微生物的生长和纯培养
第六章 微生物生长
恒化连续培养
随着细菌的生长，限制性因子的浓
度降低，致使细菌生长速率受限，但同 时通过自动控制系统来保持限制因子的 恒定流速，不断予以补充，就能使细菌 保持恒定的生长速率。 常见的限制性营养物质有作为氮源 的氨、氨基酸；作为碳源的葡萄糖、乳 酸及生长因子，无机盐等。
三、同步培养
微生物细胞极其微小，但它也有一个自小到大 的过程，即个体生长。要研究微生物的个体生 长，在技术上是极为困难的。 目前主要使用的方法是： 同步培养技术分析细胞各阶段的生物化学特性 变化。 电子显微镜观察细胞的超薄切片。
死亡原因？ 营养短缺；代谢毒物增 多；pH、Eh改变；溶氧 不足。
t
时间
稳定期与生产实践
指导思想：延长稳定期。 措施： 1.调节pH； 2.注意降温、通风； 3.中和排除有毒代谢产物； 4.稳定期是生产收获时期，注意把握好收获时机。
（4）衰亡期（老年）
死亡率＞出生率 ？ 细胞畸形 细胞死亡,出现自溶 有的微生物细胞产生或释放出一些产物。 如氨基酸、转化酶、抗生素等。现象。
单细胞微生物典型生长曲线
生 长 速 + 率 0 指 数 期
延滞期 指数期 稳定期 衰亡期
_
菌 数 目 的 对 数 值
延 滞 期
总菌数
稳定期
衰 亡 期
活菌数
0 时间t
微生物的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时 方便，0-10代表1～1010
（1）延滞期－“万事开头难”
特征： 代谢活跃，个体体积、重量增加，
（2）指数期（青年）
快，平均代时（繁殖一代的时间）最短， 生长速率常数最大。 细胞的化学组成、形态、生理特性比较一致。
《微生物纯培养技术》课件
纯培养技术可用于病原微生物的分离、鉴 定和药物敏感性试验，为临床诊断和治疗 提供依据。
微生物纯培养技术
02
的基本原理
微生物的分离与纯化
微生物的分离
通过选择合适的培养基和培养条件， 将混合的微生物群体分离成单一的微 生物个体。
微生物的纯化
通过反复划线、稀释接种等方法，获 得纯培养的微生物，即同一菌种或纯 种微生物的培养。
微生物的培养基
培养基的组成
培养基是由水、碳源、氮源、无机盐 等组成，根据不同微生物的需求，培 养基的成分和比例会有所不同。
培养基的制备
根据配方和操作步骤，将各种成分混 合在一起，经过灭菌处理后，制成适 合微生物生长的培养基。
微生物的培养条件
温度
不同微生物对温度的需求不同，适宜的 温度可以促进微生物的生长和代谢。
生理生化特性分析
测定微生物的生理生化特性，如氧化酶试验 、糖发酵试验等。
应用前景探讨
探讨微生物纯培养技术在生产、科研等领域 的应用前景和潜在价值。
微生物纯培养技术04Fra bibliotek的应用实例
在医学领域的应用
抗生素生产
01
微生物纯培养技术用于分离和培养具有抗生素产生能力的菌株
，为医学领域提供大量抗生素。
疾病诊断
《微生物纯培养技术》 ppt课件
目 录
• 微生物纯培养技术概述 • 微生物纯培养技术的基本原理 • 微生物纯培养技术的实验操作 • 微生物纯培养技术的应用实例 • 微生物纯培养技术的挑战与展望
微生物纯培养技术
01
概述
微生物纯培养技术的定义
01
微生物纯培养技术是指通过一定 的物理、化学手段，将自然界中 混杂的微生物群体分离出来，获 得纯种微生物的技术。
第五章 微生物生长的影响因素
第五章微生物的生长及影响因素先介绍如何在实验室或生产实践中使微生物生长，即如何培养微生物；然后介绍微生物生长的规律（包括个体和群体）；以及环境条件对微生物生长的影响；最后讨论控制微生物生长特别是有害微生物生长的方法。
生长：微生物个体重量的增加和体积增大的现象。
繁殖：微生物数量增多的现象。
第一节微生物生长一、微生物的培养方法（一）微生物的纯培养及获得方法1.纯培养：微生物学将从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代叫作纯培养。
2.获得方法（分离方法）：只有分离到微生物的纯菌种，才能研究和利用微生物，目前常用的分离方法有：①释倒平板法：按不同的稀释度将待分离的材料进行稀释（10倍稀释法），然后分别倒平板，培养得到单一菌落，挑取，分离，纯化即得。
②平皿划线法：在培养基表面用接种环平行或连续划线，培养可得单菌落，分离纯化得纯培养。
平行扇形连续③单细胞挑取法：用单细胞挑取仪（显微镜挑取器）在显微镜下直接挑取单个细胞（菌体）进行培养，而获得纯培养的方法。
④选择培养基分离法：用只适于一种微生物生长的培养基培养，结果只有一种微生物生长，挑取即得。
⑤涂抹培养皿分离法：平板上滴0.2ml菌悬液，用玻璃刮棒涂抹，培养后挑取菌落，纯化即得。
另外，有煮沸法分离芽孢杆菌；利用致死温度的不同分离噬菌体。
（二）微生物的培养方法1.好氧培养法：a.实验室：试管斜面，平板。
b.工业：半固体物料（浅盘法，转桶法，厚层培养法）c.食用菌：袋栽法，床栽法。
2.固体培养法：a.实验室：摇瓶培养法，试管液体培养法，三角瓶浅层培养法，小型台式发酵罐等。
b.工业：发酵罐（通用型搅拌发酵罐，气泡塔型发酵罐，其他形式的发酵罐）。
3.厌氧培养法：a.验室：厌氧培养皿，厌氧试管，厌氧罐。
b.工业：液体静置培养法。
二、微生物的同步生长及同步培养方法1.同步培养法：能使培养物中所有的微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法成为同步培养法。
2.同步生长：培养物中的所有微生物细胞都处于同一生长阶段，并都能同时分裂的生长方式。
