探讨启动子在基因表达调控中的重要性，包括它如何影响转录的起始和速率等关键过程。
通过深入理解启动子的定义和作用，我们可以为后续对启动子强度的定义奠定基础。
在正文的第二部分，我们将解释启动子强度的概念。
我们将介绍启动子强度的定义，并讨论该概念的实质意义。
同时，我们还会探讨影响启动子强度的因素，如DNA序列特征和转录因子的结合能力等。
IPTG-诱导表达
IPTG 诱导表达1.原核表达系统将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中高效地表达、合成基因产物的体系。
2.原核生物基因表达特点➢原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。
➢操纵子（operon）是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位3.原核基因的表达调控原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位──操纵子（元），如乳糖（lac）操纵子、阿拉伯糖（ara）操纵子及色氨酸（trp）操纵子（元）等。
操纵子（元）机制在原核基因调控中具有较普遍的意义。
4.乳糖（lac）操纵子（元）调节机制糖操纵子4.乳糖操纵子的结构5.阻遏蛋白的负性调节➢阻遏蛋白的负性调节在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。
此时，I序列在P启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。
当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。
在这个操纵子（元）体系中，➢真正的诱导剂并非乳糖本身。
乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。
后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
➢异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定.6.乳糖操纵子的结构及阻遏作用7.外源基因在原核表达系统中表达的必要条件1.删除内含子和5’非编码区2.外源基因置于强启动子和SD顺序控制下3.维持正确开放阅读框架（ORF）4.mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解8.影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子2、基因剂量3、核糖体结合位点9.常见原核强启动子•Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导•Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。
•Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。
•P L和P R启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。
分析增强子和启动子区别
分析增强子和启动子的区别在基因组学研究中，增强子（enhancer）和启动子（promoter）是两个重要的概念。
它们都是调控基因表达的元件，但在功能和位置上有着明显的区别。
本文将从不同的角度分析增强子和启动子的区别。
1. 定义•增强子：增强子是一种DNA序列，位于基因或远离基因的染色质上，并能够调控靠近或远离它的基因的表达。
增强子通常能够与启动子和转录因子相互作用，增加或提高靶基因的表达水平。
•启动子：启动子是一种DNA序列，位于基因的上游区域（5’末端），与转录因子及RNA聚合酶结合，开始基因的转录过程。
2. 位置增强子和启动子在基因上的位置有明显的差异。
•增强子：增强子通常位于远离基因的位置（上游或下游数千个碱基对），可以通过DNA环路与靠近的启动子相互作用，调节基因的表达。
增强子的作用与距离基因的远近无关，并可以作用于多个基因。
•启动子：启动子通常位于基因的上游区域（上游200至1000个碱基对），与转录因子和RNA聚合酶结合，开始基因转录过程。
3. 功能增强子和启动子在基因调控中发挥不同的作用。
•增强子：增强子能够增加或提高靶基因的表达水平，使该基因在特定条件下更活跃。
增强子通过与启动子和转录因子相互作用，改变染色质构象和调节转录因子的结合，从而影响基因表达。
•启动子：启动子是基因转录的起始点，能够与RNA聚合酶和转录因子结合，开始基因转录过程。
启动子的功能是启动基因的表达，其活性决定了该基因的转录水平。
4. 结构增强子和启动子在结构上也存在差异。
•增强子：增强子通常是几百个碱基对长的DNA序列，具有丰富的转录结合位点和转录因子结合位点。
