经典遗传学实验(绝对经典)

二、实验材料和实验用品
1．实验材料 2．实验用品 显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、镊子、培养皿、酒精灯、吸水纸、纱布、刀片、滤纸、 火柴、等。 3．实验药品 无水乙醇、95%乙醇、重铬酸钾、浓盐酸、浓硫酸、冰醋酸、二甲苯、加拿大树胶和洋红（或 苏木精） 。 玉米雄花序
三、实验方法与步骤
1．取材：选取适当大小的花蕾，是观察花粉母细胞减数分裂的关键性步骤。不同植物取材时 期不同。 玉米：在抽雄前两周左右（大喇叭口期） ，用手指从喇叭口处向下挤捏叶鞘，触到有松软感处， 即是雄花序所在部位。在该处用刀片纵向划一切口，用镊子取出花序分枝。此时雄花序先端小穗 颖长 4mm 左右，花药长 2～3mm，每一分枝中上部小穗发育最早。 取材时间一般在上午 9 时～10 时，不同材料间稍有差异。 2．固定：取下的材料应立即放入固定液中杀死固定。在 4～15℃条件下，一般固定时间为 24 小时。固定后的材料先用 95%酒精漂洗至无醋酸气味，再移到 70%酒精中置于冰箱内保存。常用 的固定液是法氏固定液，在使用这种固定液时应注意现配现用，固定时不要在阳光下暴晒。 3．染色和压片：先将已固定的材料置于培养皿内并倒入少许保存液。用镊子摘取一个适当大 小的小穗或花蕾放在吸水纸上吸掉多余的酒精， 然后放在载玻片中央。 用解剖针挑出 2～3 个花药，
四、作业和思考题
1．写出制片步骤流程图。 2．制作两张质量较好的临时片（有条件可制作永久片） ，并绘制减数分裂粗线期、终变期、 中 I、后 I、中 II、后 II 的图像。
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实验二
植物根尖压片技术
一、实验原理
有丝分裂是植物细胞分裂、体细胞增殖的主要方式，在有丝分裂过程中，细胞核内染色体准 确地复制，并有规律地、均匀地分配到两 个子细胞中，使子细胞和母细胞具有同样 数目和形态结构的染色体，保证了植物细 胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植 物组织中，如根尖组织、茎尖组织、居间 分生组织、愈伤组织等，细胞常进行着旺 盛的有丝分裂。在细胞分裂的适当时期取 材，通过对供试材料进行一定的处理，就 可以在显微镜下观察染色体的变化特点和 染色体的形态特征，并进行染色体计数。 由于在有丝分裂的中期染色体具有典 型的形态特征，并易于计数，因此为了获 得更多的中期染色体图像，可以采用药物 处理或冰冻处理的方法，阻止纺锤体的形 成，使细胞分裂停止在中期。同时通过处 理还可使染色体缩短，易于分散，便于进行观察研究。另外，通过对细胞组织进行酸性水解或酶 处理除去细胞之间的果胶层，并软化细胞壁，使细胞容易彼此散开，有利于压片和染色。
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转入 70%酒精中保存。 4．解离：解离的目的是使细胞壁之间中层的果胶物质以及部分细胞质分解，而使细胞易于分 散。同时也可使细胞壁适度软化而易于压片。解离的方法主要有以下几种。 （1） 将根尖用蒸馏水冲洗 2 次， 然后放入已经在 60℃水浴锅中预热的 1mol/L 盐酸中。 在 60℃ 恒温条件下处理 10～15 分钟，当根尖透明呈米黄色时取出。 （2）将根尖置于 95%酒精和浓盐酸的等量混合液中处理 2～10 分钟。或将根尖放在 5ol/L 盐 酸内处理 5～10 分钟。 （3）将根尖置于 2.5%果胶酶和 2.5%纤维素酶等量混合液中（PH 5～5.5） ，在室温 18～28℃ 条件下处理 2～3 小时。 5．后低渗：将根尖放在蒸馏水中冲洗 2～3 次（约 10 分钟） 。酶解后的根尖可浸泡 10 分钟， 然后再冲洗一次。根尖一定要冲洗干净，否则影响染色。低渗后的根尖放入 70%酒精中备用。 6．染色与压片：染色与压片的方法常用的有以下几种。 （1）醋酸洋红染色法：取一根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液，然后放在一张干净的载玻 片中央。用刀片将根尖分生组织切下，将其切成薄片（越薄越好） ，滴 1 滴 2% 醋酸洋红染色液， 盖上盖玻片，进行压片。压片时用一手固定盖玻片，另一手用镊尖或解剖针柄轻敲盖玻片，使材 料溃散。用火轻烤载玻片背面，然后继续轻敲，待材料呈云雾状即可镜检。加热的目的是使染色 体充分染色和软化，以及破坏细胞质的染色。如发现有较理想的分裂相，可再轻烤一下片子，然 后在盖玻片上盖一张吸水纸，用大拇指用力压片（不可使盖玻片移动） ，然后镜检。 也可以采用十字交叉压片法。即：取根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液，然后放在干净的 载玻片中央。用刀片将分生组织切下，将其切成薄片。取另一张干净的载玻片，呈十字形交叉盖 在放有材料的载玻片上。在载玻片上盖一张吸水纸，并用大拇指压片，使材料压成一薄层。然后 将两载玻片分开，各滴加 1 滴染色液进行染色。稍停片刻后加上盖玻片，在酒精灯上轻烤一下片 子，一手固定盖玻片，另一手用铅笔橡皮头对准材料轻轻敲打，使根尖细胞分散均匀。 （2）改良卡宝品红染色压片法：将根尖置于干净的载玻片中央，切下根尖分生组织，将其切 成薄片，滴一滴改良卡宝品红染色液，盖上盖玻片压片。 。 （3）铁矾苏木精染色压片法：先将根尖放入 4%铁矾水溶液中媒染 2～4 小时。然后流水冲洗 20 分钟，再将根尖放入 0.5%苏木精染液中避光染色 40～120 分钟，取出后放入蒸馏水中备用。其 制片方法，取一染色后的根尖放在干净载玻片的中央。用刀片将根尖分生组织切下，将其切成薄 片（越薄越好） ，滴 1 滴 45%冰醋酸，加盖玻片，具体压片方法同上。 7．镜检：压好的片子先在低倍镜下镜检，找到分裂细胞后转换高倍镜观察。如果染色体分散 较好，图象清晰，就可以脱水封片，制成永久片。
二、实验材料和实验用品
1．材料：圆葱、大蒜、黑麦、玉米、小麦和蚕豆。 用品：显微镜、恒温箱、冰箱、水浴锅、分析天平、剪子、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、 滤纸、量筒、培养皿、烧杯、滴瓶、酒精灯、切片盒、标签等。多媒体系统（附显微演示） 。 2．药品：无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、蒸馏水、碱性品红、苏木精、秋水仙素、饱和对二 氯苯溶液、0.002mol/L 8－羟基喹啉、1mol/L 盐酸、4%铁矾水溶液、2%醋酸洋红染色液、2.5%纤 维素酶和 2.5%果胶酶混合液。
表1源自文库
药 品 条 件
常用药液预处理时间
圆 葱 15 4 室温 4 18 玉 米 室温 3 小 麦 25 2 室温 4 室温 4
温度（℃） 0.1% 秋水仙素溶液 处理时间（小时） 温度（℃） 饱和对二氯苯溶液 处理时间（小时） 温度（℃） 处理时间（小时）
0.002mol/L 8－羟基喹啉
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3．固定或前低渗：固定的目的是利用化学药品将生活细胞迅速杀死，并使构成染色体的核蛋 白变性和沉淀，以保持染色体的固有形态和结构。固定液一般采用卡诺氏固定液，配配制方法为 无水酒精：冰醋酸＝3：1，也可用 95％ 乙醇代替无水乙醇。 操作时将预处理后的根尖用蒸馏水冲洗两次 （约 5 分钟） ， 然后转移到卡诺氏固定液中。 在 4～ 15℃条件下固定 20～24 小时，即可进行观察。如果需要长期保存，可先用 70%酒精冲洗 2 次然后
遗传学实验指导
山东农业大学遗传学教研室 二零一六年
目
录
