第三章 细胞破碎

不宜采用高压匀浆法：
易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀 浆阀）
常见高压细胞破碎仪
实验室级高压均质机
生产型高压均质机
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多 WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 最大操作压力为24MPa 最大处理量为为100dm3/h Bran and luebbe 公司SHL40型 最大操作压力为20-63MPa 最大处理量为为2.6-34 m3/h
气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥 原理： 使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当 采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞 内物质就容易被抽提出来。
4.干燥法
A、空气干燥主要适用酵母菌，一般在25-30℃的气流 中吹干； B、真空干燥 多用于细菌。 C、冷冻干燥 适用于制备不稳定的生化物质 干燥法条件变化剧烈，易引起蛋白质或其他组织变性。
• 4）特点： • 适用对象较广 • 工业化、实验室中应用 • 细胞完全破碎 • 需冷却
ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
JJ-2组织捣碎匀浆机
高压匀浆法和珠磨法比较
高压匀浆法 操作参数 少（n、p、t、x)易确定， 适于大规模操作 需配备换热器进行级间冷却 珠磨法 多（t、v）细胞浓度、 料液性质、搅速构型， 凭经验估计 连续操作兼具破碎和冷 却双重功能
3.2.1 高压匀浆法
1) 工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀， 由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。
细胞破碎分率关系式
破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率 符合如下公式：
式中 R为pro释放量，Rm为pro最大释放量. K － 与温度有关的速度常数； N － 悬浮液通过匀浆器的次数； P － 操作压力，MPa； ɑ－ 与微生物种类有关的常数。
• 一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如搅拌转速、细 胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃小珠的装量和珠体的直 径，以及温度等。
• 3）影响因素
转速：圆盘外缘速度 <20m/s, 一般在5-15m/s。 珠粒添量和大小
添量：添量体积一般占总体积的80-90%；
粒径：0.2mm(实验室), <0.4mm(工业)；最终由实验确定。 温度：温度在5-40C范围内对破碎影响较小。但研磨产热， 功率 ，温度 。如产物热不稳定，必须控温。 细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降 低而下降，但单位细胞重量的能耗 。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下
发酵液预处理
• 发酵液预处理方法？ • 凝聚和絮凝的作用机理
第三章 细胞破碎
Chapter 3 Cell Disruption
• 胞外产品：
• 胞内产品：
3.1 细胞壁的组成和结构
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和 细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎， 因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。


电声超声波发生器
3.2.4 酶溶法（Enzymatic Lysis）
1) 定义—利用酶促反应分解细胞壁上的键而达到细胞破碎 的过程
2) 原理
外源性酶解—溶菌酶、糖苷酶（β-1,4、β–1,6）、
葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、α-淀粉酶、
纤维素酶、脂酶等 内源性酶解（自溶）——温度、pH、时间、缓冲液
3.1.1 细菌类
– 组成—肽聚糖（多糖、氨基酸）、脂类 – 结构—多层三维网状结构
– 革兰氏阴性和阳性的差别（厚度、紧密度、是否有外
膜）
– 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的 致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和交联程 度。
3.1.2 酵母菌
组成—甘露聚醇、葡聚糖、蛋白质、脂类等 结构—三层三维网状结构 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧 密程度和它的厚度；
机械破碎法与非机械法比较
选择破碎方法的依据：
细胞处理量； 细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)； 目标产物对破碎条件的敏感性； 破碎程度； 目标产物的选择性释放

选择性释放目标产物
• 破碎的目的是要得到一种或几种目标产物，因此选择性释 放目标产物，并且尽量降低细胞的破碎程度，对下游的分 离纯化操作的顺利实施是非常重要的。 • 知道目标产物的性质和在细胞同存在的位臵，对选择适当 的破碎方法和操作条件很重要。
冷却
操作次数
菌种
2-4次循环才达到高的R
除丝状（团状）真菌、G有 包含体的基因工程菌
一次可达到高的R
各种微生物
3.2.3 超声破碎法
1、工作原理： 利用超频率声波（15-25kHz）在液体介质中产生的
空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎。
2、特点：

