查询质粒方法汇总
质粒两步层析法验证方案
质粒两步层析法验证方案
质粒两步层析法是一种常用的质粒拷贝数验证方法，主要分为两步：第一步是利用大量培养基筛选获得高拷贝数的质粒，并进一步纯化；第二步则是通过层析柱进行分离和检测。
具体的步骤如下：
第一步：
1. 培养质粒菌株：首先将含有质粒的菌株在含适宜抗生素的培养基中进行大规模培养。
2. 破碎细胞：将培养得到的大量细胞离心沉淀，去除上清，然后使用适当的方法（如超声波破碎、搅拌破碎等）破碎细胞，使得质粒释放到溶液中。
3. 离心：将破碎细胞溶液离心，将上清液中的质粒与细胞碎片等离心沉淀分离。
4. 纯化质粒：用各种方法（如乙酸纯化法、硅胶柱纯化法等）对质粒进行纯化，去除杂质。
第二步：
1. 选择合适的层析柱：根据质粒的特性选择相应的层析柱，如阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱等。
2. 样品装柱：将经过纯化的质粒样品溶液均匀地添加到层析柱上。
3. 洗脱和收集：使用适宜的层析缓冲液进行洗脱，不同的缓冲液可以选择不同的洗脱梯度。
同时，根据需要将洗脱液进行分装和收集。
4. 分析和测定：收集的洗脱液可以进行各种分析和测定，如质
谱分析、电泳检测等，以确定质粒的拷贝数。
需要注意的是，在进行质粒两步层析法之前，需要事先准备好合适的培养基、抗生素、层析柱和纯化试剂等。
同时，实验过程中需要严格控制实验条件，以确保质粒的有效纯化和拷贝数的准确检测。
质粒DNA纯度检测方法及注意事项
质粒DNA纯度检测方法及注意事项确定提取的质粒DNA纯度可以通过以下几种方法：
1.紫外吸收检测：由于核酸和蛋白质的吸收光谱特性不同，可以利用紫外分
光光度计测量DNA样品在260nm和280nm波长下的吸光度值。
纯净的DNA其A260/A280的比值应该接近1.8。
若比值高于1.8，则可能意味着DNA样品中的RNA未完全去除。
比值低于1.8可能说明样品中含有酚类或蛋白质。
同时，如果在270nm存在高吸收，这可能表明有酚的干扰。
2.琼脂糖凝胶电泳：可以使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入EB（溴化
乙锭）染料。
电泳结束后，在紫外灯下观察DNA条带的亮度和清晰度。
纯净的质粒DNA应该显示出清晰、单一的条带。
如果观察到多条带或模糊的条带，这可能意味着样品中存在RNA、蛋白质或其他杂质。
3.荧光分光光度法：对于浓度较低的DNA样品，可以使用荧光分光光度法来
测量DNA的浓度和纯度。
这种方法通常比紫外吸收法更灵敏，可以检测更低浓度的DNA。
需要注意的是，以上方法只能提供关于DNA纯度的间接信息。
为了确保DNA的纯度，最佳的做法是结合多种方法进行分析，并在可能的情况下，通过进一步的实验（如克隆、测序等）验证DNA的质量。
快速质粒鉴定方法
快速质粒鉴定方法
来源：生物谷 2007-4-17 20:31:00 访问量：5385
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protocol：
0.从平板上挑单菌落，越多越好（20－30），放于1.5ml离心管中，加1.2ml 左右的液体LB培养基，摇3－5h. 200rpm
1.用1.5ml离心管收集一定量(1ml,留0.2ml)含有重组质粒的菌液，10000rpm, 30sec,弃上清，留管底沉淀（应留有一定量(0.2)的菌液放于4度中，以备摇菌）
2.加入30－50ul TE ,重悬菌液，混合均匀
3.加入25ul 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1),混合均匀
4.加入5ul 上样缓冲液（6X or10X),混合均匀,12000rpm, 10min,
取蓝色上清液（约20－30ul)直接进行电泳，结果会显示条带
a:最上边，几万bp的条带是基因组DNA
b:其次，下边是你所要的重组质粒，约几千bp
c:再下边可能会出现RNA的三条带，总共就这几条带
通过经验，来判断一下看看哪个应该是连上了，哪个没连上，最后把连上的那个挑出来，然后用放在4度中的对应的那个菌，摇菌，第二天再提质粒
就可以了。
简单，方便，省时，省钱....。
质粒大全及质粒图谱
一.九种表达载体Pllp-OmpA, pllp-STII, pMBP-P, pMBP-C,pET-GST, pET-Trx, pET-His, pET-CKS, pET-DsbA二.克隆载体pTZ19R DNApUC57 DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescript II KS (+)L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression System 33bProtein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression SystemsProtein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Expression Systems plus Competent CellsProtein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET GST Fusion Systems 41 and 42 Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET