实验四乳鼠肺细胞原代培养
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
乳鼠肺组织细胞培养系列实验
1 、去原瓶培养液
将培养瓶从培养箱中取出镜下观察已形成致密单层细胞， 点燃超净工作台中的酒精灯。在酒精灯旁将已形成致密单层 细胞的乳鼠肺组织细胞的培养瓶中原来的培养液吸去，加入1-2mlHanks液冲洗组织块2次后倒去多余的Hanks液。
2、消化：
加入1~1.5ml0.25%Trypsin（胰酶溶液），使板底细 胞都浸入溶液中，静置2-3min后去掉多余的Trypsin，剩 少许，将培养瓶放于倒置显微镜下观察继续消化约5min
3.
六、讨论与反思
实验三 制备细胞爬片复苏细胞细胞的计数及活力测定
一． 传代、制备细胞爬片： （1）原代细胞弃培养基，Hanks液漂洗（ 2）加胰酶（半吸管）消化5min（3）加全培（ 1 吸管）并吹打 20-30 下（ 4）培养板中 放入无菌盖玻片（ 5）将细胞悬液加在板内盖玻片 上。（ 6）板内补充足量全陪（ 1 吸管/孔）
D-Hanks液、75%酒精、
实验步骤
1.取材：取1-3d新生乳鼠， 鼠身浸入 75%酒精中消毒后去除 移入工作台内将乳鼠仰位固定。在胸线正中线中位处，用 眼科弯镊（第一套器械）夹起皮肤拉开，是躯干肌肉暴露 酒精消毒胸廓后， 沿膈膜剪断胸廓， 剪短肋骨， 暴漏胸廓， 取眼科镊（第三套器械）弯头段向上将肺取出，立即移入 加有Hanks液的青霉素瓶内。
传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，
2天左右就在瓶内形成单层， 达到七八成满。这时需再次传代 注意事项
1.消化时如果未见空隙说明消化程度不够可将消化时间
稍延长如果发现细胞已大片脱落说明已消化过头在这种情况
下不能倒出消化液而应直接进入下步操作。
2.注意吹打时要轻，避免产生过度气泡，污染细胞悬液
灯的周围进行
原代细胞培养实验报告单
一、实验目的1. 熟悉并掌握哺乳动物细胞原代培养的基本操作流程。
2. 学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。
3. 了解无菌操作的重要性，学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。
二、实验原理细胞培养是生物学和医学研究的重要手段之一，可分为原代培养和传代培养。
原代培养是指从生物体中取出某种组织或细胞，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素。
细胞培养可分为原代培养和传代（继代）培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐等因素的影响。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：新生乳鼠肺组织2. 器材：眼科剪、眼科镊、泡器械（直径15cm）、培养皿、动物解剖用的泡沫支架、青霉素瓶、吸管、培养瓶、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、电磁搅拌器3. 试剂：Hank’s液、RPMI-1640液、血清细胞培养液、安尔碘、酒精四、实验步骤1. 取新生乳鼠肺组织，用无菌手术刀将组织切成小块。
2. 将组织块放入装有Hank’s液的培养皿中，用眼科剪和眼科镊轻轻剪碎组织。
3. 将剪碎的组织块移入离心管中，加入适量胰蛋白酶，在37℃水浴中消化10分钟。
4. 将消化后的细胞悬液移入离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃上清。
5. 用RPMI-1640液重悬细胞，调整细胞浓度至1×10^6细胞/mL。
6. 将细胞悬液接种于培养皿中，放入二氧化碳培养箱中培养。
7. 每2-3天更换一次培养液，观察细胞生长情况。
鼠肺细胞的分离纯化及原代培养
鼠肺细胞的分离纯化及原代培养严玉兰;刘洋;步雪峰;张志坚;郑金旭【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2008(018)001【摘要】目的:建立一套可靠的鼠肺细胞分离、纯化和培养技术,用于体外研究间质性肺病的发病机制及治疗方法.方法:采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺组织块及SD大鼠肺泡灌洗液, 经差时贴壁法, 分离、纯化红皮鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast, LF)和SD大鼠肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophage,AM), 并进行原代培养.用波形蛋白(Vimentin)、 CD14细胞免疫荧光染色、蛋白质印迹和电镜对所分离的细胞进行鉴定.结果:所得细胞产量大、纯度高.细胞免疫荧光染色LF细胞波形蛋白染色阳性而CD14染色阴性;AM细胞则相反.扫描电镜观察可见肺成纤维细胞有微绒毛,细胞间连接成网状,蛋白质印迹结果显示波形蛋白表达.结论:该方法是一种可靠的红皮鼠肺成纤维细胞及大鼠肺巨噬细胞的分离纯化培养技术, 可用于间质性肺病(interstitial lung disease, ILD)的发病机制及治疗方法的体外研究.