免疫学实验二 elisa(双抗夹心法)1-ppt课件

注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
大于0.05按实际OD值计算判断值。
注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性；
3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分
化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克
隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动
15.巨噬细胞的主要生物学功能。
16.简述免疫应答的基本过程。 17.抗原的提呈途径（两条）。
18.固有免疫的组成及其与适应性免疫的关系。
19.两种人工免疫的主要区别。预防接种的注意事项。 20.灭活疫苗与减毒活疫苗的主要区别。
论述题（10×2=20）
• 免疫应答：
如TD抗原诱导体液免疫应答的过程； TD抗原诱导细胞免疫应答的过程。
简述补体的组成。 补体活化三条途径的比较。
8.
9.
补体有哪些主要生物学功能？
细胞因子有哪些共同的特性？
10. 细胞因子的主要生物学作用。
11.简述MHC分子的结构及其分布。 12.HLA的主要生物学功能。 13.T细胞表面有哪些与其功能相关的重要分子。 14.B细胞表面有哪些与其功能相关的重要分子。
6. 显色：各孔（包括空白对照）加底物A液50μl（1滴），底
物B液50μl（1滴），置37℃避光温育15min。
7. 终止反应：各孔加终止液50μl （2mol/L H2SO4 ）。
8. 比色：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔 OD值。
6.显色 各孔（包括空白对照）加底物 A液50μl（1滴），底物B液 50μl（1滴），置37℃避光温 育15min
亲和素
5.加底物显色
4.加酶标记的亲和素 3.加生物素标记的特异性抗体
酶
生物素
待检标本
2.加待检标本 1.已知Ab包被固相
材料和试剂：
1. HBsAg、包被液。
酶 标 板
移 液 器
2.待检人血清。
3.酶标记的抗HBsAb抗体。 4.HBsAb阳性对照血清、HBsAb阴性对照血清 5.洗涤液：PH7.4 0.01mol/L PBS-吐温20。 6.底物溶液：OPD-H2O2或TMD-H2O2。 7.终止液：2mol/L H2SO4。 8. 酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪 酶标仪
实验原理：
• 免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测
相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原
理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗
原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化
效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有 颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的 抗原或抗体是否存在及其量的多少。
ELISA的测定方法包括：
7.终止反应 各孔加终止液50μl
（2mol/L H2SO4 ）
OPD（邻苯二胺）经酶 作用后的显色反应
终 止 前 终 止 后
TMB四甲基联苯胺经酶作 用后的显色反应
终 止 前 终 止 后
结果判断：
计算：判断值＝阴性对照平均OD值×2.1
结果判断：待测样品孔OD值大于或等于判断值为阳性；
小于判断值为阴性。
免疫学实验二 elisa(双抗夹心 法)1-教学
实验原理：
酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底
物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体 液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种
固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游
离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－ 抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物
（间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显
色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此 可检测待测抗原或抗体的有无及含量。
该技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
操作步骤：
1. 包被：将HBsAg用包被液作适当稀释（1：100），在
96孔反应板中每孔加100μl，置37℃2h后再移置4℃过
夜。
2. 洗涤：将96孔反应板倾去包被液，用洗涤液PBS-吐温
20加满各孔，置3min,倾去，如此反复3次。（前两步
已完成）
1.已知抗原包被酶Biblioteka Baidu板
2.2拍干
2.1弃去板内包被抗原
2.3加满洗涤液（重复三次）
3.加样
（1）阳性对照：第1、2孔加 HBsAb阳性对照血清50μl；
（2）阴性对照：第3、4孔加
HBsAb阴性对照血清50μl； （3）空白对照：第5孔加生理盐 水100μl； （4）余下各孔加待检血清50μl 。
4. 加酶标记的抗HBsAb抗体：除空白对照外各孔50μl，充分 混匀。将即时帖覆盖于反应板上，37℃孵育30min。 5. 弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置30秒、 再拍干，重复洗涤5 次。(操作同2)
免疫、计划免疫
注：红色标记为要求掌握英文
二、填空题（0.5×40=20分）
三、单项选择题（1×30=30分）
简答5×2=10
1. 2. 3. 4. 免疫的三大功能及其生理和病理表现。 影响抗原免疫原性的因素。 医学上有哪些重要的抗原。 简述Ig的基本结构。
5.
6. 7.
免疫球蛋白有哪些主要的生物学功能？
双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法
间接法：检测抗体最常用的方法
竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体
生物素－亲和素系统ELISA法：是在ELISA中引入生物素或亲 和素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。
直接法
间接法
BAS-ELISA
biotin-avidin-system，生物素-亲和素系统 此法敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。 底物