NusA Fusion Systems 43.1 and 44Protein Expression ? Prokaryotic Expression ? pET Vector DNAProtein Purification ? Purification Systems ? Strep?Tactin Resins and Purification Kits四.PGEX系列表达载体T EcoR?pGEX-1 I/BAPpGEX-2TpGEX-2TKpGEX-3XpGEX-4T-1pGEX-4T-2pGEX-4T-3pGEX-5X-1pGEX-5X-2pGEX-5X-3pGEX-6P-1pGEX-6P-2pGEX-6P-3五.PTYB systemPTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-)pCDNA3.1(+)pPICZ alpha ApGAPZαAPYES2.0pBI121pEGFP-N1pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
如何查找质粒图谱
如何查找质粒图谱
[转贴]如何查找质粒图谱。
最好的图谱就是NCBI和公司里提供的了，
第一步去NCBI查找，一般常用质粒都有了。
然后以.db格式下载，再用Invitrogen的VectorNTI打开，就能得到一张很好的质粒图。
如果找不到，就去google，(baidu上比较不准)，最好加个pdf，找到公司的质粒介绍，那种图也不错。
如果还是找不到，就在google，baidu上查质粒的序列，把序列输入Invitrogen的VectorNTI，能够得到类似酶切的图谱，凑合着用吧，如果有序列信息，再自己添加也一样。
我就是这么查的，相信大家用的多数都是常用序列，查起来应该不难。
筛选重组质粒的方法
筛选重组质粒的方法
筛选重组质粒是分子生物学实验中常用的一种方法，其目的是从众多的转化菌落中挑选出含有目标质粒的菌落，进而得到目标质粒。
以下是几种常见的筛选重组质粒的方法：
1. 抗性筛选法：将含有目标质粒的转化菌株接种在含有特定抗生素的培养基上，只有含有目标质粒的菌株才能生长并形成菌落，从而实现筛选。
2. 荧光筛选法：将目标质粒与荧光蛋白基因连接，然后将转化菌株在荧光显微镜下观察，只有含有目标质粒的菌株才会发出荧光信号。
3. 酶标记筛选法：将目标质粒与酶标记基因连接，在含有相应底物的培养基上进行筛选，只有含有目标质粒的菌株才能发生底物的显色反应。
4. PCR筛选法：设计针对目标质粒的特异性引物，对转化菌落中的DNA进行PCR扩增，仅含有目标质粒的菌落才能扩增出目标片段。
以上是几种常见的筛选重组质粒的方法，实验者可以根据实验需要选择合适的方法，提高实验效率。
- 1 -。
(整理)质粒DNA的提取与检测
质粒DNA 的提取与检测1 概述细菌质粒是一些双链、闭环的DNA分子，其大小范围从1kb至2000kb不等。
已经存在形形色色的细菌类群中发现质粒，这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的遗传单位。
然而，它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。
通常，质粒含有编码某些酶的基因，这些酶事实上在一定的环境下可能对细菌宿主有利。
由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等。
质粒DNA的复制由负责复制细菌染色体的多种酶来完成，但是不同的质粒在宿主体内所采用的酶迥然不同，而且在宿主中复制的程度也相差悬殊。
一些质粒的拷贝数可高达700个／细胞，而另一些则只能维持在每套宿主细胞染色体仅对应l个质粒分子的最低水平上。
控制质粒拷贝数的基因处于包括DNA 复制起点在内的一个质粒DNA 区域内。
通常情况下，一个质粒只含有一个复制起始区（复制子）。
目前使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒的复制子。
在正常生长条件下，每个细菌细胞中可维持至少15～20个拷贝（带有该复制子的质粒）。
一般认为，这种多拷贝的质粒是以松弛方式进行复制的。
pMB1 复制子的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半寿期较长的酶。
因此，即使蛋白质合成并非正在进行，复制依然能够进行。
这样，当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素存在时，带有pMB1复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可以积聚两三千个拷贝。
单向复制从DNA 复制起点开始，由一个RNA 引物所引导，该引物的启动子位于复制起点上游大约550bp处。
新生的RNA与DNA模板形成稳定的杂交体，作为RNA 酶H 的底物，由RNA 酶H 切割从而产生引导DNA 合成的引物。
而RNAⅡ的成熟则由另一个不翻译的RNA小分子（RNA I）所控制。
RNA I编码RNAⅡ的同一区段的DNA 的互补链转录而来，它可与RNA Ⅱ结合，并阻止RNA Ⅱ折叠为三叶草结构，而三叶草结构对于形成稳定的DNA-RNA 杂交体又是必不可少的。
质粒后续各项检测指标
