抗可溶性抗原抗体制备程序弗氏不完全佐剂弗氏完全佐剂混合高压灭菌

第7周 0.5ml
离心
杂交瘤融合
6 %淀粉肉汤 IF鉴定 IF鉴定
HAT筛选 脾细胞10份
有限稀释 克隆化
再次克隆化
免疫小鼠
+
50%PEG 秋水仙素鉴定 小鼠染色体
融合 sp2/0细胞1份
无血清培养基
特异性和 效价鉴定
胶体金 IgG亚型鉴定
注意事项
选择的动物状态要好；免疫后效价要高；融合效率 要比较高，筛选到阳性克隆的几率也要比较高；饲 养细胞很重要。
实验讨论
单克隆抗体的优点和可能的应用范围。
江苏大学 邵启祥
实验三
酶标抗体的制备
实验原理
NaIO4是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分（与酶活性无 关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合， 形成酶标抗体，反应式如下：
实验器材和材料
试剂：抗人IgG抗体、HRP、0.30 M pH 8.1 NaHCO3 （现用现配）、1 %氟二硝基苯（FDNB）无水乙醇溶 液、0.08 M NaIO4、0.16 M乙二醇溶液、0.10 M pH 9.5 NaHCO3缓冲液、0.01M碳酸盐缓冲液、氢化硼钠 （NaBH4）、0.15M pH7.4 PBS缓冲液、pH7.8饱和硫酸 铵溶液及半饱和硫酸铵溶液和萘氏试剂。 仪器：搅拌器、分光光度计、普通低速冷冻离心机和高 速冷冻离心机。 材料：透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
实验原理
采用杂交瘤技术将抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨 髓瘤细胞通过融合剂融合，杂交瘤既保持 B淋巴细胞分 泌抗体的能力，又获得了骨髓瘤细胞无限增殖的能力， 最后通过筛选获得针对某一抗原决定簇的抗体，此即为 McAb。
实验器材和材料
细胞：SP2/0细胞系、人“O”型红细胞悬液（红细胞反 复 洗涤直至不溶血为止，浓度调整至2×107/ml）。 试剂： 50 %（W/V）的聚乙二醇（PEG 1500）、 100×HT母液、100×A母液、琼脂糖、降植烷、二甲基 亚砜、Tris碱、盐酸、硫酸铵液、DEAE-纤维素、 RPMI-1640培养液和新生牛血清。 动物：采用和杂交瘤同源的8周龄的Balb/c健康小鼠，鼠 龄在；另备经产母鼠3~5只。
混合高压灭菌
耳缘静脉
最后耳缘静脉 注射加强免疫
耳正中动脉
弗氏完全佐剂
用人IgG与不完全佐剂按 1:1体积比加入，卡介苗的 终浓度为1~20 mg/ml。
耳缘静脉采血
2 3
1 4
6 5
抗体效价滴定
推成油包水制剂
注意事项
选择合适的动物种属及品系；良好的抗原质量 和合适的剂量；合理的修饰；适当的佐剂、免疫强 度和免疫途径，有助于提高免疫效果；动物的健康 状况等。
耗材：24孔和96孔细胞培养板、无菌毛细滴管、1ml无菌 刻度吸管。
器械：无菌直头和弯头眼科剪各3把、无菌直头和弯头眼 科镊3把。 仪器：水平低温冷冻离心机、CO2培养箱。
实验方法
红细胞免疫
洗至不溶血
IF鉴定
“O”型血
2×107/ml
腹腔注射
免疫时序 免疫剂量
第1周 0.5ml
第3周 0.5ml


实验方法
标记：
将5mg HRP溶于1ml 0.30 M pH 8.1 NaHCO3中，加 0.1ml 1% 氟二硝基苯无水乙醇溶液，混合，加入 1ml 0.04M~0.08M NaIO4，室温轻搅30min。至黄绿色时，加 1ml 0.16M 乙 二 醇 溶 液 终 止 反 应 ， 室 温 1h 。 置 于 4℃ 0.10M pH 9.5 NaHCO3透析。然后于3ml HRP-醛基溶液 中，加入5mg抗体，室温置3h，加入5mg氢化硼钠，4℃ 过夜，0.15M pH7.4 PBS液透析过夜，离心去沉淀物。
实验器材和材料


ห้องสมุดไป่ตู้菌种：伤寒沙门菌O901和伤寒沙门菌H901菌株。
动物：体重在2.5kg左右的健康青年新西兰家兔。


培养基：细菌普通肉汤培养基、细菌普通固体培养基。
试剂： 人IgG、羊毛脂、石蜡油、注射用卡介苗、二甲 苯、无菌生理盐水、0.5%无菌甲醛盐水、0.5%无菌石 灰酸盐水、2 % NaN3和3 %戊巴比妥钠等。
第一单元
综合性实验
实验一 多克隆抗体制备
多克隆抗体概念
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由多种抗原决定簇刺 激机体，相应地就活化多个B淋巴细胞克隆，所产生多个单克隆 抗体（McAb）的混合物，此即为多克隆抗体。
实验原理
当抗原刺激机体免疫系统，B细胞在T细胞的辅助下（多数 抗原需要T细胞参与），识别抗原的B细胞表位（T细胞识别T细 胞表位）后，T细胞和B细胞均活化，由B细胞针对抗原的B细胞 表位产生的能与抗原B细胞表位结合并发挥生物学功能的免疫球 蛋白。
无菌试验（37℃恒温摇床）
耳正中动脉采血
大容量低温高速离 心机离心收集细菌 试管凝集试验鉴定
抗可溶性抗原抗体制备程序
弗氏不完全佐剂
背部多点注射
羊毛脂1份 + 石腊油5份
免疫时序 免疫剂量 第 1周 1ml， 200μg 第 3周 1ml 100μg 第 4周 1.5ml 150μg 第 5周 2ml 200μg
实验结果分析和讨论
实验结果: 观察免疫效果如何？ 分析和讨论： 实验结果或失败的原因，哪些方面还存在问题？ 抗原制备是否达到要求？ 佐剂制备的情况？ 动物状态？ 采血方式？
江苏大学 邵启祥
实验二 单克隆抗体的制备
单克隆隆抗体概念
一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞克隆 接受该抗原决定簇所产生的抗体称之为单克隆抗体 （Monclone antibody，McAb）。
实验方法
抗颗粒性抗原抗体制备程序
伤寒沙门菌O901、H901 O901、H901菌液
耳缘静脉注射（1×109/ml ） 18~24h后，用无菌生 理盐水菌苔洗下接种
免疫时序 免疫剂量 第1天 0.5ml 第5天 1ml 第10天 1.5ml 第15天 2ml 第20天 2.5ml
18~24h后，分别用无菌0.5%石灰 酸盐水和甲醛生理盐水洗下菌苔
器械：细菌接种环、16号钢质注射针头（或7号留置针）、 注射器三通阀、5ml无菌玻璃注射器、兔子固定架，灭菌 三角烧瓶（200 ml）和烧杯（200 ml）、平皿（直径9 cm） 等。 其他：酒精棉、脱脂棉、塑料放血管、纱布、800ml细菌 培养用克氏培养瓶，标准麦氏比浊管和50ml圆底进口离心 管或100~500ml细菌离心瓶。 仪器：37℃恒温培养箱、37℃恒温气浴（或水浴）摇床、 低温高速大容量离心机（水平转子，至少能满足50ml离心 管的离心）。