【总页数】5页(P11-14,前插2)【作者】严玉兰;刘洋;步雪峰;张志坚;郑金旭【作者单位】江苏大学附属人民医院呼吸内科,江苏,镇江,212002;江苏大学医学院,江苏,镇江,212013;江苏大学附属人民医院呼吸内科,江苏,镇江,212002;江苏大学医学院,江苏,镇江,212013;江苏大学医学院,江苏,镇江,212013【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离纯化、原代培养及鉴定 [J], 丁小芳;钟礼立;张兵;李嘉2.原代大鼠胰岛细胞分离纯化及单细胞培养初探 [J], 罗瑞琼;韦芳;荣曦;刘红3.胎鼠肺细胞的分离纯化及原代培养 [J], 祝华平;常立文;李文斌;刘汉楚;张谦慎4.新生鼠肺成纤维细胞原代培养方法的比较与体外肌成纤维细胞分化模型的建立[J], 孙月;徐洪;徐丁洁;魏中秋;于婉莹;邓海静;薛新新;杜世璞;杨方5.小鼠胎肺Ⅲ型上皮细胞的分离纯化及原代培养 [J], 张明凤;张彦定;王昕;王虹;张龙斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
原代细胞培养步骤
原代培养(primary culture)，准备工作：A玻璃用品清洁，灭局步骤：1，洗涤剂正常洗刷干净2，放入托盘中，200度烤1-2h（烘干）3，泡酸（过夜），吸管捆好，做好记录4，捞酸，冲洗干净（注意安全）5，放入托盘中，200度烤1-2h（烘干）6，包瓶，吸管用棉花塞好，报纸包好，烧杯和配液的瓶子，瓶口内层用硫酸纸，外层用牛皮纸，包好，用线系好7，放入托盘中，200度烤2h（灭菌）8，收集放好B塑料，瓶盖，胶塞清洁处理步骤1，用洗涤剂正常刷洗干净2，晾干，放入酸中，过夜（胶塞除外）3，次日捞出，冲洗干净，过三水（蒸馏水，三蒸水，去离子水）4，放入饭盒中，高压锅，烘干箱，烘干C器械盒（3把剪刀，2把镊子，2个烧杯，2个滤网，2个培养皿）1，洗涤剂冲洗干净2，过三水3，放入饭盒中压，烘干乳鼠心肌原代培养过程：A准备工作：1，剪封口膜（3-4个长的；鼠的只数x2+2的短封口膜）2，器械：平镊，弯镊，剪刀（3把），筛网3，离心管，吸管，平皿1对，50ml烧杯1个，冰袋4，DMEM，DMEM+10%FBS 胰酶（不含EDTA—除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。
）B步骤（一）准备1，将所需的离心管放在试管架上(PS：大概一只心脏一只离心管；多准备3个--2个消化细胞用，一个放混匀用的吸管用)2，点燃酒精灯，依次将吸管打开，加上胶头，并标明吸何种液体，以免操作中混淆（PS：2个吸管--胰酶和混匀用；一个移液管--移取培养液用）3，打开试剂，将其盖，放在远离操作的空间尽量往里4，打开器械，按顺序依次摆放（2把剪刀；一把弯镊）5，用酒精擦试冰袋，打开平皿，并将平皿过火，将平皿放在冰袋上，在每个平皿里加入DMEM(无血清)（二）取乳鼠心脏1，戴无菌手套，将小鼠浸入酒精中消毒，捏抓小鼠背部皮肤，用1st剪刀剪掉头部，然后剪开皮肤，在用2nd剪刀，剪开胸骨（靠左侧点）用镊子夹取心脏，放入DMEM平皿中，注意镊子不要碰到别处。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。
二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。
用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。
组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。
鼠肺细胞的分离纯化及原代培养
［ ｂｔａｔ ｏｂｅｔ ｅ ｏｄｖｌ ｅａｒｌｂｅｍｅ ｏ ｏ ｏ ｔｎ ｕ ｆａｏ ｎ ｒ ａｙｃｌ ｒ ｏ Ａ ｓ ｃ］ ｒ ｊｃｉ ：Ｔ ｅｅ ｐ ｅｉ ｌ ｔ ｄｆｒｓｌｉ ，ｐ ｒ ｃｔ ｎａｄｐ ｍ ｒ ｕｔ ｅ ｆ ｖ ｏ ａ ｈ ｉ ａｏ ｉ ｉ ｉ ｉ ｕ
ｌｎ ｂｏ ｌ ｔ Ｌ ｕ ｇｆ ｒｂａ （ Ｆ）ａ ｄ ｐ ｌ ｏ ａｙ ａ ｅｌ ａｒｐ ａ ｅ Ａ ｉ ｓ ｎ ｕｍ ｎｒ ｌ ｏ ｒｍ ｃｏｈ ｇ （ Ｍ）ｆ ｍ ｒｔｆｒｓ ｄｅ ｎ ｐｔｏｅｅｉ ａ ｄ ｖ ａ ｒ ａ ｏ ｔ ｉ ｏ ａ ｇｎ ｓ ｎ ｏ ｕ ｓ ｈ ｓ
第 １ 第 １期 ８卷
２０ ０ ８年 １ 月
江 苏 大 学 学 报（ 学 版） 医 Ｊｕ ａ ｏ Ｊ ｎｓ ｎｖｒ ｔ（ ｄｃｎ ｄｔ ｎ ｏｒ ｌ ｆ ｉ ｇｕ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｍｅｉ ｅＥ ｉｏ ） ｎ ａ ｅｉ ｉ ｉΒιβλιοθήκη Ｖｏ ＿ ８ Ｎｏ． ｌ１ １
Ｊｎ ０ ８ ａ ．２ ０
法 。方法 ： 采用胰 酶消化 出生后 ２ｄＳ Ｄ大 鼠肺组织 块及 Ｓ Ｄ大 鼠肺泡灌洗液 ， 差时贴壁法 ， 离 、 经 分 纯化红皮 鼠肺成 纤维细胞 （ｕｇｆ ｒｂ ｓ， Ｆ 和 ｓ １ｎ ｂｏｌ ｔ Ｌ ） Ｄ大鼠肺 泡巨噬细胞 （ ｕｍ ｎｒ ｌ ｏａ ｍ ｃｏｈｇ ， Ｍ） 并进 行原代培 养。用波 ｉ ａ ｐ ｌ ｏａｙａ ｅｌ ａｒｐａｅ Ａ ， ｖ ｒ 形蛋 白（ ｉ ｎｉ） Ｃ １ Ｖｍｅｔ 、 Ｄ ４细胞免疫荧光染 色 、 白质 印迹 和电镜 对所分离的细胞进行鉴定 。结果 ：所得细胞产量大 、 ｎ 蛋