质粒后续各项检测指标（原创实用版）目录1.质粒的概念与作用2.质粒的检测指标3.质粒检测的常用方法4.质粒检测的重要性正文一、质粒的概念与作用质粒（Plasmid）是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核 DNA 之外并具有自我复制能力的双链环状 DNA 分子。
质粒在基因工程中起着至关重要的作用，它是基因工程的运载体，可以将外源基因导入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制。
二、质粒的检测指标在基因工程中，对质粒进行检测是非常重要的一个环节，其检测指标主要包括以下几个方面：1.质粒的大小：通常使用限制性内切酶消化质粒，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测其大小。
2.质粒的纯度：质粒的纯度是指质粒在总 DNA 中所占的比例。
常用的检测方法有琼脂糖凝胶电泳和 PCR 方法。
3.质粒的拷贝数：拷贝数是指在一定条件下，质粒在细胞中的复制次数。
拷贝数的检测方法有 PCR 方法、荧光定量 PCR 方法等。
4.质粒上的外源基因：外源基因的检测主要是通过 PCR 方法、荧光定量 PCR 方法、Western Blot 等方法进行。
三、质粒检测的常用方法1.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的质粒检测方法，可以检测质粒的大小、纯度等指标。
2.PCR 方法：PCR 方法可以检测质粒上的外源基因、拷贝数等指标。
3.荧光定量 PCR 方法：荧光定量 PCR 方法可以对质粒进行快速、准确的检测。
4.Western Blot：Western Blot 可以用于检测质粒上的外源基因是否表达成蛋白质。
四、质粒检测的重要性在基因工程中，对质粒进行检测是非常重要的，因为只有确保质粒的质量和纯度，才能保证外源基因能够准确地导入受体细胞，并在受体细胞中进行正常的复制和表达。
重组质粒的鉴定方法
重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。
在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。
筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。
本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。
一、抗生素平板筛选【实验原理】目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp 的抗性基因，因此在含有Amp 和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。
【操作步骤】1．制备含有Amp 和 Kan 的LB琼脂培养板2．将100μｌ转化菌液用无菌涂布器均匀涂布于含有Amp 和Kan培养板上，37℃培养12-16h 。
3．在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒。
并将其接种于含Kan的LB液体培养基2ml中培养8-16h。
4．小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。
二、α互补筛选【实验原理】适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如 pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ 的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点。
当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。
由α互补而产生的 Lac+细菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落。
当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。
因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。
通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。
【试剂】1．X-gal（20mg／m l）：将20mg X-gal溶于l ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。
质粒图谱查询方法
3.google scholar: / 有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息。这时，可以在google scholar中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源;或者籍此向作者咨询或索取。 4.尝试从各大生物公司，例如invitrogen网站查询. 5. 这个网站收录了大量图谱： http://www.embl-hamburg.de/~geerlof/webPP/vectordb/bact_vectors/table.html
By