实验四微生物的纯培养
微生物纯培养的原理
01
无菌操作
在微生物纯培养过程中，无菌操作是关键。通过在无菌条件下进行样品
的采集、分离、纯化、培养等步骤，确保获得的微生物菌落是单一的、
纯净的。
02
选择性培养基
选择性培养基是根据不同微生物的特殊营养需求和生长特点设计的培养
基，通过选择性培养基能够促进所需微生物的生长，抑制其他微生物的
的微生物群体中分离出来。
纯化
通过反复的分离、移植和纯培养过 程，逐步淘汰其他杂菌，最终获得 纯种的微生物。
鉴定
对纯化的微生物进行形态学、生理 生化及遗传学等方面的鉴定，以确 认其种属和特性。
04
实验结果与分析
微生物的培养结果观察与记录
观察与记录
在实验过程中，我们观察并记录 了微生物在不同培养基上的生长 情况，包括菌落形态、颜色、大 小、生长速度等特征。
微生物纯化
通过反复划线分离或稀释分离 的方法，将微生物逐渐纯化， 获得单一的菌落。
样品采集
根据研究目的选择合适的样品， 采集具有代表性的样品。
微生物分离
通过划线分离法、稀释分离法 等方法将微生物从样品中分离 出来。
微生物培养
将纯化的微生物接种到适宜的 培养基中进行培养，观察其生 长情况并进行记录。
03
改进建议2
寻找成本较低的替代品或国产试剂， 降低实验成本。同时，合理规划实验 材料的使用，避免浪费。
实验在未来的应用前景与发展方向
应用前景
随着微生物资源的深入研究和开发，微生物的纯培养 技术在农业、工业和医疗等领域具有广阔的应用前景 。例如，某些特殊微生物可用于生物农药和生物肥料 的开发，提高农作物产量和品质；某些具有特殊功能 的微生物可用于工业发酵生产；某些药用微生物可用 于抗生素和生物药物的生产。
第八章微生物的生长及其控制
获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化学诱导 物理诱导
过滤法 区带密度梯度离心法 膜洗脱法
二、微生物的生长曲线 生长曲线(Growth Curve)：
二、氧气对微生物生长的影响
根据微生物与氧的关系,可把它们分 为几种类群: 专性好氧菌: 兼性厌氧菌: 微好氧菌： 耐氧厌氧菌： 厌氧菌 (专性)厌氧菌：
好氧菌
一）好氧菌
1、专性好氧菌（obligate or strict aerobes）
必须在较高氧分压的条件下才能生长，有完
整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含
②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体 密度
③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 ④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察 等的良好材料。
③稳定期（stationary phase）
又称：恒定期或最高生长期 特点： ①培生长速率常数R＝0，正、负增 长相等；
②菌体产量达到了最高点；
③细胞内开始积聚糖原、异染粒和 脂肪等内含物；
一）、直接法 比例计数法、 薄膜过滤染色镜检法 血球计数板法、 薄膜过滤荧光镜
检法
二）、间接法（活菌计数法）
平板菌落计数法、平板涂布法、
薄膜过滤平皿计数法
1 总细胞计数法 1） 血球计数板法
薄膜过滤吖叮橙染色荧光镜检法
2 活细胞计数法
1）平皿菌落计数法(稀释倒平板法)
2）平皿菌落计数法(平板涂布法)
第八章
微生物的生长繁殖 及其控制
• 目的和要求： • 本章主要使大家掌握微生物生长繁殖的规律， 微生物生长的测定方法，及各种物理、化学因 素对微生物生长的影响，有害微生物的控制方 法
微生物的纯培养生长曲线及繁殖(共113张PPT)
二、连续培养
第二节 细菌的群体生长繁殖
将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。
分批培养（batch culture）or
封闭培养（closed culture）
培养基一次加入，不予补充，不再更换。
第二节 细菌的群体生长繁殖
二、连续培养
连续培养(Continous culture ）
一、生长曲线
第二节 细菌的群体生长繁殖
细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物， 如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产 生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。
该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分
细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。
细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图
一、生长曲线
第二节 细菌的群体生长繁殖
一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期
一、生长曲线
第二节 细菌的群体生长繁殖
迟缓期(Lag phase)：
将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加， 或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。