纯 度 高 。细 胞 免 疫 荧 光 染 色 Ｌ Ｆ细 胞 波 形 蛋 白染 色 阳性 而 Ｃ １ 色 阴 性 ； Ｍ 细 胞 则 相 反 。 扫 描 电镜 观 察 可 见 肺 成 Ｄ ４染 Ａ
乳鼠传代培养实验报告
一、实验目的1. 掌握乳鼠细胞传代培养的基本方法；2. 观察乳鼠细胞在体外培养过程中的形态变化；3. 熟悉乳鼠细胞传代培养的注意事项。
二、实验原理乳鼠细胞传代培养是指在体外条件下，将培养的细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶的过程。
通过传代培养，可以扩大细胞数量，保持细胞的遗传稳定性，并研究细胞在不同条件下的生物学特性。
三、实验材料1. 乳鼠细胞；2. 75%乙醇；3. PBS（磷酸盐缓冲盐溶液）；4. 0.25%胰蛋白酶；5. 细胞培养基（DMEM/F12，含10%胎牛血清）；6. 细胞培养瓶；7. 移液器；8. 离心机；9. 显微镜。
四、实验方法1. 准备工作（1）将细胞培养瓶用75%乙醇消毒，然后用无菌PBS冲洗；（2）取适量乳鼠细胞，加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养。
2. 传代培养（1）取出一瓶培养好的乳鼠细胞，用移液器将细胞悬液转移至另一个培养瓶中；（2）加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养。
3. 观察细胞形态（1）取出一瓶培养好的乳鼠细胞，用移液器将细胞悬液转移至另一个培养瓶中；（2）加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养；（4）每隔一定时间观察细胞形态变化，记录实验结果。
五、实验结果1. 乳鼠细胞在体外培养过程中，细胞形态逐渐从圆形变为扁平状，细胞密度逐渐增加；2. 在传代培养过程中，细胞形态保持一致，细胞密度逐渐增加；3. 观察细胞形态变化，未发现细胞异常。
六、实验讨论1. 乳鼠细胞在体外培养过程中，细胞形态逐渐发生变化，可能与细胞生长、代谢等因素有关；2. 传代培养过程中，细胞形态保持一致，说明乳鼠细胞具有较强的遗传稳定性；3. 在实验过程中，应注意无菌操作，避免细胞污染。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告引言原代培养是一种将从组织或器官中分离得到的细胞进行体外培养的方法。
它具有重要的科研和临床应用价值。
本实验报告将详细介绍细胞原代培养的步骤、影响因素以及常见问题的解决办法，以及对细胞培养实验的观察结果和分析。
材料与方法1. 实验所用细胞系我们选择了小鼠胚胎纤维细胞（MEF）作为实验所用细胞系。
MEF细胞具有较强的增殖能力和较长的寿命，非常适合原代培养实验。
2. 原代细胞培养基的配制与消毒配制原代细胞培养基的主要成分有： - DMEM培养基 - 胎牛血清（FBS） - 青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）配制原始培养基时要进行严格的消毒操作，以防止细菌和真菌的污染。
3. 细胞分离与传代分离过程1.取出小鼠胚胎。
2.将小鼠胚胎置于无菌PBS中，去除头部和内脏。
3.将净化后的胚胎置于细胞培养基中。
4.用无菌耐热胶管切成碎片，使其均匀分散。
5.加入细胞培养基中的胞外消化液。
6.重复离心和去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
7.加入预暖的细胞培养基，充分悬浮细胞。
8.继续离心、去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
传代过程1.收集上述分离得到的细胞悬液。
2.用血细胞计数板计数细胞数目。
3.计算倍增比例，将细胞悬液按比例加入新鲜的细胞培养基中。
4.转移至新的细胞培养瓶中，继续培养。
4. 影响细胞培养的因素4.1 培养基的质量培养基中的成分质量直接影响到细胞的生长和增殖能力。
优质的培养基会提供细胞所需的营养物质和生长因子。
4.2 培养条件的控制细胞的生长需要适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
同时，细胞培养过程中需要定期更换培养基，以保持培养环境的稳定性。
4.3 质量检测与细胞鉴定在细胞培养的过程中，定期进行培养基的质量检测和细胞的鉴定非常重要。
常用的质量检测方法包括菌落计数法和PCR方法。
结果与讨论1. 细胞形态观察在细胞原代培养的过程中，我们进行了细胞形态的观察。
列举乳鼠肺组织细胞原代培养的操作过程
列举乳鼠肺组织细胞原代培养的操作过程#1准备工作
乳鼠肺组织细胞原代培养操作需要准备乳鼠、肺组织以及菌混合培养基等物料，在冰箱和水浴中保持物料温度。
先将无菌温度调节至37℃的水浴中保存乳鼠肺组织，水浴温度由温度调节器控制，以免细胞死亡。
2灭菌处理
用无菌开发箱将肺组织置于夹层台内，使用20%的氯仿溶液对肺组织进行灭菌处理，大约每滴余1分钟，然后重复以上步骤以泡法灭菌完毕后，放入37℃的培养箱内，冰箱内备有灌注液，以便细胞培养过程中准确控制培养环境，避免细胞继受外界伤害。
3切片
用外科手术刀除去动物肺组织表面残余的组织，有助于平面均匀切割出肺组织片，然后将切割的片放入无菌冰槽中，每张片的厚度大约为200μm左右，使用特殊的网格格栅将肺组织分成多个小细胞块。
4体外培养