增强子并不直接参与基因转录，而是通过与启动子区域相互作用来影响基因的表达。
•启动子：启动子通常包括核心启动子和调控序列。
核心启动子是一个短序列（通常为几十个碱基对），与RNA聚合酶结合，直接参与基因的转录过程。
调控序列位于核心启动子上游，包含转录因子结合位点和其他调控元件，可以进一步影响启动子的活性和基因的表达。
启动子功能分析篇
启动⼦功能分析篇研究背景启动⼦是基因的重要组成部分，它的主要功能是控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。
启动⼦就像“开关”，决定基因的活动。
但启动⼦本⾝并不控制基因活动，⽽是通过与转录因⼦结合⽽控制基因活动。
启动⼦⼀般分为⼴谱表达型启动⼦、组织特异性启动⼦、肿瘤特异性启动⼦等多种形式。
基因的启动⼦部分发⽣改变（突变），则可能导致基因表达的调节障碍。
这种变化常见于恶性肿瘤。
鉴于启动⼦的重要功能，⽬前对启动⼦的研究仍旧是⼀个热门话题。
启动⼦特点通常含⼀些特定的元件，如TATA box具有⽅向性：启动下游的基因的表达启动⼦长度的不确定性⼀个基因通常含有多个启动⼦，启动不同转录本的表达某些启动⼦具有表达的时空性和组织特异性。
研究思路对启动⼦功能及结构的研究，可以从以下⼏个⽅⾯着⼿：启动⼦结构研究，包括核⼼启动⼦区域、正调控区域、幅调控区域及增强⼦的确定组织特异性启动⼦筛选及确定转录因⼦与顺式作⽤元件相互作⽤研究启动⼦甲基化作⽤研究新顺式作⽤元件发现及功能鉴定研究路线研究所涉及到的实验技术1.DNA提取；2.基因克隆；3.载体构建；4.⽣物信息学预测；5.细胞培养及转染；6.双荧光检测；7.甲基化检测；8.qPCR；9.EMSA；10.chIP等。
研究启动⼦的意义启动⼦是基因的重要组成部分，启动⼦就像“开关”，决定基因的活动。
启动⼦活性的异常，则可能导致基因表达的调节障碍，从⽽有可能导致疾病的发⽣找到组织特异性启动⼦，为靶向治疗提供可能找到某些疾病关键基因异常表达与启动⼦的关系，为基因治疗提供可能。
启动子
启动子（promoter）是基因的一个组成部分，在遗传学中是指一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。
启动子可以被RNA 聚合酶辨认，并开始转录。
在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域,就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
完全的启动子称为规范序列。
启动子区是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系到转录的效率。
关于其结构特点，Pribnow设计了一个实验，他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNase l水解DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段，约有41～44个核苷酸对。
他先后分离了fd噬菌体、T7噬菌体的A2及A3启动子、h 噬σ菌体的PR启动子及大肠杆菌乳糖操纵子的UV5启动子等5段被酶保护的区域，并进行了序列分析，以后又有人做了50多个启动子的序列分析后发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区（Pribnow box），这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。
许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：RNA聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。
将各种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，用DNase I水解DNA，最后得到与RNA聚合酶结合而未被水解的DNA片段，这些片段有一个由5个核苷酸（TATAA）组成的共同序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框(Pribnowbox），这个框的中央位于起点上游10bp处，所以又称-10序列（-10 sequence），后来在-35 bp处又找到另一个共同序列（TTGACA）。
Hogness等在真核基因中又发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30 bp处的TATAAAAG，也称TATA框（TATAbox）。
基因启动子的结构与功能及其调控机制
基因启动子的结构与功能及其调控机制基因启动子是指控制基因在特定细胞类型中活性的DNA序列。
它由许多调控元件组成，包括启动子本身、增强子和沉默子。