0039--pET-24a--Novagene--原核表达--yanBaggio 0040--pGBKT7 和pGADT7--CLOTE--酵母表达--小迷糊 0041--PTXB1--BIOLABS--原核表达--小迷糊 0042--pET-43.1 Ek/LIC--Novagene--原核表达--mcli 0043--PIRES--BD BIOSCIENCES--穿梭载体---joeys008 0044--pBAD/Thio-TOPO--invitrogen--原核表达--mcli 0045--pESC-HIS--Stratagene--酵母表达--zhangqiongyu82 0046--pcDNA3.1/V5-His-TOPO--invitrogen--真核表达--mcli 0047--pMSCVneo--Clontech--真核表达--intron 0048--pCDNA6 /V5 HisB--invitrogen--真核表达--linct97 0049--pcDNA3.1(+)--invitrogen--真核表达--kinase 0050--pSecTag2--invitrogen--真核表达--sssusu 0051--pIRESneo--Clontech--真核表达--sssusu 0052--pBudCE4.1--invitrogen--真核表达--barbie 0053--pGEX-4T-3--amershambio--原核表达--linct97 0054--PESC-TRP--startgene--真核表达--zhangqiongyu82 0055--pPICZ--invitrogen--毕赤酵母表达--yshu3507 0056--pTrc99a--novogen--原核表达--Gmail 0057--pGEX-6p-1--amershambio--原核表达--erik 0058--pSFV1--invitrogen--真核表达--syfnet 0059--pSCA1--赠送--真核表达--syfnet 0060--pUC18--/--克隆--syfnet 0061--pshuttleCMV--KRACKELER--穿梭质粒--renke3333 0062--pdc315--microbix--shuttle--renke3333 0063--pBluescript SK(+)--tianwei--原核表达--fenqinzhuhe 0064--pPIC3.5K--Invitrogen--真核表达--mcli 0065--pFB-hrGFP--Stratagene--真核表达--zhangqiongyu82 0066--pSG5--Stratagene--真核表达--zhangqiongyu82 0067--pCMV-Tag4B--Stratagene--真核表达--小迷糊 0068--pET11a--invitrogen--原核表达--pinghw 0069--pET30a--invitrogen--原核表达--seasider 0070--pCI-NEO--PREMOGA--真核表达--syfnet 0071--phRL-null--PREMOGA--真核表达--kenmed 0072--pBC1--invitrogen--真核表达--竹影烟雨 0073--pGEMEX-1--Promega--体外转录--palmyard 0074--pGEM-T Easy--Promega--克隆--laohu200381 0075--pGEX-5x-1--Pharmacia--原核表达--laohu200381 0076--pshuttle--qbiogene--穿梭质粒--renke3333 0077--pet9c--promega--原核表达--renke3333 0078--trans-vector--qbiogene--穿梭质粒--renke3333 0079--PQBI PGK--QBIOGENE--真核表达--renke3333 0080--PQBI T7 GFP--QBIOGENE--真核表达--renke3333 0081--pcDNA5/FRT/CAT—INVITROGEN--真核表达--renke3333 0082--pBABE Hygro—Geron--真核表达--Jeffrey88 0083--pBABE puro--Geron--Jeffrey88 0084--pMSCV puro—Clontech—RNAi--tuterhu 0085--质粒名--PEGFPN3—Clontech--真核 GFP--renke3333 0086--质粒名称—PSHTULLE—Clontech--穿梭---renke3333 0087--pkk223-3--哈佛大学Brosius等构建--原核表达--kingtsh 0088--pcdna3-c-myc—invitroge--真核表达--giyon 0089—pSG-cmv--新基因--stevenvin 0090--PGEX-3x--BD Co--融合型蛋白原核表达载体--kingtsh 0091--PEGFPc2—Clontech--真核 GFP 0092--PEGFP－N2—Clontech--真核 GFP 0093—PMECA--不详--克隆载体 0094--PGEX 4T－2--不详--克隆载体 0095--siSTRIKE? U6—PROMEGA--RNAi载体 0096--pSilencer? neo—Ambion--RNAi载体 0097--pSilencer? hygro—Ambion--RNAi载体 0098--pSilencer? puro—Ambion--RNAi载体
实验新人必读（七）：一文学会读懂和查找质粒图谱