一 以数量变化对微生物生长情况进行测定
2、膜过滤培养法
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样 品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形 成的菌落进行统计。
一 以数量变化对微生物生长情况进行测定 3、The most probable number method（：
分裂迟缓、代谢活跃
细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞 的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞 体积最大
微生物生长与控制
微生物生长的研究方法 环境因素对微生物生长的影响 微生物生长的控制
生长与繁殖的概念
生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢， 当同化作用大于异化作用时，生命个体的重量和体积 不断增大的过程。
繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产 生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学 过程。
典型的生长曲线
延对 滞数 期期
稳定期
衰亡期
生长速率常数(R)=分裂次数(代)/单位时 间
典型的生长曲线按照生长速率常数（growth race constant）不 同分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期
1.延滞期（lag phase）
其它名称：停滞期、调整期、适应期 1）现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。 2）特点：
2、对数期（logarithmic phase）
其他名称：指数期
指细胞以几何级数速度分裂的一段时期
1）特点：
Ø生长速率常数最大，即代时最短 Ø细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致 Ø代谢最旺盛
2） 影响因素：
Ø 菌种 Ø 营养成分 Ø 营养物浓度﹡ Ø 培养温度
E.coli 17 分，结核杆 菌 792—932分
单批培养
连续培养
时间
（二）连续培养器
按控制方式分
内控制（控制菌体密度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速、以控制
连
生长速率）：恒化器
续 培
按培养器的级数分
单级连续培养器 多级连续培养器
菌体生成器 产物合成器
养
按细胞状态分
一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
器
按用途分 实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
《微生物生长》PPT课件
选择培养基分离法
2020/12/31
编辑ppt
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1.平板 划线法
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2.稀释倒平皿法
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在不补充营养物质或移去培养物， 保持整个培养液体积不变条件下， 以时间为横坐标，以菌数为纵坐 标，根据不同培养时间时细菌数 量的变化，可以作出一条反映细 菌在整个培养期间菌数变化规律 的曲线。
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生长曲线可 分：
延滞期 lag phase
对数期 log phase
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３．薄膜过滤计数法
常用微孔薄膜过滤法测定空气和水中的 微生物数量。
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此法适用于测定量大、含菌浓度很低的流体
样品，如水、空气等。 2020/12/31
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4．比浊法
为测定菌悬液中细胞数的快速方法。原 理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比， 与透光度成反比，可用分光光度计测定 光密度，对照标准曲线求出菌液浓度。
编辑ppt
11
3. 单细胞分离法
采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞进行 培养以获得纯培养 。
在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单 孢子或单细胞进行培养。也可以采用极细的毛细管在 载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移 到合适的培养基进行培养。
第五章 微生物生长与培养
1.选择和配制培养基的原则和方法