这些元素一起协同工作，通过相互作用来控制基因的表达水平。
基因启动子的结构和功能以及相关调控机制一直是生物学家们研究的热点话题。
一、基因启动子的结构和功能基因启动子通常由短序列组成，大约50个碱基对（bp）左右。
在一些特定的基因中，其启动子可能更长，可达数万个bp。
基因启动子的核心区域是转录起始位点（TSS），这是基因的转录起始点。
为了使RNA聚合酶正确地起始转录，基因启动子必须包含一些特定的序列单元。
除了TSS之外，基因启动子还包含一些重要的区域。
这些区域包括负责特定的组织类型中基因表达的DNA序列（组织特异性元素）、调节RNA聚合酶的结合（启动子结构元素）、帮助改变基因表达水平的元素（增强子和沉默子）等。
这些序列的准确定位和相互作用，决定了基因在不同条件下的表达水平。
基因启动子的功能是通过控制基因转录来调节基因的表达。
当RNA聚合酶在基因启动子区结合并开始转录时，该基因的转录过程就开始了。
基因启动子能够确定是否转录特定的RNA分子，这些RNA分子在生物体内扮演着关键的角色，例如编码蛋白质、基因沉默或是参与转录调控过程等。
二、基因启动子的调控机制基因启动子的调控机制是非常复杂的。
其中包括如下几个方面：1.转录因子结合转录因子是一种结合到DNA上，并调控特定基因转录的蛋白质。
转录因子通过识别启动子中的特定序列单元，并将RNA聚合酶和其他蛋白质招募到这些序列上。
这些序列被称为响应元件，它们是开区间染色质中的特定位置。
通过转录因子的结合，基因启动子的纤维化状态就被调整到适当的状态，以便RNA聚合酶进行相应的转录。
2.DNA甲基化DNA甲基化是一种由DNA甲基转移酶（DNMT）催化的化学反应。
在这个过程中，甲基基团（-CH3）被添加到DNA序列的胞嘧啶基上。
甲基化通常会对基因表达产生影响，被称为表观遗传。
【免费下载】MSX加压筛选与MTX加压筛选
蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系统压力；氨甲喋呤（amethopterin, MTX）筛选用的是二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系统压力。
1. CHO细胞表达体系常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。
CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。
改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。
为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。
向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。
2. 载体系统借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。
目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。
顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。
2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。
生物技术制药简答
表达载体应具备的条件：1载体能够独立复制，有复制起点（2）应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
（3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。
（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。
（6）所产生的mRNA必须有翻译的起始信号。
影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素？外源基因的拷贝数外源基因的表达效率表达产物的稳定性细胞的代谢负荷工程菌的培养条件基因工程药物的分离纯化？胞内产物：细胞破碎→固液分离→包含体→变性→复性→浓缩→初步分离→高度纯化→制剂→产品胞外产物，直接经过浓缩→初步分离→高度纯化→制剂→产品。
蛋白质工程的主要步骤通常包括*：1从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构；（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白质的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用生物技术药物的特征分子结构复杂具有种属特异性治疗针对性强、疗效高稳定性差基因稳定性免疫原性内的半衰期短受体效应多效性和网络性效应检验的特殊性基因工程克隆载体的特点：1有复制子②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点③有选择性遗传标记如抗性基因④拷贝数高⑤生物安全性好真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件⑴载体能够独立复制。