实验新⼈必读（七）：⼀⽂学会读懂和查找质粒图谱作者：解螺旋.⼦⾮鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医⽣科研助⼿导语质粒图谱即为质粒DNA序列的物理图谱，包含了质粒⼤⼩、筛选标记、克隆位点、转录及翻译元件等信息。
尽管它为我们选择质粒、了解质粒特点及应⽤提供了重要依据，然⽽我们常常要为图谱中丰富信息所困扰。
那么，本⽂就为你拨云见⽇，让你快速掌握质粒图谱。
三步法看懂质粒图谱Step 1:先了解质粒的基本组成元素。
1）复制起始点Ori。
该位点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数，它是质粒中⼀段特定序列，富含AT和重复序列。
Tips：图谱上只有⼀个Ori，表⽰质粒是原核克隆表达质粒；有两个Ori，则表⽰该质粒是，穿梭质粒，即可在原核也可在真核中复制。
2）抗性筛选基因。
图谱中Kan/tet就是抗⽣素抗性基因，⽅便后续通过抗⽣素筛选阳性克隆。
特点就是单词最后会以⼤写R或上标r结束。
Tips：⼀般克隆载体只有⼀种抗性筛选标记，部分表达载体及穿梭质粒具有两种抗性筛选标记。
3）多克隆位点（MCS），即⼀系列限制性内切酶酶切位点，是外源DNA插⼊位点，⼀般可通过酶切/连接⽅式将外源DNA插⼊质粒，外源DNA⼀般⼩于10kb，⽽⽚段越长，转化效率越低。
Tips: ⼀般位于转录启动和转录终⽌信号之间；所包含的限制性内切酶位点数量和组成因载体不同会有所差异，且其中的酶切位点在质粒中为单⼀的酶切位点；同时在使⽤时需注意质粒载体与外源DNA酶切位点的兼容性问题4）荧光标记或蛋⽩标签序列。
蛋⽩纯化标签蛋⽩：His-Tag，GST-Tag等；蛋⽩检测标签蛋⽩：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Tag等；荧光蛋⽩表达标签：GFP，mCherry等。
Step 2:看质粒是否是表达载体，如果是，那就必定有这些原件：启动⼦－核糖体结合位点－克隆位点－转录终⽌信号。
1、启动⼦：促进DNA转录的DNA序列，可与RNApol特异性结合。
2、增强⼦/沉默⼦：前者是真核基因组中⼀种增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作⽤与增强⼦所在位置或⽅向⽆关。
怎样查找质粒
如何查找质粒图谱之我见——plasmid map, Vector Sequence方法汇总经常在坛子里看到一些人求助质粒图谱，很多时候我发现其实有些质粒图谱还是很容易找到了，刚开始帮忙查找了下，还公布了一些查找质粒图谱比较好的网站，后来看得多了，很多时候，这样的帖子直接跳过了。
今天又看到几个求质粒图谱的帖子，因此决定就查找质粒图谱的方法，写个总结帖子，希望对虫子们有些帮助。
这些方法，大部分是自己学习的过程中积累的，也许总结得还不够全面，望其他虫友指正。
方法一：安装软件Vector NT做分子实验，经常和不同的质粒打交道，了解各种质粒的图谱信息是必需的，invitrogen公司的这款软件绝对是分子生物学虫子们的福音，功能强大、界面美观，使用起来很人性化。
后面的很多方法都是基于在这款软件的使用之上，因此个人觉得要想对质粒图谱了解更直观，安装这款软件是非常必要的。
而且，一旦安装了这款软件，你就发现这款软件的软件包里面会包括invitrogen公司的所有质粒图谱信息和其他比较常见和经典的质粒图谱。
这里就不一一细说，各位虫子可以自己体验下。
（这款软件的下载和使用说明书站内很多）方法二：查找质粒图谱的网站：这个之前有人求助质粒图谱时，我在回应求助帖里面公布过几个我经常用的网址，估计不是专题，很多人没看到，现在在此重新总结下1.Vector Database地址：https:///g?a=vdb这个网站很页面很人性化，直入主题，也是我经常用到一个网站，比如同样这个帖子求pRS 类质粒图谱（注意，是一类质粒图谱，没关系，照样能找到），直接在搜索框输入pRS，可以看到，之类质粒一共有三十多个。
找到自己需要的质粒名称，点击进入，就可以看到质粒图谱了拿第一个质粒pRS413举例，如上图，质粒图谱是不是很难看，对，我也觉得很难看，没关系，看见view sequence了吗？点击进入，我们就得到该质粒图谱的序列了。
如何得到比较好看的质粒图谱呢，看到GeneBank了吗？对，熟悉vector的虫子们肯定知道该如何做了，对，点击进入，如下图，复制所有的代码部分，新建txt文件，粘贴上代码后，将文件扩展名由txt更改为gb格式，导入vector，你就可以在vector里面看到质粒图谱了。
(完整)质粒提取方法及步骤(精)
(完整)质粒提取方法及步骤(精)编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)质粒提取方法及步骤(精)）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)质粒提取方法及步骤(精)的全部内容。
质粒提取方法及步骤碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少追其原因，我想大概是因为分子克隆里面只讲实验操作步骤,而没有对原理进行详细的论述这是导致我的学生误入歧途的主要原因后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多老师也是这个状态这就不得不让人感到悲哀了我想这恐怕和我们的文化有点关系中国人崇尚读书，学而优则仕的观念深入人心经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的八股学生命科学是实验科学，它讲究动手如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考,不就成了一个工匠?一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己一个杰出的科学工作者,是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家每个曾经用碱法抽提过质粒的同学,希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0;溶液II ,0。
