阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达

分子生物学实验报告阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达
阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达
摘要
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。

绿色荧光蛋白（GFP）基因来自海底生物多孔水母，该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。

现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中，通过阿拉伯糖的诱导，可使该基因在细菌中进行表达。

GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。

关键字：绿色荧光蛋白阿拉伯糖操纵子
前言
由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。

由海肾（sea pansy）所得的绿色荧光蛋白，仅有在498nm 有一个较高的激发峰点。

在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene）。

一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。

2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。

实验目的
1.学习用诱导物诱导外源基因的表达。

2.学习感受态细胞的制备和转化。

实验材料、试剂及仪器
实验材料
GFP质粒DNA、感受态大肠杆菌
实验试剂
实验仪器
恒温摇床、无菌操作台（含酒精灯.）、紫外灯、灭菌锅、电泳仪、1.5ml 离心管、培养皿、PCR扩增仪、台式离心机、紫外分析仪恒温水浴、冷冻离心机、平衡天平、微量移液器等
实验步骤
<一>GFP质粒DNA的提取
与P38质粒提取方法相同。

<二> 感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)
从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm
×12-16h，可过夜培养。

将活化菌体按1～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为0.4。

取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4℃离心8 000rpm×1 min。

弃上清，加500 μl 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

彻底除去残液, 加200 μl 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体。

冰浴静置 20 min ，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

弃上清，加100 μl 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。

<三>大肠杆菌的转化
1.将连接产物加入100 μl制备好的感受态细胞，冰上放置30 min。

2℃热激90s。

迅速冰浴3min。

1.加入600 μl LB液体培养基，37℃轻摇培养45min。

2.30 μl X-gal和6 μl IPTG混匀涂布在含有50 μg/ml氨苄的LB固体培养
平板中。

3.取菌液100 μl涂板。

4.37℃倒置，避光培养16-20 h。

<四>阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达
1.将实验中提取的质粒pGLO转化到大肠杆菌HB101中
2.准备四个LB固体培养平板，其中有两个LB/amp平板，一个LB/amp/arabinose 平板和一个LB平板。

3.将转化菌涂在一个LB/amp和一个LB/amp/arabinose平板上。

4.将对照菌涂布在一个LB/amp和一个LB平板上。

5.37℃培养16小时。

6.紫外灯下进行检测。

实验结果分析
培养基上长有多数菌落，在紫外灯下照射菌落成绿色。

阿拉伯糖成功诱导绿色荧光蛋白的表达。