糖醛酸测定方法

糖醛酸测定方法
一•间羟基联苯比色法
1•原理：多聚己糖醛酸与含四硼酸钠的硫酸溶液在高温作用下水解，水解产物进一步与间羟
基联苯反应，生成粉红色衍生物，产生紫外吸收，且在一定浓度范围内，该衍生物吸收值与糖醛酸含量呈线性关系，可通过比色法对糖醛酸含量进行计算。

2. 试剂配制：
间羟基联苯溶液：称取0.15g间羟基联苯溶于5 mg/mL氢氧化钠溶液中，定容至100mL，其质量浓度为1.5mg/mL.
四硼酸钠/硫酸溶液：0.478g四硼酸钠溶于100mL浓硫酸中，备用葡萄糖溶液：称取葡萄糖25.00mg，加水溶解并定容至25mL混匀，成1mg/mL的标准溶液。

（排除中性糖对测定结果的影响）
半乳糖醛酸标准溶液：称取干燥至恒重的半乳糖醛酸25.00 mg，加水溶解并定容至25mL，混匀，成1mg/mL的标准溶液。

3. 波长扫描：取半乳糖醛酸标准溶液0.50mL，置10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀（质量浓度为0.05 mg/mL）。

量取溶液1.00 mL置于20 mL具塞试管，置冰水浴中，加入四硼酸钠/硫酸溶液6 mL，待全部加完后，用旋涡混合器混匀，于沸水浴中加热5 min，冰水浴中冷却后用微量加样枪加入1.5 mg/mL间羟基联苯溶液100此，混匀后振摇5 min，超声除去气泡。

以1 mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，用UV-2450型紫外可见分光光度计在200 nm~ 800 nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长。

4. 标准曲线的制备：取1mg/mL半乳糖醛酸标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL置于10 mL容量瓶中，加水定容，再分别取上述各配制溶液1.0mL至于20mL具塞试管，置冰水浴中，加入四硼酸钠/硫酸溶液6 mL，待全部加完后，用旋涡混合器混匀，于沸水浴中加热5 min，冰水浴中冷却后用微量加样枪加入1.5 mg/mL间羟基联苯溶液100 L混匀后振摇5 min，超声除去气泡。

以1 mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，在最大吸收波长处测定吸光度。

5. 样品测定：取样品5 mg置100 mL容量瓶，加水溶解定容至刻度。

取溶液1.00 mL 按标准曲线项方法操作。

6. 中性糖影响：在一定浓度半乳糖醛酸标准溶液中，添加不同质量的中性糖（以葡萄糖为例），测得加入不同质量浓度的中性糖对半乳糖醛酸溶液吸光度的影响。

高效液相色谱法A
1. 标准溶液的制备:
精密称取半乳糖醛酸对照品205. 4 mg，置50mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀,即得（每1 mL中含半乳糖醛酸4. 108 mg）。

精密吸取上述对照品溶液
1.0、
2.0、
3.0、
4.0、
5.0、
6.0、
7.0、
8.0、
9.0mL置于25 mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀,制得0.116432、0.132864、0.149296、0.165728 0.18216、0.198592、1.115024 1.131456、1.147888 mg/mL 的系列标准溶液。

2标准曲线的绘制：
取配制好的半乳糖醛酸系列标准溶液，分别进样20让,按下面色谱条件测定半乳糖醛酸峰面积，以半乳糖醛酸峰面积为纵坐标，对照品浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。

求得回归方程。

3. 色谱条件
色谱柱:Sugar-PakI （300 mm >6. 5 mm）,流动相:0. 0001 mol/L EDTA 水溶液, 流速：0. 6 mL /min,示差检测器，柱温：90 C ,示差检测池温度：40 C ,进样量：20此。

理论板数：以半乳糖醛酸峰计算，不得低于3000。

高效液相色谱法B
色谱条件色谱柱：ZORBAX SAX 4.6>250mm 5-Micro n Agile nt ;柱
温：40°C ；流动相：0.7mol/l乙酸；流速：1.0ml/min ;测定波长：示差检测；示差检测器温度：40 C ；进样量：20丄。

标准曲线的绘制：称取古洛糖醛酸标准品，用重蒸水溶解，配制成浓度为1.07、2.14、3.21、5.35、10.7mg/mL的标准溶液。

分别进样10丄进行HPLC测定，以峰面积为纵坐标，相应标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线进行线性回归。

样品处理与检测：准确称取300mg （精确至±）.0001）海藻酸钠或者海藻，加入72%硫酸溶液3.5mL，于研钵中研磨2h，用100mL蒸馏水将其转移至250mL三角瓶，100C沸水浴加热2.5h，于自来水中冷却至室温，加入过量BaCO3粉末，充分反应至溶液pH为7左右，3000r/min离心，沉淀用150mL蒸馏水洗涤3次，将上清液和洗涤液合并在一起，45°C真空旋转浓缩后，定容至10mL,进样10丄进行
HPLC测定。

依据样品测定的峰面积和出峰时间，在相应的标准曲线查出所测组分的量，结合所取样品的质量和定容体积，计算出各组分的含量。

三•咔唑一硫酸比色法（修改后）
1. 原理：半乳糖醛酸在硫酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，其呈色强度与半乳糖醛酸含量成正比，可比色定量。

2. 对照品溶液的配制：精密称取干燥至恒重的半乳糖醛酸19. 8 mg,用适量的蒸馏水溶解，并定容于100 ml容量瓶中，配成198 4 /ml的对照品溶液。

使用时稀释至99冯/ml o
四硼酸钠-硫酸溶液的配制：精密称取0.956 g四硼酸钠溶解于200 ml浓硫酸
中，超声溶解，备用。

咔唑溶液的配制：精密称取咔唑100 mg,溶解于100 ml无水乙醇中，配制成0.1% 的咔唑溶液备用。

4. 半乳糖醛酸标准曲线制备：分别精密吸取对照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml溶液置于10 ml具塞试管中，各管加水至0.5 ml，分别在冰水浴中加入四硼酸钠—硫酸溶液3ml，用漩涡混合器混匀，于沸水浴中加热5 min,取出后立即冷却至室温，
加0.1%咔唑溶液0.1 ml，摇匀，煮沸5min，冷却至室温后在530nm处测定其吸光度。

以浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标进行线性回归。

方法学考察:
⑤精密度试验取同一对照品溶液，重复测定5次。

⑥稳定性试验取同一供试品溶液，每隔30min测定1次，共测定2h。

⑦重现性试验取同一批号样品多糖5份，按测定法操作。

⑧加样回收率试验精密称取已知含量多糖5份,分别精密加入葡萄糖醛酸对照
品适量，测定吸收度，计算回收率。

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