将分割的细胞块用菌混合培养基和DMEM液体混合在一起，使用低速分散攪拌机，将分散后的细胞悬浮在菌混合培养基和DMEM液体碰撞混合，均匀混合，混合完成后，体外培养培养液加入无菌细胞培养皿，完成细胞原代培养。
5细胞孵育
将培养皿放入37℃恒温培养箱，给予5%的二氧化碳保持体外培养环境，每24小时换液1次，进行3～5次换液，每次换液皆要使用无菌操作，以保证细胞原代培养完好且安全。
6细胞监测
观察细胞在不同时间段内增殖情况，通过传统的乳鼠肺细胞血清减少荧光或者进行免疫细胞化学染色，可以准确方便地检测出不同培养时间内细胞的状态和分化情况。
乳鼠肺组织细胞原代培养是一个比较复杂的过程，要求操作者有良好的仪器设备，并且要具备较强的操作技巧，熟悉每一步的操作流程，可以有效地让细胞原代培养达到期望的效果。
原代培养_实验报告
一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉细胞培养所需的设备和试剂。
3. 了解细胞培养过程中可能遇到的问题及解决方法。
二、实验原理原代培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理条件，使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
原代培养细胞与体内细胞在形态结构和功能活动上具有相似性，适用于研究细胞生长、代谢、分化等生物学特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠、大鼠等。
2. 组织：肝脏、脾脏、皮肤等。
3. 试剂：胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清、DMEM培养基等。
4. 设备：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机等。
四、实验步骤1. 组织块制备（1）取动物组织，用生理盐水清洗，去除血污。
（2）将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块。
（3）将组织块置于含有胰蛋白酶的消毒培养皿中，37℃水浴消化15-20分钟。
（4）加入适量胎牛血清终止消化，用吸管吹打组织块，使其分散成单个细胞。
2. 细胞接种（1）将分散后的细胞悬液移至含有DMEM培养基的培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。
（2）观察细胞生长情况，适时更换新鲜培养基。
3. 细胞传代（1）待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞。
（2）收集消化后的细胞，加入胎牛血清终止消化。
（3）将细胞悬液接种至新的培养瓶中，继续培养。
4. 细胞观察（1）使用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。
（2）对细胞进行染色，如台盼蓝染色、Giemsa染色等，观察细胞核、细胞器等结构。
五、实验结果1. 原代细胞在培养过程中呈现典型的贴壁生长，细胞形态为多边形、梭形等。
2. 细胞生长速度较快，2-3天即可达到80%的融合度。
3. 细胞传代过程中，细胞生长状态良好，无明显形态变化。
六、实验讨论1. 原代细胞培养过程中，无菌操作至关重要。
应确保所有操作均在超净工作台内进行，避免污染。
2. 培养基的配制和质量直接影响细胞生长。
应严格按照试剂说明书配制培养基，并确保其质量。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。
二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。
用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。
组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材的方法如下：
1. 准备工具和试剂：显微镜、组织培养耗材（培养皿、离心管、无菌吸管等）、组织培养基、酶消化液（如胰蛋白酶）、PBS缓冲液、抗生素/抗菌剂。
2. 选择适当的组织：根据需要培养的小鼠细胞类型，选择相应的组织。
常用的组织包括肝脏、肺、脾脏、肌肉等。
3. 术前准备：将工作台面清洗消毒，准备好所需的培养皿和离心管，并在显微镜下准备好所需的组织。
4. 组织分离：将小鼠人工麻醉后，用无菌PBS缓冲液冲洗外部组织，然后取出所需的组织。
将组织切成小块，放入含有适当酶消化液的离心管中，进行酶消化。
消化时间和温度根据具体实验要求来确定。
5. 组织纯化：将酶消化后的混合细胞悬液通过滤网过滤，去除组织碎片和大颗粒。
然后将悬液离心，收集沉淀细胞。
细胞沉淀可以通过悬液离心的速度和时间的调整来控制纯化程度。
6. 细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要的细胞数量。
7. 细胞培养：将收集到的细胞沉淀转移到含有适当培养基的培养皿中。
根据细胞类型的不同，培养条件和培养基的配方也会有所区别。
一般来说，细胞培养条件包括适当的培养基、温度、CO2浓度和湿度。
8. 细胞培养维护：定期更换培养基，观察细胞的生长情况，及时处理培养皿中的细菌或真菌污染，并进行细胞的传代培养。