如何进行质粒查找
如何进行质粒查找质粒查找是一种常用的分子生物学实验方法，用于寻找在细菌中存在的特定质粒。
下面将详细介绍如何进行质粒查找。
一、准备实验材料和试剂1.质粒DNA：先选择所需研究的质粒，并将其纯化提取，得到质粒DNA。
常用的质粒提取方法有碱裂解法和商业化质粒提取试剂盒。
2.细菌菌种：选择大肠杆菌等常用宿主菌株。
可以购买经过质粒带有标记的宿主菌株，如滑动抗生素抗性菌株。
3.培养基和抗生素：用于细菌培养的培养基和所需的抗生素，如氨苄青霉素和氨苄青霉素等。
4.质粒鉴定试剂：包括限制性内切酶、琼脂糖、TAE缓冲液等。
二、制备实验条件和相关步骤1.选择适当培养基：根据质粒的性质和所需的抗生素选择适当的培养基。
可以是含有对应抗生素的选择性培养基。
2.转化质粒到宿主菌中：将提取的质粒DNA与宿主细菌共转化，使质粒进入到细菌细胞内。
可采用电穿孔法、热冲击法等转化方式。
3.接种与筛选：将转化后的宿主细胞在含有适当抗生素的选择性培养基上进行培养。
只有带有质粒的细菌能够存活并形成菌落。
因此，通过筛选出存活菌落的方式，就可以确定该菌落中存在质粒。
三、进行质粒鉴定1.分离质粒：从培养的植物中，通过质粒提取试剂盒等方法提取质粒DNA。
然后利用琼脂糖凝胶电泳分析，可以看到不同大小的DNA片段。
2.应用限制性内切酶：选择不同的限制性内切酶对质粒DNA进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳分析，观察DNA片段数量和大小的变化，以确定质粒的结构和大小。
四、结果分析与应用通过上述的实验步骤，可以确定细菌中存在的质粒，并对质粒进行鉴定和测序。
通过质粒的鉴定，可以进一步了解质粒在细菌中的功能和特征，从而为后续的研究提供基础。
质粒的查找可以广泛应用于分子生物学研究、基因工程和遗传工程领域，用于质粒载体构建和基因转移等。
总结起来，质粒查找是一种通过转化、培养和筛选的方法，常用于寻找特定质粒。
通过质粒鉴定和测序，可以深入了解质粒的结构和功能，为进一步的研究提供基础。
质粒图谱查询方法
0037--pQE9--Qiagen--原核表达--jpsgf
0038--pCANTAB5E--Phamcia--噬菌体抗库--yanBaggio
0039--pET-24a--Novagene--原核表达--yanBaggio
0006--pQEx--Qiagen--原核表达--wangjun2002274
0007--pIVEX2.3--Roche--体外转录翻译--wangjun2002274
0008--pIRES-EGFP--/--/--luoqingli2003
0009--pET-28a（+）--Novagen--原核表达--wangjun2002274
0014--pcDNA3--invitrogen--真核表达--kras
0015--pfastbac1--invitrogene--昆虫表达--cox2wj
0016--pEGFP-C3--clontech--真核表达--smilely
0017--pSecTag2--invitrogen--真核表达--kenmed
0018--PYX212--/--真核表达--Gmail
0019--pET20b--Novagen--原核表达--Gmail
0020--pEGFP-1--BD BIO--转录调控--wyh
0021--pEGFP/U6 --/--siRNA--songbinn
0022--pThioHisA--invitrogen--原核表达--xuezhishui
0081--pcDNA5/FRT/CAT—INVITROGEN--真核表达--renke3333
重组质粒快速检验方法
• 方法一：
转化子培养 挑菌于10ul水 加10ulNS裂解
13000rpm，2min
取上清10ul上样电泳
NS溶液： NaOH SDS 0.2mol/L 0.5%
方法二：
转化子培养 接种LB过夜培养 取100ul培养液， 13000rpm1min 加10ulNS 裂解
尽可能去 上清
13000rpm 5min
去上5~10ulTE 溶解
酶切，上样 电泳
便捷小技巧
• LB培养时可直接用10ml或1.5ml的EP管。 • 挑菌后，可将菌于另一平板划线培养，一 个平板可接种多个菌，作菌种保留。 • 将溴化乙锭染色后的凝胶用10mM镁离子溶 液脱色10~15min，可有效降低背景亮度， 提高分辨率。
加10ul水 混旋
加20ul氯 仿混旋
13000rpm 2min
取上清 10ul上样 电泳
• 方法三：
转化子培养 挑菌于5ulS1 按试剂盒比例依次 加入S2，S3
13000rpm3min
转移上清于 另一EP管
加入一倍体积异丙 醇或两倍体积乙醇
13000rpm 5min
尽可能去上 清
加入50ul70%乙醇， 静置5min 上样电泳
质粒查看方法
1.ori 应该看不出来吧，应该看启动子类型和抗生素标记等，另外真核还有加尾信号.