载体本身是一个复制子，具有复制起点。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。
且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。
⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。
⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。
启动子作用
启动子作用启动子（promoter）是DNA序列中的一部分，它能够启动基因的转录过程，并决定了基因在特定条件下的表达水平。
启动子的作用是将转录因子与RNA聚合酶结合在一起，从而将转录因子引导到适当的位置上，从而使转录因子能够识别和结合在特定的DNA序列上，促进基因的转录。
启动子一般由两个重要的序列组成：TATA盒和启动子核心序列。
TATA盒位于转录起点前25-30个核苷酸的位置上，是转录起点的一个重要特征。
启动子核心序列则位于转录起点的附近，它是由一系列转录因子结合位点组成的，这些转录因子可以通过结合到启动子核心序列上来启动基因的转录。
启动子的作用是通过特异性的蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用来实现的。
在转录因子的作用下，RNA聚合酶能够与启动子序列结合，并开始沿着DNA模板链合成RNA链。
启动子的大小和结构对转录的效率和定位具有重要影响。
不同的启动子序列可以招募不同的蛋白质，从而导致不同的转录水平和模式。
启动子的功能可以分为两个方面：定位和调控。
定位是指启动子的位置决定了基因的转录位置和起始位置。
调控是指启动子通过转录因子的作用来调节基因的表达水平。
一个基因的启动子通常具有多个结合位点，不同的转录因子可以结合到启动子上的不同位置，从而调节基因的表达。
此外，启动子的选择性和特异性也对基因的表达水平和模式产生重要影响。
启动子在细菌和真核生物中的作用略有不同。
在细菌中，启动子通常位于转录起点的上游区域，由RNA聚合酶结合位点和细菌特异性转录因子识别位点组成。
在真核生物中，启动子通常位于转录起点的上游区域，但形成复杂的细胞核组织结构和调控网络。
例如，在哺乳动物中，启动子通常由核转录因子（TFIIA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH）和其他转录因子如启动子增强子（enhancer）和转录抑制子（repressor）共同调控。
总结起来，启动子在基因调控中起到了至关重要的作用。
育种中功能性基因的克隆与转移考核试卷
B.使用组成型启动子
C.减少转移基因的长度
D.增加转移基因的长度
17.关于基因克隆，以下哪种说法是正确的？（）
A.克隆的基因可以直接用于转移和表达
B.克隆的基因需要进行序列分析
C.克隆的基因无法在异源生物体中表达
D.克隆的基因只能用于同源生物体
18.功能性基因转移技术在动物育种中的应用不包括以下哪项？（）
2.农杆菌介导的转化法利用农杆菌将外源基因转移到植物细胞中，原理是利用农杆菌的Ti质粒与植物细胞融合，通过植物自身的DNA修复机制整合外源基因。
3.基因沉默可能是由于外源基因与宿主基因组的不兼容性、甲基化、基因位置效应等原因。减少基因沉默的方法包括使用强启动子、优化基因序列、使用组织特异性启动子等。
A.食品安全
B.环境安全
C.生物多样性
D.转基因生物的竞争力
11.以下哪些方法可以用来减少转基因植物中外源基因的沉默现象？（）
A.使用不同的启动子
B.提高转基因的拷贝数
C.优化外源基因的序列
D.使用不同的转化方法
12.功能性基因转移在农业上的应用包括以下哪些方面？（）
A.提高作物的抗病性
B.提高作物的耐盐性
8.在动物育种中，功能性基因转移可以用于以下哪些目的？（）
A.提高动物的生长速度
B.改善动物产品的品质
C.增强动物对疾病的抵抗力
D.改变动物的性别比例
9.以下哪些技术可以用于功能性基因的克隆？（）
A. PCR
B. RT-PCR
C. Southern blot
D. Northern blot
10.转基因生物的安全性问题包括以下哪些方面？（）
A.提高动物的生长速度
启动子和操纵子解释基因表达中的启动子和操纵子是如何发挥作用的
启动子和操纵子解释基因表达中的启动子和操纵子是如何发挥作用的基因是生物体内参与遗传信息传递的基本单位，基因的表达过程可通过启动子和操纵子来调控。
启动子和操纵子是两个重要的调控元件，它们在基因表达中发挥着至关重要的作用。