以上是小鼠细胞原代培养取材的基本方法，具体操作中还需要根据实验需求和细胞类型的特点进行相应调整。
原代细胞培养操作(鼠胎组织细胞培养为课件
–一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒 性
–主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下， 观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境， CO2气体迅速逸出， pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一 般在进行克隆化培养时要添加HEPES
. 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； . 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；
. 方法：
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色， 镜下呈无色透明状。
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胶塞的清洗
• 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用 自来水冲洗，再做常规处理
• 常规清洗方法
–每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉 煮沸10-20 分钟 (以除掉培养中的蛋白质) ， 自来 水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用
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塑料制品的清洗
• 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的 包装，打开包装即可用，多为一次性物品
• 消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液 (5-10倍量) ，
与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况 (每隔几分钟摇
动一下试管) ，静止，吸去上清，加入5~10ml细胞培养液，
用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱
中培养
1
2
细胞培养中应注意的几个问题
1)培养液和培养物的比例： 一定浓度的培养液
• 常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗 干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。
本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。
实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。
然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。
最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。
使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。
将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。
实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。
初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。
随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。
细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。
细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。
细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。
同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。
实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。
在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。
细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。
在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。
原代细胞培养实验报告
20养的注意事项18
细胞培养:基本技术
细胞培养:pbs
细胞培养:血清
细胞培养:二氧化碳
2012-03-08动物细胞培养:基本技术指南(第5版) 中英文版本可以也发给我一份吗？...
