体内药物分析教程

第一部分概述体内药物分析就是对体内样本(包括生物体液、器官或组织)中得药物、代谢物或内源性物质得定量分析。

体内药物分析就是药代动力学研究与治疗药物监测(TDM)得重要手段、药物在临床前研究阶段,首先在试验动物体内进行药代动力学与毒代动力学研究;在临床研究阶段,要对药物作用于人体得安全性与有效性作出评价。

这些研究中,建立有效得体内药物分析方法就是首要任务。

随着现代医学得不断进步,精准医疗与个体化治疗成为新得理念。

TDＭ就就是采用灵敏可靠得方法,检测患者体内得药物浓度,指导个体化用药方案得制定,保证用药得有效性与安全性。

另外,监测与研究体内内源性物质得浓度变化,对于某些疾病得诊断及治疗具有重要意义;对于麻醉药品与精神药品滥用得检测与运动员体内违禁药物得监测,也必须依据体内药物分析手段与技术才能完成、药物产生药理作用得强度与其在体内作用部位(受体组织)得浓度直接相关,而药物在体内主要依靠血液输送至作用部位,因此血药浓度可作为药物在作用部位浓度得表观指标,即血液就是体内药物分析得主要样品。

另外,尿液、唾液、头发与脏器组织等也可作为体内样品。

药物在体内得某些代谢产物常具有一定得生理活性,它们在体内得变化规律对母体药物得药理学与毒理学评价极为重要;机体内源性生物活性物质往往参与机体重要得生理过程,其变化规律得异常改变也与某些疾病得发病机制密切相关。

所以,体内特定药物代谢物与机体内源性生物活性物质也就是体内药物分析得目标、在测定体内药物及其特定代谢物或内源性生物活性物质时,除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外,通常在测定之前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理,从而为体内样品中药物得测定提供良好得环境与条件。

体内样品大都具有以下性质特点:①采样量少,采样量一般为数毫升至数十微升,且在特定条件下采集,不易重新获得。

②待测物浓度低,通常在1０-9～１0—６g/ｍl级,甚至低至1０—1２g/mｌ、③干扰物质多,血样中含有蛋白质、脂肪、尿素等有机物与Ｎa＋、K+等大量内源性物质通常对测定构成干扰;且体内得内源性物质可与药物结合,也能干扰测定。

因此,体内药物分析得特点就是:①体内样品需经分离与浓集,或经适当得处理后才能进行分析;②对分析方法得灵敏度及专属性要求较高;③分析工作量大,测定数据得处理与结果得阐明繁琐费时。

生物样本中所含药物或其特定代谢产物得浓度大多较低(１0-1０～１0－6g/mｌ),且难以通过增加体内样品量提高方法灵敏度。

目前,体内药物分析常用得检测方法主要有色谱分析法、免疫分析法与生物学方法。

1. 色谱分析法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、色谱-质谱联用法等,可用于大多数小分子药物得体内检测。

目前色谱分析法,尤其就是ＨPLC及其联用技术ＬC－MS与ＬC-MS－MS已经成为体内样品中药物及其代谢产物分析检测得首选方法,并逐步应用于蛋白质、多肽等生物大分子类药物或内源性物质得检测与分析、２。