本文将对启动子和操纵子进行解释，并探讨它们在基因表达中的具体作用。
一、启动子的功能及作用启动子是位于基因的上游区域的一段DNA序列，它能够被转录因子结合，从而启动基因的转录过程。
启动子通常由TATA盒、CAAT盒和GC盒等元件组成。
其中TATA盒是最为典型的启动子序列，它位于转录起始位点的上游约30个碱基对内。
一旦转录因子与启动子结合，RNA聚合酶就能够结合至启动子附近的DNA上，并启动基因的转录。
因此，启动子在基因表达中起到了“开关”的作用，决定了基因是否能够进行转录和表达。
除了起始转录的功能，启动子还能通过调控选择性剪接和转录起始位点选择来调节基因表达。
选择性剪接是指在RNA剪接过程中，不同的外显子可以组合生成不同的转录本，进而产生不同的蛋白质产物。
而转录起始位点的选择则决定了何处开始进行转录，从而影响生成的RNA的长度和序列。
启动子的不同结构和序列可导致转录起始位点的选择差异，进而调节基因表达的类型和水平。
二、操纵子的功能及作用操纵子是一类能够调控基因表达的DNA序列元件，它们可位于基因的上游、下游或内部的位置。
操纵子与转录因子结合后能调节基因的转录速率和产物表达的量。
操纵子通过与转录因子及其他调控蛋白相互作用，影响蛋白质结合、DNA拓扑结构变化以及染色质重塑等过程，进而改变基因的表达状态。
操纵子的功能主要包括增强子和沉默子。
增强子是一类能增强基因表达的DNA序列，与转录因子结合后能够增加基因转录的效率。
增强子可通过增加转录因子的结合位点、增强DNA可及性以及改变基因表达所需的染色质构象来影响基因转录。
相反，沉默子则具有抑制基因表达的功能。
沉默子可通过与反式作用因子结合，阻碍转录因子结合启动子的效率，或者改变基因表达所需的染色质状态，从而抑制基因的转录。
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以氨苄青霉素抗性基因作为报告基因筛选大肠杆菌（原核生物）功能启动子为例，简要说明其强启动子的筛选过程。
强启动子对于基因工程操作中外源基因的表达效率有显著的影响，因此他的筛选具有重要的意义。
在这之前，需要对启动子的一些相关知识进行一些梳理。
大肠杆菌的启动子位于-10区和-35区，而真核生物启动子却不同，因此不能以真核生物的启动子作为筛选目的（反之，亦不可）；常见的原核生物在启动子上虽然没有较大差别，但是为了能高效表达，我们还是从大肠杆菌自身的基因组中选择强启动子，因为这也和外源启动子稳定性和大肠杆菌RNA聚合酶结合的倾向性有感（优先结合与自身）；另外还要考虑载体的拷贝数，多拷贝载体和单拷贝在形成产物的量上是有差别的，当然，如果能够通过载体把外源基因整合到宿主（这里指大肠）上，这样就能防止在传代是质粒不稳定或丢失的现象。
（１）大肠杆菌基因的分离：去垢剂溶解细胞，酚和蛋白酶去除蛋白质，核糖核酸酶去除RNA，乙醇沉淀等步骤，得到大肠杆菌基因组、（２）DNA分子的切割：用限制性核酸内切酶进行切割；限制酶产生的黏性末端、末端转移酶合成的同聚物接尾以及合成的人工接头等。
酶切后的片段中就含有想要得到的启动子片段，片段进行ＰＣＲ扩增。
（３）载体选择：能在大肠杆菌中自主复制，对某些限制酶来说只有一个切口，并在酶作用后不影响其自主繁殖能力。
从细菌核酸中易于
分离和纯化。
在宿主中能以多拷贝形式存在，有利于插入的外源基因表达，能在宿主中稳定地遗传。
进入宿主细胞的载体主要有：a质粒：重组DNA以转化的方式进入宿主细胞；bλ噬菌体：重组DNA以转染的方式进入宿主细胞；c柯斯质粒：以转导的方式进入宿主细胞。
我们这里选择以来自大肠杆菌的含有氨苄青霉素抗性基因的不含启动子的PBR322质粒作为载体（常用的质粒载体，能在基因公司很容易买到因为题目要求要以氨苄青霉素抗性基因作为报告基因）。
酶切质粒（选与2中一样的酶来切，这样就能得到相同的粘性末端，容易将质粒与DNA片段结合），ＰＣＲ扩增至一定量。
（４）质粒片段与ＤＮＡ片段结合，导入受体细胞（这里是大肠）。
（５）将得到的大肠杆菌在液体培养基中进行培养。
（６）制作青霉素梯度平板或者是添加有青霉素的梯度ＬＢ液体培养基。
（７）将５中得到的菌体稀释为菌悬液，在６中涂布培养或液体发酵培养。
（８）含有强启动子菌体的检出。
因为能在青霉素中生长大肠是经过了质粒导入后的氨苄青霉素抗性基因的表达引起的（当然，也有一些是野生型大肠杆菌发生了突变，所以在选择报告基因时我们更应倾向于选择双报告基因作为标记），而他的表达则证明了启动子的存在。
（大多数情况下，在高浓度青霉素环境中生长的都是成功导入质粒载体的菌体，且能在越高浓度青霉素环境生
长的为能高效表达的，即含有强启动子的基因）
（９）将８中检出的菌体在一定量青霉素培养中培养，扩大培养，淘汰不能稳定遗传的菌体，破壁，收集质粒。
收集到的质粒继续以同一种酶切割。
（１０）切割后得到的片段以探针（大肠杆菌－３０区和－１０区启动子为ＣＡＡＴ和ＴＡＴＡ，探针就是由他们的互补链在固定相上做成，可以买的）吸附，富集，得到大肠杆菌的强启动子。