2.首先，你要知道一个载体的ori的名称，然后根据ori的性质来判断该载体的属性，比如，某种ori是大肠杆菌表达的，则该载体至少是原核载体，如果载体中还含有可以在阳性菌比如枯草中表达的ori，那么该载体就是穿梭载体了；其次，一般基因工程中使用的真核载体，个人以为肯定穿梭载体，因为载体的扩增要在原核中完成，而使用是在真核中的，所以，载体必须是具有原核和真核两套ori；最后，根据载体的抗性也可以粗略的判定一下类型，比如，如果载体有2种以上的抗性，则载体是穿梭载体的可能性大，因为要在不同的宿主中生存，抗性选择一般是不同的；另外，真核和原核的抗性也是不同的，比如Amp、Kan等可以抑制原核的生长，但是对真核细胞则没有作用.
3.。
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如何查找质粒图谱之我见——plasmid map, Vector Sequence方法汇总
经常在坛子里看到一些人求助质粒图谱，很多时候我发现其实有些质粒图谱还是很容易找到了，刚开始帮忙查找了下，还公布了一些查找质粒图谱比较好的网站，后来看得多了，很多时候，这样的帖子直接跳过了。
今天又看到几个求质粒图谱的帖子，因此决定就查找质粒图谱的方法，写个总结帖子，希望对虫子们有些帮助。
这些方法，大部分是自己学习的过程中积累的，也许总结得还不够全面，望其他虫友指正。
方法一：安装软件Vector NT
做分子实验，经常和不同的质粒打交道，了解各种质粒的图谱信息是必需的，invitrogen公司的这款软件绝对是分子生物学虫子们的福音，功能强大、界面美观，使用起来很人性化。
后面的很多方法都是基于在这款软件的使用之上，因此个人觉得要想对质粒图谱了解更直观，安装这款软件是非常必要的。
而且，一旦安装了这款软件，你就发现这款软件的软件包里面会包括invitrogen公司的所有质粒图谱信息和其他比较常见和经典的质粒图谱。
这里就不一一细说，各位虫子可以自己体验下。
（这款软件的下载和使用说明书站内很多）
方法二：查找质粒图谱的网站：
这个之前有人求助质粒图谱时，我在回应求助帖里面公布过几个我经常用的网址，估计不是专题，很多人没看到，现在在此重新总结下
1.Vector Database
地址：https:///g?a=vdb
这个网站很页面很人性化，直入主题，也是我经常用到一个网站，比如同样这个帖子求pRS类质粒图谱（注意，是一类质粒图谱，没关系，照样能找到），直接在搜索框输入pRS，可以看到，之类质粒一共有三十多个。
找到自己需要的质粒名称，点击进入，就可以看到质粒图谱了
拿第一个质粒pRS413举例，如上图，质粒图谱是不是很难看，对，我也觉得很难看，没关系，看见view sequence了吗？点击进入，我们就得到该质粒图谱的序列了。
如何得到比较好看的质粒图谱呢，看到GeneBank了吗？对，熟悉vector的虫子们肯定知道该如何做了，对，点击进入，如下图，复制所有的代码部分，新建txt文件，粘贴上代码后，将文件扩展名由txt更改为gb格式，导入vector，你就可以在vector里面看到质粒图谱了。
因为这个网站我经常用，并且和NCBI网站的运用方式一样，以及和Vector软件的配合使用，因此讲解比较啰嗦。
2.Vector DB
网址：/vectordb/vector.html
这个网站我也用得比较多，总结和分类都比较完整。
基本包括了所有表达系统的质粒信息。
不过唯一有一点不爽的就是，这个网站竟然没有搜索栏啊，太不人性化了。
那如何在那么多质粒信息中查找到我们所需要的质粒的信息呢？没关系，我们有网页字符查找功能，见红色标记部分。
方法是：网页工具栏编辑--------在此页上查找，然后输入你的质粒名称，就可以了。
比如：我们输入pRS，是不是就和搜索栏一样出现有用信息了？
点击我们需要的质粒进入下以页面，以质粒pRS303为例，如下图。
有用信息除了对该质粒进行的一些描述性语言外，最重要的要算是红色标记部分了，sequence link进入是该质粒的序列。