（1）营养物质组成合理，浓度适当，满足菌体 生长需要； （2）在一定条件下，各原料之间不发生化学反 应，理化性质相对稳定； （3）粘度适中，具有适当渗透压； （4）生产中选用的原材料尽量因地制宜，以降 低成本； （5）理化性质适宜，pH、氧化还原电动势也要 满足一定的要求。
样。
在微生物培养和发酵研究中，也需要研究微生物
培养的最佳氮源
生理酸性盐:
微生物代谢后形成酸性物质的某些无
机氮源 如(NH4)2SO4
生理碱性盐: 微生物代谢后产生碱性物质的某些无 机氮源 如 KNO3 生理酸性盐和生理碱性盐具有稳定调节发酵过程中 PH的积极作用。
表 氮源对恶臭假单胞菌 NA-1 菌株生长和酶形成的影响 氮源 硫酸铵 氯化铵 蛋白胨 酵母粉 尿素 谷氨酸 肉汁 硝酸钠 生物量(mg/mL) 1.45 1.33 3.88 4.07 2.53 5.07 3.74 2.62 烟酸羟基化酶活性(unit/mL) 0.002 0.000 0.301 0.288 0.111 0.045 0.371 0.114
②液体好氧培养方法
a. 摇瓶震荡培养箱
b. 台式磁力搅拌不锈钢发酵罐
c. 工业通用型搅拌发酵罐
2.厌氧培养方法
微生物厌氧培养箱
（二）微生物纯培养与混合培养
含有一种以上微生物的培养称作混合培养。自 然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微 生物混杂在一起的群体。 微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得 到的后代称为纯培养。 研究微生物生长通常采用微生物纯培养。
成分中，可以满足微生物生长的需要，一般不需要 额外添加。
第七章微生物的生长与环境条件ppt课件
根据公式：G = （t2 - t1 ）/3.3 ·lg (x2 /x1)
t2 - t1 = （4 - 0）× 60 min = 240 min
x2 = 108
x1 = 104
lg(x2 /x1 ) = lg108 ~ lg104 = 8 - 4 = 4
代入上式 G = 240/3.3 × 4 = 240/13.2 = 18 min
二、孢子生长
无性孢子繁殖 孢子的生长包括: 孢子肿胀（外源肿胀，不需营养；内源肿胀，需要营养）; 萌发管形成; 菌丝生长。
有性孢子繁殖 第一阶段是质配（plasmogamy） 第二阶段为核配（karyogamy） 第三阶段是减数分裂（meiosis）
第三节 环境条件对微生物生长的影响
生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的 改变，在一定限境条件的某些改 变；当环境条件的变化超过一定极限，则导致微生物的死亡。 研究环境条件与微生物之间的相互关系意义重大。本节将较 多地涉及各种物理、化学因素对微生物生长的抑制与致死的 影响。
用最高稳定期的培养物接种
抑制DNA合成法
利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除 其抑制，也可达到同步化的目的。试验证明：氨甲蝶呤、 5-氟脱氧尿苷、羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟 苷等，对细胞DNA合成的同步化均有作用。
总之，机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱导同步分裂 虽然方法多，应用较广，但对正常代谢有时有影响，而且对其 诱导同步化的生化基础了解很少，化学诱导同步化的本质还是 一个尚待研究的问题。
在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的，即 20 →2 1 →22 →23 ……2n 这里的指数 n 为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一 个细菌繁殖n代产生2n 个细菌。 如果在对数期开始时间 t1的菌数为 x1 ，繁殖 n 代后到对数 期后期t2的菌数为 x2，则代时（Generation time，G）（即 每增加一代所需要的时间）应为：
第二章--微生物的纯培养和显微技术
第二节 显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及其原理 二、显微观察样品的制备 三、显微镜下的微生物
几个基本概念：
一、显微镜的种类及原理
1.普通光学显微镜（复式显微镜）
机械装置: 镜座、支架、载物台、调焦螺旋等 光学系统: 物镜、目镜、聚光镜等
使用油镜时加镜油的目的: (1)增加照明亮度 (2)增加显微镜的分辨率
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线 照射后可激发荧光；另有一些物质本身虽 不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗 体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧 光显微镜就是对这类物质进行定性和定量 研究的工具之一
105
荧 光 显 微 镜 观 察
5、 透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM)
原理：用一束电子作为它的能源，电子的波长很短，能够 检测极细微的物体，如病毒和分子。