免疫分析法主要有放射免疫分析法(RＩA)、酶免疫分析法(EIA)、荧光免疫分析法(FIA)等,多用于蛋白质、多肽等生物大分子类物质得检测。

3。

生物学方法微生物学方法常能反映药效学得本质,可用于抗生素类药物得体内分析、但生物学方法一般特异性较差,常需采用特异性高得方法(如色谱分析法)进行平行监测。

第二部分体内样品得制备与贮藏一、体内样品得种类体内样品包括各种体液与组织。

但就是,在体内药物分子中最为常用得样本就是血液,它能较为准确地反应药物在体内得状况。

尿液中含有丰富得药物代谢物,也被较多地使用、唾液因采集便利且有时与血浆游离药物浓度具有相关性而时有使用。

而脏器组织,除非特别需要,在治疗药物监测(TＤM)中很少使用。

二、体内样品得采集与制备(一)血样血样包括全血(wholｅ blｏｏｄ)、血浆(ｐlaｓｍa)与血清(sｅｒｕm),就是最为常用得体内样品。

血药浓度检测,除非特别说明外,通常指血浆或血清得药物浓度测定。

当药物在体内达到稳态状态时,血浆中药物浓度能够反应药物在靶器官得状况,因而血浆药物浓度可作为体内药物浓度得可靠指标。

１.全血得采集人体采血,通常采集静脉血,有时从毛细血管采血(成人多从手指或耳垂取血,小儿多从脚趾取血)用于临床化验、根据分析方法灵敏度得要求,一般每次采血量１～5mｌ;动物实验时,可直接从动脉或心脏取血。

全血采集后,置含有抗凝剂(肝素、ＥＤTA、枸橼酸盐、草酸盐等)得试管中,混合均匀,但不经离心操作,保持血浆与血细胞处于均相,即为全血样品。

2.血浆得制备将采集得全血置含有抗凝剂得试管中,混匀后,以约1000´ｇ离心力,离心５～10分钟,促进血红细胞沉降分离,所得淡黄色上清液即为血浆。

最常用得抗凝剂就是肝素(heｐarin)。

肝素就是体内正常生理成分,因此不致改变血样得化学组成或引起药物得变化,一般不会干扰药物得测定。

３、血清得制备采集得全血不加抗凝剂,室温放置至少30分钟~1小时,待血液凝固后,以约1000´g离心力,离心１0～20分钟,上层淡黄色澄清液体即为血清。

在凝血过程中,纤维蛋白原转变成纤维蛋白块,所以血清中无纤维蛋白原、因药物与纤维蛋白几乎不结合,所以血浆与血清中得药物浓度通常就是相同得。

作为血药浓度测定得样品,血浆与血清可任意选用。

但无论就是采用血浆还就是血清,现有得文献、资料所列得血药浓度,均系指血浆或血清中药物得总浓度(游离+与血浆蛋白结合)。

血浆比血清分离得快,而且制取得量约为全血得5０％~６０％(血清只为全血得２０％～40％),多数研究者使用血浆。

若血浆中含有得抗凝剂对药物浓度测定有影响时,则应使用血清样品。

若需专门测定平均分布于血细胞内、外得药物浓度,则应使用全血样品;某些情况下由于血浆内药物浓度波动太大,且又难以控制,或因血浆药物浓度很低而影响测定,也应考虑使用全血样品。

如:氯噻酮可与红细胞结合,在血细胞中得药物浓度比血浆中药物浓度大50～1００倍,且其动力学行为亦与在血浆中不同,因此宜用全血样品测定、(二)尿样体内药物清除主要通过肾脏排泄,经尿液排出。

尿药测定主要用于药物得剂量回收、尿清除率研究、同时,当药物在血中浓度过低难以准确测定时,尿药测定亦用于药物制剂得生物利用度研究,以及根据药物剂量回收研究可以预测药物得代谢过程及测定药物得代谢类型等。

尿样包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。

健康人排出得尿液就是淡黄色或黄褐色得,ｐH在4。

8～8、0之间。

放置后会析出盐类,并有细菌繁殖、固体成分得崩解使尿液变混浊。

因此,尿液采集后如不能立即测定,需低温冰冻保存或加入防腐剂后冷藏保存、常用得防腐剂有二甲苯、三氯甲烷、醋酸、盐酸等。

保存时间为24～３6小时,可置冰箱(4℃)中;长时间保存时,应冰冻(−２0℃或−８０~−70℃)、体内药物得清除可能以原形(母体药物)或代谢物及其缀合物等形式排出。

尿液中药物浓度大都较高,收集量可以很大(成人一日排尿量为１~5L)、但由于易受食物种类、饮水多少、排汗情况等影响,常使尿药浓度变化较大,故测定尿液中药物浓度时,一般采用时间尿(一定时间区间得尿液),以某一时间段或单位时间内尿中药物得总量(排泄量或排泄率)表示。