NCBI link，点击直接进入了NCBI，如何在NCBI中得到质粒图谱，下面将进行详细解释。
3．NCBI
网址：/
真不好意思，这么重要的网站，留到这时候才介绍，NCBI功能很广泛，其他功能我就不介绍了，重点介绍如何用NCBI查找质粒图谱信息。
如下图，search下拉框中选中Nucleotide，搜索栏输入质粒名称，拿pRS303举例：
search后，得到搜索结果，如下图，点击右边的send to，选中file，genebank等选项，点击Create File选项，得到一个gb格式的文件，导入vector软件中，就得到了我们需要的质粒图谱了。
4．其他查找质粒图谱的网站：
寒梅砺剑阁（不是很全）
/5757561.html
bioask
/html/857.html
AddGene（西瓜版主提供，真的是个非常不错的网址）
这两个网站其实也很不错的，使用方法都是大同小异，就不特别介绍了，希望就放收藏夹就可以了。
方法三：一些重要试剂公司网页
其实也是一些网站，因为这些网站除了得到质粒图谱等信息，还可以得到关于质粒使用方面的信息，因此单独拿出来做一个分类。
做分子的虫子都知道，现在很多质粒，特别是应用比较广泛的质粒都一些公司商业化的质粒，基本是由一个质粒你就会联想到一个公司的名字。
比如简单的，克隆载体pMD18-T，TaKaRa，有木有；pGM-T，天根，有木有；
一些表达载体，使用最广泛的，pET系列，Novagen公司（默克）的；有双MCS的Duet系列载体，Novagen 的；毕赤酵母表达质粒pPIC3.5k，pPIC9k，pPICZA，pPICZaA等等，都是invitrogen的；另外一些pYES酿酒酵母表达系统，也是invitrogen的，因此知道常见的质粒是哪个公司的，去他们公司网站上肯定可以找到该质粒的相关信息。
比如：这个虫子求pGM-T载体序列，见帖子/bbs/viewthread.php?tid=3081308，如下图，他们公司主页有吧。
另外：invitrogen公司：/site/cn/zh/home.html
Novagen公司：/g.asp?f=NVG/pETtable.html
在他们公司主页搜索栏直接搜索质粒名称，得到质粒序列，图谱什么的都不成问题，而且可以下到表达系统操作手册，原核表达看完pET表达系统操作手册，真核系统看完毕赤酵母表达系统，一些表达方面的的知识你就是半个专家了，扯远了。
方法四：如何查找经过改造过的质粒的质粒图谱
有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息。
这时，可以在google scholar 中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源；或者籍此向作者咨询或索取。
另外介绍下如何通过文献查找经过改造的质粒的图谱信息，
Kuhlman, T. E. and E. C. Cox (2010). "☆Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs." Nucleic Acids Res 38(6): e92.
这篇文献，介绍了一种大肠杆菌染色体整合的方法，文中介绍了三个质粒，是由作者自己改造了，如何查找到这三个质粒图谱了呢？
首先在PubMed中搜索到该文献，如下图。
很多人，找到文献，仅仅将文献下载下来就OK了，其实还有很多有用的信息，比如文章的supplementary，还有如上图右边的标记部分，Nucleotide，protein都是一些很重要的信息。
点击右边的Nucleotide，进入如下页面，看，文中涉及到的六个质粒序列全都有，点击进入，按照方法二中，NCBI下载质粒图谱的方法就可以得到这几个质粒的图谱，当然，前提是该文章的作者已将将
载体信息上传了NCBI。
Last edited by susizheng on 2011-4-20 at 20:06。