应用：通过细胞超薄切片，观察细胞内部的详细结构如细 胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）
6、 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM)
原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在 样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子，二次电子由 探测器收集，并转变为光信号。
光学显微镜
光学理论依据
德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的 在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距 离被称为最小距离（d）
最小距离=0.5/nsin= 0.5/NA
分辨率（R) ∝ 1/d
分辨率(最小可分辨距离)=0.5λ∕ n sinθ = λ∕2NA
波长与分辨率
高压蒸汽灭菌锅
2、接种操作
接种工具： 白金or镍铬合金接种针/环
微生物的生长与环境条件
迟缓期出现的原因： 微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶， 或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢 产物，就需要一段适应期。
在生产实践中缩短迟缓期的常用手段： (1)利用对数生长期的细胞作为种子；
(2)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；
(3)适当扩大接种量
低温保藏菌种，实践中，采用 低温保藏食品，防止杂菌生长
斜面: 4℃ 石蜡油: 4 ℃ 沙土管: 4 ℃ 甘油管: -70℃,液氮 冻干管: 4 ℃ 水: 常温
2、 辐射作用 辐射灭菌(Radiation Sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波 杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。
15
20 25
1.0
1.46 1.77
101.33
135.10 168.88
121.3
126.2 130.4
30
2.10
202.66
134.6
空气排除程度与温度的关系
压力表读数 /Pa
灭菌器内温度/℃
未排除空气 排除1/3空气 排除1/2空气 排除2/3空气 完全排除气
35 70 105 140 175 210
最高温度
高温型微生物 中温型微生物 低温型微生物
高温杀菌 高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏， 以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。
(1)干热灭菌
烘箱内热空气灭菌 160-170℃，2小时
干热灭菌
火焰灼烧
(2)湿热灭菌 湿热比干热灭菌更好： 水蒸汽的气化热高，更易于传递热量；
72 90 100 109 115 12l
90 100 109 115 121 126
微生物的生长和纯培养
深低温保存
将微生物培养物进行冷冻干燥处理，制成 冻干粉末，然后密封保存于干燥器或真空 包装中。
将微生物保存在液氮或液氮蒸汽中，达到 长期保存的目的。
04
微生物的应用
在农业上的应用
生物肥料
01
微生物肥料中的有益微生物能分解土壤中的有机物质，增加土
壤的团粒结构和保水能力，促进植物生长。
生物防治
02
利用有益微生物防治植物病虫害，如细菌、真菌和原生动物等，
血清学鉴定
利用特异性抗体与相应抗原的免疫反 应，对微生物进行血清学分型和鉴定。
微生物的保存
低温保存
干燥保存
将微生物保存在低温条件下，如冰箱或冰 柜中，可以延缓微生物的生长和代谢，达 到长期保存的目的。
通过去除微生物培养物中的水分，制备成 干燥粉末或孢子悬液，然后密封保存于干 燥器或真空包装中。
冷冻干燥保存
在生产实践中，纯培养也是必须的， 例如在发酵工业中，只有纯培养才能 保证发酵过程的稳定性和产品的质量。
纯培养的方法
选择性分离法
根据微生物的生理生化特性，选 择适合的培养基和培养条件，使 目标微生物得以生长繁殖，而其
他微生物则受到抑制。
稀释和接种法
将样品稀释到适当的浓度，然后接 种到培养基中，使每一接种单位只 含有单个微生物细胞。
微生物的生长和纯培养
目录
• 微生物的生长 • 微生物的纯培养 • 微生物的分离和鉴定 • 微生物的应用
01
微生物的生长
微生物的生长周期
延迟期
微生物适应新环境，开始繁殖 前的阶段，生长速率较低。
对数生长期
微生物以恒定的生长速率快速 繁殖，细胞数量呈指数增长。
平台期
微生物的培养及生长规律
24
分, 40℃ 代时17.5分
14
单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌,其群体生长是以群体 中细胞数量的增加来表示的
☆ 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代,一个 世代所需的时间就是代时〔Ｇeneration time, G 〕,代时 也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间,有时也称为倍 增时间.
