液相色谱串联质谱联用仪检测技术

液相色谱串联质谱联用仪检测技术实验指导（2014、2015级）课程内容（一个实验8学时）：（1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。

（2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。

吉林农业大学农业部参茸质检中心2017.03实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用一.实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。

培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。

（一）检测仪器1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。

型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。

2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。

3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围）4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。

在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。

4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。

Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。

各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。

4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。

整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。

（二）样品1、样品要求本仪器适合分子量在5 ~ 1700 amu范围内的有机样品的定性及定量分析。

待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。

若样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液。

2、试剂要求所有的试剂均选用色谱纯级，所用水的电导率应大于18KΩ。

流动相必须用0.2µm 或0.45µm滤膜过滤后方可使用。

3、分离条件要求在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流动相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐。

（三）、操作步骤实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器的操作规程，仪器的工作状态、包括检测灵敏度和分辨率，必须满足检测项目的要求。

1、开机前准备开机前应检查仪器室内电、气的供应情况及空调机的工作状态是否稳定，检查真空机械泵泵油是否需要更换。

只有当UPS工作正常，Gas1/Gas2、Curtain Gas和Exhaust Gas的压力分别稳定在0.35、0.35和0.7 Mpa，环境温度为10~30℃，相对湿度小于70%时才能开机。

2、开机1) 打开真空机械泵上的电源开关。

2) 真空机械泵继续工作至少15分钟后，打开MS电源主开关。

3) 等真空度达到2×10-5Torr（绿色指示灯不闪）后，打开PC计算机电源3、仪器调谐（四）、方法建立1.在Analyst软件Tools菜单中选择Project→Create Project。

在Project name项下输入新建的Project 名称。

注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK，确认新建Project。

2.在Analyst软件界面下，双击导航栏内Hardware Configuration。

在弹出窗口中选择MassOnly，点击Activate Profile，激活MassOnly（只联接质谱主机）。

3.在导航栏内单击Tune and Calibrate，进入调谐模式。

点击上方工具条中的T钮。

此时，应注意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。

此时右下角质谱状态显示绿色。

双击Manual Tuning，进入质谱参数设置及运行窗口。

4.使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。

点击MS Method下拉菜单，选择Syringe Pump Method，设定针泵流速Flow Rate为10μL/min。

5.点击Start Syringe Pump按钮开针泵进样。

6.返回MS Method，选择扫描模式Scan Type为Q1 MS，设定扫描速度Scan Rate为10Da/s，设定扫描范围Start——Stop设定为50——化合物分子量。

DP预输入60。

7.点击start开始采集数据。

运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约E4以下。

点击stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。

点击右键，选择Delete Pane。

8.设定Scan type为产物离子扫描Product Ion（Ms2），扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（product of），设定扫描范围start——stop为50——MW+20，覆盖可能的子离子质量范围，点击compoud标签，设定（DP）60，（CE）5。

9.点击start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。

手动调节CE，以5eV为步长，逐渐增加。

每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。

选择平稳的一段，双击，选择子离子。

10.选择Scan Type为MRM。

设定参数表格中的Q1对应的母离子，Q3对应的子离子，time（ms）为50，ID值设为名称1（定量），名称2（定性）。

11.点击Edit Ramp，在Parameter下选择Collision Energy，点击OK。

点击start开始采集数据，记录每个MRM通道的最佳CE电压。

在MRM参数设定表中，右键点击。

选择Collision Energy CE，调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最佳CE电压值，精确到个位数。

重复以上步骤，在Parameter项下选择Declustering Potential，优化并保存DP。

完成后选择菜单File/Save保存采样方法，[文件名].dam。

（五）LCMS方法的建立：1、连接仪器：打开HPLC质谱电源，将HPLC系统接上柱子，将6号出口管线与离子源连好。

调离子源喷雾针位置到2mm处，双击Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击LCMS ( 液相与质谱联用)，单击Activate profile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。

2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目）；双击Build acquisition method新建方法，弹出新建方法模板。

在模板左侧点击acquisition method，模板右边显示对应的参数，确认synchronization mode选择LC Sync,表示液质同步。

3、设置MRM参数：点击方法模板左侧的MRM, 在模板右侧Scan Type下选择MRM；在polarity 下选择化合物极性：Positive(正离子)、Negative（负离子）；Duration为15min(与液相分离相同的时间)；表格中Q1：母离子分子量，Q3(Da)：子离子分子量，Time（msec）：50，ID栏：化合物名称（离子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性），在表格中右键分别单击DP、CE，点击工具栏的OPEN打开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行，Ctrl+c(复制)参数，关闭窗口，再Ctrl+v(粘贴)参数）；最后点击Edit parameter设置离子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR 35，IS:5500(正离子) 或-4500（负离子），TEM 600，GS1 60，GS270，点击OK。

4、设置液相参数：点击模板左边的shimadzu LC system，①在右边的pumps栏下，设置stop time（运行时间）为15min，flow流速为1mL/min，A为水相设为95%，B为有机相设为5%（设置时改B，A自动），泵最大压力为50；点击time program设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：②接着在右边的Auto sampler栏下，设置清洗时间，在Rinse mode 下选择Before and after(前后都洗)，并设置清洗时间为5s，清洗液用50%甲醇水。

最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法的名称。

（五）数据处理双击打开Multiquilt，选择项目，点击File下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击next，create new method，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据），设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组），并指定内标，next，对每个物质进行积分。

设置积分参数：CausianSmoth（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1或2；Expeceted Time（保留时间）:一般不动Expected time范围：一般30s，表示在保留时间±15s范围最小峰宽最小峰高背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。

分峰因子：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2单位：设置单位，勾选Apply units to all可将此单位用于所有化合物点击next，点击finish。

在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。