微生物的生长和纯培养

第二章 微生物的纯培养和显微技术

[教学目标教学目标]] 通过本章的教学，使学生掌握什么是纯培养？微生物分离纯化的基本技术。 [教学的重点和难点教学的重点和难点]] 纯培养的概念和微生物的无菌操作技术。

[教学方法和手段教学方法和手段]] 应用多媒体授课，主要以讲授为辅，实验教学为主。

[教学内容教学内容]]

第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养

纯培养（（pure culture pure culture）：）：

）：单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。 克隆：对于微生物，由于其主要进行无性繁殖，故纯培养即为克隆。 建立纯培养，证实其纯度无可置疑，并保持不受污染是微生物学家最重要的任务之一。（即控制无杂菌）

一、获得纯培养的方法：

（一）.平板分离法：

1、划线分离法：快速、方便。

分段划线（（适用于浓度较大的样品适用于浓度较大的样品））

连续划线（（适用于浓度较小的样品适用于浓度较小的样品））

扇形划线

方格划线

分段划线法

2、稀释倾注分离法：

可定性、定量。

方法：先取稀释液注入平皿，再注入45℃左右的培养基，将稀释液冲开培养基表面、中间均会出现菌落。

3、涂布平板法（培养基表面出现菌落）

简单易行，但易造成机械损伤

（二）．液体分离法

适用于细胞较大的微生物。用液体培养基对菌液做10倍系列稀释，使试管中只存在一个细胞，由此繁殖得到的后代必是纯培养。

（三）单细胞（单孢子）分离法

较大的微生物可用毛细管挑取单个个体；个体较小的微生物，需用显微操作仪，在显微镜下进行。

（四）.选择培养分离（通常做成固体的培养基） ：通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。

1、利用选择平板进行直接分离

2、富集培养

主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，指定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。

固体培养各种微生物形成的菌落特征：

二、纯培养的接种方法

根据菌的生长速度的快慢来选择 斜面接种、液体接种 。

（一）斜面接种：

为保存菌种和获得大量菌种

（1）密涂布法(适用于各种M，可获得大量菌体）

（2）蛇形划线法(适用于易扩散的M）

（3）中央划线法（适用于生长快的M）

（4）点种法（适用于真菌短时间保存菌种）

斜面接种示意图

（二）穿刺接种法：

用于接种试管深层琼脂培养基，以观察细菌运动及鉴定细菌用。

穿刺接种

（三）液体接种法

用接种针在液面边缘-----产生混浊------搅匀、振荡

注意事项：

1、小接种量、

2、用无菌滴管或移液管、

3、直接倒入、

4、利用无菌空气

通过特殊装置压入、5、利用负压吸入液体基中。

三、无菌技术

无菌操作：防止微生物进入物体的技术。

无菌：指没有活的微生物（包括芽孢）。

死亡：指不可逆地丧失了生长繁殖的能力。

除菌：应用机械的方法（过滤、离心分离、静电吸附）除去液体或气体中的微生物。

灭菌操作：杀灭所有微生物

常用 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌

干热灭菌：空气加热灭菌

高温灼烧：用火直接接触烧灭

四、菌种保藏

传代培养保藏

冷冻保藏

干燥保藏

五、二元培养物

如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。

第二节第二节 显微镜和显微技术显微镜和显微技术

一、显微镜的种类及原理

1.种类

普通光学显微镜

暗视野显微镜

相差显微镜

荧光显微镜

透射电子显微镜(transmission electron microscope TEM )

描电子显微镜(SEM )

扫描隧道显微镜 (STM ） 原子力显微镜(AFM)

早期的光学显微镜

2.原理

显微镜的作用主要是放大作用。一般利用目镜和物镜两组透镜 来放大成像，组成由机械装置和 光学系统两大部分。

除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重要的因素，即分辨率和反差。 分辨率：指辨别两点之间最小距离的能力。即最小可分辨能力。

0.5λ

分辨率=-----------

nsinθ

显微镜的分辨率的比较图，书 23页图2-10

反差：样品区别于背景的程度。

与显微镜的自身特点有关；

显微观察时对显微镜的正确使用；

良好的标本制作和观察技术。

二、显微技术

1、良好标本的制备

光学显微镜的制样 活体观察：压滴法、悬滴法、菌丝埋片法

染色观察 ：活菌染色和死菌染色（正染色和负染色）

电子显微镜的制样 透射电镜样品的制备

电子的穿透能力有限，需采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。

常用负染技术

投影技术

超薄切片技术

扫描电镜样品的制备:主要要求干燥 ，并且表面能够导电，常用自然干燥、真空干燥、冷冻干燥等。

干燥、喷镀金属导电层后观察。

2、分析技术

（1）对显微镜的正确使用 了解显微镜的构造和性能。

（2）观察技术 不仅观察物体的形态、结构，可进行的摄影技术，而且与计算科学技术结合的图像分析、模拟仿真技术。

（3）对物体的组成成分定性和定量。