6
二.单细胞微生物的群体生长曲线
生长曲线的制作：
生长曲线的制作
接种
适温培养 定时取样测 定生长量
将少量单细胞的纯培养,接种到一新鲜液体培养基中, 在适宜条件下培养,每隔一定时间取样,测菌细胞数目. 以培养时间为横坐标,以细菌增长数目的对数为纵坐 标,绘制所得的曲线.
7
二.单细胞微生物的群体生长曲线
22
一些细菌的代时
菌名 培养基 培养温度
代时
E. coli〔大肠杆菌〕 肉汤
37℃ 17min
E. coli 牛奶
37 12.5
Enterobacter aerogenes〔产气肠细菌〕 肉汤或牛奶 37 16~18
E. aerogenes 组合
37 29~44
B. Cereus〔蜡状芽孢杆菌〕 肉汤
衰亡期比其他各时期时间长,它的长短也与菌种和环境条件 有关. 产生原因：生长条件的进一步恶化,使细胞内的分解代谢大大 超过合成代谢,继而导致菌体的死亡
18
3.微生物生长与代谢产物形成的关系
微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一 致的.一般认为：
项目四：微生物培养技术
生长因子等。 （二）温度 ：依据细菌对温度的需求不同，可将分为嗜冷菌、
嗜温菌、嗜热菌三大类。大多数病原菌的最适温度为37℃。 （三）PH：大多数细菌的最适pH7.2～7.6 （四）渗透压：细菌细胞需要在适宜的渗透压下生长繁殖 （五）气体：与细菌生长繁殖有关的气体主要是氧和二氧化
（二）根据培养基的用途分：
1、基础培养基 ：如牛肉膏蛋白胨琼脂 这种培养基可供培养一般细菌使用。
2、营养培养基 ：如加血液、血清、葡萄糖、酵母 浸膏等，可供营养要求较高的细菌生长。
3、选择培养基 ：如培养沙门氏菌的培养基中加入 四硫磺酸钠、亮绿，可以抑制大肠杆菌的生长。
4、鉴别培养基 ：如醋酸铅培养基、麦康凯培养基， 依靠指示剂的颜色反应，借以鉴别不同种类的细 菌。
(1)热原质 许多革兰氏阴性菌与少数革兰氏阳性 菌在代谢过程中能合成一种多糖物质，注入人 体或动物体能引起发热反应，称为热原质。
(2)毒素 毒素的产生与细菌的致病性有关，细菌 产生的毒素有内毒素和外毒素两种。
(3)细菌素 是某些细菌菌株产生的一类具有抗菌 作用的蛋白质 。
(4)维生素 动物机体的正常菌群能合成维生素B和 维生素K，可被机体利用。
5、厌氧培养基 ：如疱肉培养基，可供厌氧菌生长。
(三)按培养基的成分
（1）合成培养基：营养物质的成分及其浓度完全清楚；组 分精确；重复性强。但微生物生长缓慢，所用各种物质成 本昂贵，只在实验室里使用。
（2）天然培养基：采用动植物组织、微生物浸出物等，如 牛肉高蛋白质、玉米粉、麦芽汁、麸皮、马铃薯、酵母膏， 等皮革厂、肉食品加工厂、淀粉厂的付产品配制成。不稳 定、不精确。微生物生长良好，培养基易得，成本低廉， 适于大生产中配制培养基。
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第二章 微生物的纯培养和显微技术
[教学目标教学目标]] 通过本章的教学，使学生掌握什么是纯培养？微生物分离纯化的基本技术。
[教学的重点和难点教学的重点和难点]] 纯培养的概念和微生物的无菌操作技术。
[教学方法和手段教学方法和手段]] 应用多媒体授课，主要以讲授为辅，实验教学为主。
[教学内容教学内容]]
第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养
纯培养（（pure culture pure culture）：）：
）：单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。
克隆：对于微生物，由于其主要进行无性繁殖，故纯培养即为克隆。
建立纯培养，证实其纯度无可置疑，并保持不受污染是微生物学家最重要的任务之一。
（即控制无杂菌）
一、获得纯培养的方法：
（一）.平板分离法：
1、划线分离法：快速、方便。
分段划线（（适用于浓度较大的样品适用于浓度较大的样品））
连续划线（（适用于浓度较小的样品适用于浓度较小的样品））
扇形划线
方格划线
分段划线法
2、稀释倾注分离法：
可定性、定量。