适合于多种细胞的破碎 影响因素多，声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌 种类型等因素有关。 易失活物质不宜用（超声波可促使一些化学自由基使 物质失活） 有效能量的利用率低，产热大，需控温 不易放大，仅应用于实验室规模
五. 高压匀浆—化学法结合
先高压匀浆，再加10%丁酯，37℃搅拌3h，高速离心(3万rpm)，释 放率：R=60%
六. 珠磨
直径0.4mm玻璃珠。释放率：R=95%
3.3 细胞破碎的评价
破碎率定义
N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通 过直接计数和间接计数法得到。
破碎率的测定
1)直接测定法
加B.A(12%,37℃搅拌3h） 菌悬液 释放率—70%；比活—2.69 u/mg 冻融(冻结14h 融化)
三. 化学—超声波振荡法结合
先丁酯处理，再超声波（90秒），释放率72% 小型设备，不能工业大规模生产。
四. 高压匀浆法
20%(W/V)菌悬液，ΔP=50MPa，N=3。释放率R=38.4%， 原因:细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。
青霉素酰化酶细胞破碎的研究 一. 化学法
20%(W/V)大肠杆菌悬浮液 + B.A 37℃搅拌 高速离心 测上清液酶活。
1.处理时间
R% R 55% 比 活 2.03U/mg
2. 丁酯用量
条件：37 ℃，搅拌3小时
2.5h
适宜的B.A加量为12% ， 释放率R=55% 12%
12%
二. 化学法—冻融法结合
2）影响破碎的主要因素
压力： p, R ;相反, R ；温度 ２－３℃/10MPa;
工业中，常采用的压力55－70Mpa。
温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。 通过均浆器阀的次数: N，R 细胞种类：影响k值。
3）适用范围
酵母、大多数细菌细胞及植物细胞大规模处理 料液细胞浓度可达到20%左右。
2. 渗透压法（Osmotic pressure）
Cell
高渗透压介质
特点：
低渗透压缓冲液 或纯水
1）仅适用于细胞壁较脆弱的细胞 2）细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑 制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
3. 反复冻结-融化法
Cell
低温冷冻
（约-15℃）
室温缓慢融化
原理：1）冷冻使细胞膜的疏水键结构破裂， 2）胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细 胞膨胀而破裂。 特点：1）适用于细胞壁较脆弱的菌体， 2）破碎率较低，需反复多次 3）在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
不同细胞可采用的化学渗透处理方式 细胞类型 革兰氏阴性 细菌 革兰氏阳性 细菌 酵母菌 植物细胞 巨噬细胞 * 变性剂 * 清洁剂 * * * * * 有机溶剂 * * * * * 酶 * * * * * * * * 抗生素 * 生物试剂 螯合剂 *
（1）增溶溶解作用
表面活性剂分子中兼有亲脂性和亲水性基团，可降低水的表面 张力，具有乳化、分散、增溶作用。SDS、Triton X-100、胆酸盐 和磷脂。
浓度、激活剂等
• 抑制细胞壁合成
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学 组成选择适当的酶，并确定相应的次序。 酶溶法的优点： 条件温和； 选择性释放产物； 胞内核酸泄出量少；细胞外形完整。 缺点： 溶酶价格高； 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶）。
3.2.5 化学法
该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。
化学法优点： 选择性释放产物； 细胞外形完整，碎片少，核酸释出量少，易于进一 步提取。
缺点： 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 容易引起活性物质失活破坏； 引起新的污染； 通用性差
3.2.5.其他方法（物理法） 1. X-press法
浓缩的菌体悬浮液 冷却至-25℃ 500MPa以上的高压冲击
采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫 色，而受损害的细胞呈亮红色。
2)目的产物测定法
将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量 或活性，并与100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。
3)导电率测定法
选择性释放目标产物的原则
仅破坏或破碎存在目标产物的位臵周围 •当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方 法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透压冲击法和冻结－ 融化法等。 •当目标产物存在于细胞质内时，则需用机械破碎法．
选择性溶解目标产物．
•当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶 液pH值，离子强度，使目标产物容易溶解释放。 •另外机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在 相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。
3.2.2 珠磨法（Bead mill）