RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法

RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法
RNA干扰(RNAinteferenee ，缩写为RNA)是指一种分子生物学上由双链
RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。

当细胞中导入与内源性mRN编码区同源的双链RNA寸，该mRN发生降解而导致基因表达沉默⑴。

与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi 具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)踽。

在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。

RNAi现象在生物中普遍存在。

1. RNAi的作用机制
目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。

1.1起始阶段
外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA)，在细胞内特异性与RNA酶川(RNAase川核酸内切酶)Dicer结合，dsRNA被切割成21~23nt 长度的带有3 '端单链尾巴及磷酸化的5'端的短链dsRNA，即小干扰RNA(siRNA)。

1.2效应阶段
双链siRNA可以与含Argonauto (Ago)蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复
合体(RNA-induced silencing complex ，RISC)并被激活。

在ATP供能情况下，激活的RISC 将siRNA的双链分开，RISC中核心组分核酸内切酶Ago负责催化siRNA其中一条链去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。

反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在
距离siRNA 3'端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默⑴。

1.3倍增阶段
siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA，可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。

并作用于靶mRNA。

如此反复倍增，
从而使RNAi的作用进一步放大。

因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果⑷。

2. RNAi的设计及合成
2.1siRNA的设计
设计高效率的siRNA首先要通过NCBI、DDBJ、BMBL这3个基因序列数据库，检索相关的基因序列，获得靶向mRNA或cDNA序列，再就是合理设计siRNA。

常规siRNA的
设计原则是以成熟的mRNA为标准，若以DNA序列为参照，则最好选择cDNA转录区+50 到+100
以后的下游序列，两端的非翻译区不作为siRNA设计依据。

siRNA二聚体的正义链
和反义链各含21nt为佳，3'端为突出末端。

3'凸端为尿苷（U），5'凹端为腺苷（A）的mRNA序列应作为首选。

进行Gen-Bank BLAST查询，确保所选siRNA编码不与其它基因同源⑸。

不是mRNA的所有亚单位都能形成有效的siRNA，大约有60%~70%可以发挥沉默效应，
这是由于5 ‘和3' -UTR有丰富的调控蛋白结合区域，产生UTR结合蛋白或翻译起始复合
物均可能影响RISC结合mRNA，从而影响siRNA的效果，所以沉默效应率差异较大，针对一个靶基因需要设计3~4条siRNA，以保证能够筛选出一条有效序列⑹。

2.2iRNA的合成方法
制备siRNA的方法主要有化学合成法、体外转录法、酶消化法、体内转录法等。

当已经找到最有效的siRNA时，适合以核苷酸单体为原料，通过化学方法合成两条互补的长约21~23 nt的RNA单链，然后退火形成双链复合体，这种方法所获得的产物纯度、干扰效率高，合成简单，但是制备周期长，作用时间短，而且价格昂贵限制了其应用和推广⑺。

体外转录法［8］是以两段互补的DNA为模板，在针对靶序列的正义链和反义链上游接上T7启动子，使用T7 RNA聚合酶，各自在体外转录获得两条单链RNA，将两条单链退火后
形成双链RNA，然后用RNA酶消化，所得产物经纯化后就是所需的双链RNA，此方法适
用于筛选有效的siRNA，但不适用于对特定siRNA进行长期研究。

酶消化法［9］是先在体外化学合成200~1000完整的目的基因长片段dsRNA，用细胞内
形成的siRNA关键酶-Dicer酶或者RNase川进行消化，即可得到各种不同的针对同一目的基因的不同位点的siRNA混合物，然后将混合物转染至细胞内，能得到较高的抑制效率。

该方法抑制率高，且省时省力，但此法产生的混合物可能导致非特异性抑制，另外在体外转
录长链RNA有困难，Dicer酶费用较高，此方法不适用于长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。

体内转录［10］是将siRNA的质粒、病毒表达载体或带有siRNA表达盒的PCR产物转入细胞，由细胞表达产生RNA干扰作用。

siRNA表达载体常用能在哺乳动物细胞中表达shRNA 的含有RNA聚
合酶川（pol川）启动子的载体，通过转染含有RNA聚合酶II/III的启动子U6
或H1 ,及其下游一小段特殊结构的质粒或病毒载体到宿主细胞内，转录出shRNA，该RNA 在细胞内被Dicer酶剪切成siRNA而发挥作用。

该方法的优点是细胞特异性强，适用于基因功能的长时间研究。

siRNA表达框(siRNA expreion caettes, SECs)是一种由PCR制备的
siRNA表达模板，可直接转入细胞进行表达而无需事先克隆到载体中。

利用引物延伸法进行PCR，产生包含1个RNA聚合酶III启动子U6或H1、一小段编码shRNA的DNA模板和1个RNA 聚合酶III终止位点的表达框架，然后直接转染到细胞内。

该方法为筛选有效的siRNA片段和合适的启动子提供了较为便捷的工具。

其主要缺点是PCR产物转染细胞的难
度大，如有转染试剂能提高SECs的转染效率，这一方法将得到更为广泛的应用。

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