方法：先取稀释液注入平皿，再注入45℃左右的培养基，将稀释液冲开培养基表面、中间均会出现菌落。
3、涂布平板法（培养基表面出现菌落）
简单易行，但易造成机械损伤
（二）．液体分离法
适用于细胞较大的微生物。
用液体培养基对菌液做10倍系列稀释，使试管中只存在一个细胞，由此繁殖得到的后代必是纯培养。
（三）单细胞（单孢子）分离法
较大的微生物可用毛细管挑取单个个体；个体较小的微生物，需用显微操作仪，在显微镜下进行。
（四）.选择培养分离（通常做成固体的培养基） ：通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。
1、利用选择平板进行直接分离
2、富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，指定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
固体培养各种微生物形成的菌落特征：
二、纯培养的接种方法
根据菌的生长速度的快慢来选择 斜面接种、液体接种 。
（一）斜面接种：
为保存菌种和获得大量菌种
（1）密涂布法(适用于各种M，可获得大量菌体）
（2）蛇形划线法(适用于易扩散的M）
（3）中央划线法（适用于生长快的M）
（4）点种法（适用于真菌短时间保存菌种）
斜面接种示意图
（二）穿刺接种法：
用于接种试管深层琼脂培养基，以观察细菌运动及鉴定细菌用。
穿刺接种
（三）液体接种法
用接种针在液面边缘-----产生混浊------搅匀、振荡
注意事项：
1、小接种量、
2、用无菌滴管或移液管、
3、直接倒入、
4、利用无菌空气
通过特殊装置压入、5、利用负压吸入液体基中。
三、无菌技术
无菌操作：防止微生物进入物体的技术。
无菌：指没有活的微生物（包括芽孢）。
死亡：指不可逆地丧失了生长繁殖的能力。
除菌：应用机械的方法（过滤、离心分离、静电吸附）除去液体或气体中的微生物。
灭菌操作：杀灭所有微生物
常用 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌
干热灭菌：空气加热灭菌
高温灼烧：用火直接接触烧灭
四、菌种保藏
传代培养保藏
冷冻保藏
干燥保藏
五、二元培养物
如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。
第二节第二节 显微镜和显微技术显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及原理
1.种类
普通光学显微镜
暗视野显微镜
相差显微镜
荧光显微镜
透射电子显微镜(transmission electron microscope TEM )
描电子显微镜(SEM )
扫描隧道显微镜 (STM ） 原子力显微镜(AFM)
早期的光学显微镜
2.原理
显微镜的作用主要是放大作用。
一般利用目镜和物镜两组透镜 来放大成像，组成由机械装置和 光学系统两大部分。
除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重要的因素，即分辨率和反差。
分辨率：指辨别两点之间最小距离的能力。
即最小可分辨能力。
0.5λ
分辨率=-----------
nsinθ
显微镜的分辨率的比较图，书 23页图2-10
反差：样品区别于背景的程度。
与显微镜的自身特点有关；
显微观察时对显微镜的正确使用；
良好的标本制作和观察技术。
二、显微技术
1、良好标本的制备
光学显微镜的制样 活体观察：压滴法、悬滴法、菌丝埋片法
染色观察 ：活菌染色和死菌染色（正染色和负染色）
电子显微镜的制样 透射电镜样品的制备
电子的穿透能力有限，需采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。
常用负染技术
投影技术
超薄切片技术
扫描电镜样品的制备:主要要求干燥 ，并且表面能够导电，常用自然干燥、真空干燥、冷冻干燥等。
干燥、喷镀金属导电层后观察。
2、分析技术
（1）对显微镜的正确使用 了解显微镜的构造和性能。
（2）观察技术 不仅观察物体的形态、结构，可进行的摄影技术，而且与计算科学技术结合的图像分析、模拟仿真技术。
（3）对物体的组成成分定性和定量。