2011-10-27动物细胞培养-基本技术指南（第五版）作者：英R.I.弗雷谢尼 著，章...
3.实验用品
3.1 材料和标本 乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)
3.2 器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。
2.3 试剂 含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
③．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
4.2.3 结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
4.2.2 操作
①．将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。
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实验四乳鼠肺细胞原代培养
一、实验目的
1. 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。
2. 学习细胞消化、细胞计数方法。
二、实验原理
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。
三、实验用品
1. 设备
COW养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、包温水浴箱、离心机等。
2. 器材
眼科剪（尖头、弯头）、眼科镶（尖头、弯头）、培养血、纱布块（或不锈钢网）、玻璃漏斗、量筒、移液管、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养皿•等。
上述器材均须彻底活洗、烤干、包装好，15磅灭菌30min。
此外，还需显微
镜、血细胞计数板、洒精灯、洒精棉球等。
3. 试剂
（1）D-Hanks平衡盐溶液：即无钙、镁离子的Hanks液。
（2）细胞消化液：0.25%胰蛋白酶液（0.25g胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡
盐溶液100mL溶解后过滤除菌，调p血7.4）
（3）7.4 % NaHCOS液。
（4）RPMI1640S养液。
以上溶液均经适当包装，除菌后备用。
此外，还需胎牛血活和1000U/mL勺宵、链霉素液（双抗）。
在RPMI164（®养液中加入10%台牛血活，1%（抗，即成细胞培养液。
4. 仪器药品
以3-5人为一个小组，每组需备：乳鼠一只；眼科剪、眼科镶各两把；90mm 玻璃培养皿■ 3个，用以活洗组织块；50mlM心管1个；5mL 10m畛液管各5支；35mm 培养也1个。
四、材料
出生后2-3天的乳鼠。
五、实验步骤
1. 活洗与消蠹
操作者首先进行手的活洗与消蠹。
2. 处死动物
新生小鼠拉颈椎致死，置75%酉精泡2—3秒钟，置平■皿•中。
3. 取肺
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分
撕拉开，再用洒精棉球消蠹，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科聂取出肺，置丁盛有HankS夜（含有200U/ml 背链霉素）的玻璃平■皿•中，冲洗去血。
4. 剪肺
用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镶子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的Hanks液冲洗1遍。
用弯头眼科剪，将肾剪成1m祇小的组织块，大小应尽量均匀一致，再用Hank夜洗涤2-3次，直到液体澄活为止。
5. 消化及分散组织块
将上步活洗过的Hank夜吸掉，按组织块体积的5-6倍量加入消化液。
转入50mL 离心管，置丁37C水浴中进行消化。
消化时间在20-40min左右。
每隔10min摇动一次，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。
从水浴中取出离心管，吸去胰蛋白酶液，加入少量培养液，用吸管反覆吹打组织块，直到大部分组织块均分散成混淆的细胞悬:液为止。
此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布(或不诱钢网)进行过滤，以去除部分较大的组织碎片。
6. 计数与稀释
从上步滤过的细胞悬液中吸取ImLffl胞液，进行计数。
将细胞液滴丁血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用培养液进行稀释，将细胞调整到5X 105/ml 左右
7. 分装与培养
接种时，在25ml的培养瓶中先加入1.5mk的培养液，在用移液管将接种1ml 稀释好的细胞悬液，做好标志，注明细胞、日期等信息。
然后将培养血置丁37C,
5%COt养箱进行培养
8. 观察
置丁37C培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：
(1) 培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。
(2) 细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。
(3) 培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。
六、讨论
培养细胞的过程和结果。
七、思考题
如何提高原代细胞培养的效率。