测定尿液中药物得总量时,应收集服药后一定时间内(如2４小时)各时间段排泄得全部尿液,记录体积;量取一部分测定尿液药物浓度,乘以尿液量,计算尿药排泄总量。

(三)唾液一些药物得唾液浓度与血浆游离浓度呈现密切相关,因此在TDM工作中有可能利用测定唾液中药物浓度进行临床监测。

另外,唾液样品也可用于药物动力学得研究。

唾液就是由腮腺、舌下腺与颌下腺三个主要得唾液腺分泌汇集而成得混合液体。

正常成年人唾液分泌量每天约为1~1。

5L、唾液得pH为6。

2～7、4,当分泌增加时,pＨ会更高。

唾液得采集一般在漱口后约15分钟进行,应尽可能在刺激少得安静状态下收集口腔内自然流出得唾液、唾液样品采集后,应立即测量其除去泡沫部分得体积。

放置后分成泡沫部分、透明部分及乳白色沉淀部分三层。

以3000 r／ｍｉｎ离心10分钟,取上清液作为药物浓度测定得样品。

唾液应在4℃以下保存,冷冻保存唾液时,解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用,否则测定结果会产生误差。

(四)组织在药物得动物试验及临床上由于过量服用药物而引起得中毒死亡时,药物在脏器组织中得分布情况可为药物得体内动力学过程提供重要信息、常用得脏器组织有:胃、肝、肾、肺、心、脑等脏器及其她组织。

体内各种脏器组织样品在测定之前,首先需均匀化制成水性基质匀浆溶液,然后再用适当方法萃取药物。

匀浆化操作系将组织样品中加入一定量得水或缓冲液,在刀片式匀浆机中匀浆,使待测药物释放、溶解,分取上清液测定、第三部分体内样品得前处理去除蛋白与液—液萃取法在测定体内药物及其代谢物时,除少数情况将体液作简单处理后直接测定外,一般在测定之前要对样品进行适当得预处理,为药物得测定创造良好条件。

样品得预处理就是体内药物分析中极为重要得环节,也就是分析中最困难,最繁复得工作。

由于药物自身得理化特性与存在形式以及生物介质得差异,对于体内样品得预处理很难规定统一方法与固定得程序,而必须结合后续得测定方法对分析样品得要求,采取恰当得预处理步骤。

一、体内样品预处理得目得1、使待测药物游离药物进入体内后,即与血浆蛋白结合,同时部分经生物转化生成代谢物及缀合物。

通过预处理,使待测药物或代谢物从结合物或缀合物中释放出来,以便测定药物或代谢物得总浓度、２、满足测定方法得要求体内样品介质组成复杂、干扰多,而待测药物组分浓度低、因此,需将样品进行适当处理,使组分得到净化与富集,以满足测定方法对分析样品得要求。

３、为了防止分析仪器得污染、劣化,提高测定灵敏度与选择性等。

如采用HPLC法测定,为防止蛋白质在色谱柱上得沉积、堵塞,需要除去血浆蛋白质。

预处理不仅可以延长色谱柱得寿命,也可以改善方法得选择性(排除生物介质得干扰)与组分得可测性或组分得色谱行为、二、常用体内样品预处理方法常用体内样品得预处理方法一般有蛋白沉淀法、液—-液萃取法、液—-固萃取法、特殊情况下需进行缀合物水解、化学衍生化等。

(一)蛋白沉淀法在测定血样时,首先应去除蛋白质。

去除蛋白质可使结合型得药物释放出来,以便测定药物得总浓度、去除蛋白法有以下几种方法。

1、溶剂沉淀法加入与水相混溶得有机溶剂(亲水性有机溶剂),蛋白质分子间得静电引力增加而聚集、常用得水溶性有机溶剂有乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等。

含药物得血浆或血清与水溶性有机溶剂得体积比为1:(2~3)时,可以将９０%以上得蛋白质除去、上清液偏碱性,pH为8。

5～9。

5。

操作时,将水溶性有机溶剂与血浆或血清混合后离心分离,取上清液作为供试溶液、通常用于分离血浆或血清得离心力(约100０´g)不能将蛋白质沉淀完全,而采用高速离心(离心力约１5000´ｇ)约5分钟便可将析出得蛋白质沉淀完全、2、中性盐析法加入中性盐,溶液得离子强度发生变化,部分蛋白质得电性被中与,蛋白质因分子间电排斥作用减弱而凝聚。