实验一 植物花粉母细胞减数分裂制片和染色体观察 实验二 植物根尖压片技术 实验三 染色体组型分析 实验四 基因的分离、独立分配和互作，连锁基因的遗传分析 实验五 果蝇的形态鉴别和饲养管理 实验六 植物 DNA 的提取与定量分析 实验七 植物的 SSR 分析（待修改） 实验八 遗传连锁图谱构建和 QTL 分析（待修改）
实验一
植物花粉母细胞减数分裂制片和染色体观察
一、实验原理
减数分裂是生物在性母细胞成熟形成配子过程中发生的一种特殊有丝分裂，它包括连续两次 的细胞分裂，第一次分裂是减数的，第二次是等数的。第一次分裂的前期较长，染色体变化较复 杂，可细分为 5 个时期，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。染色体在减数分裂的行 为对遗传物质的分配和重组产生重大影响。 高等植物在形成雄配子的过程中，花药内的小孢子母细胞（2n） ，经过减数分裂最终产生四个 小孢子。每个小孢子内的染色体数目已减半为 n。以后每个小孢子进一步发育为花粉粒。由于植物 花药取材容易，操作方便，一般作为减数分裂制片材料。在适宜的时期采集植物的花蕾，经固定 液杀死固定，使细胞保持活体时形态。然后进行压片染色等处理，制成减数分裂玻片标本，在显 微镜下进行观察，可以看到小孢子母细胞的减数分裂过程（即染色体由双倍变为单倍体的过程） ， 研究染色体在形态和数量上的动态变化特点。
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丝串起放在盛清水的培养皿内培养，其它要求同上。剪取根尖的时间以上午 10 时左右为好。 （2）玉米（或黑麦、小麦、蚕豆）根类：先将种子浸泡一天，待吸水膨胀后再转移到铺有几 层滤纸（或吸水纸）的培养皿内，加水湿润，然后将种子均匀地摆放在滤纸上，盖上盖。放在 18～ 20℃黑暗条件下培养，待根长到 1～2cm 时，选健壮根尖于上午 10 时左右取下备用。 田间从植株上直接取根的方法适用于大部分禾本科植物，例如在麦类作物生长季长出的大量 不定根，比种子萌发的根更健壮，是观察有丝分裂的很好材料。 2．预处理：为了阻止纺锤体的活动，获得更多的中期分裂相，同时使染色体相对缩短，便于 染色体分散和计数，可对根尖进行预处理。如果只是为了观察有丝分裂各期染色体动态，可以不 进行预处理。 预处理的方法有冰冻预处理和药物预处理两种。 （1）冰冻预处理：将根尖浸泡在蒸馏水中，置于 1～4℃冰箱内或盛有冰块的保温瓶中冰冻 24 小时。这种方法对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，效果良好，简便易行，各种作物都适 用。 （2）药物预处理：常用的药物有 0.05～0.2%秋水仙素溶液、饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L 8 －羟基喹啉等。预处理时，将根尖直接浸泡在药液中，在适宜的温度下处理一定的时间（表 1） 。 这些药物都能使染色体缩短，但同时对染色体也有一定破坏作用。使用时应注意处理的时间，小 麦、黑麦、大麦、圆葱和大蒜等处理 4 小时左右，棉花和水稻等处理 2 小时左右。处理的时间长 短同温度有很大关系。
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并立即滴醋酸洋红或醋酸铁矾苏木精染色液于花药上。用解剖针将花药横向切断，并从一端向切 口轻轻挤压花药，使花粉母细胞从切口处逸出。然后用镊子除尽花药壁等杂物。这是压片优劣的 关键步骤之一，如不去净残渣，则不容易把分裂的细胞压平，使染色体不容易分散开，并且在制 作永久片的过程中，细胞会从载玻片上大量脱落。去净残渣后，在低倍镜下进行初步镜检，如果 花粉母细胞处于减数分裂时期，即可加上盖玻片。加盖玻片时，先使盖玻片的一边放在载玻片上， 待染液布满整个边缘时，左手握镊子顶住盖玻片，右手握解剖针托住盖玻片轻轻放下。加上盖玻 片以后，如有多余染色液，可用吸水纸吸去；如染色液不能布满盖玻片，则在盖玻片一边稍加染 色液，然后在酒精灯上烤片。烤片时，用手平持片子在酒精灯上方来回移动，并经常将片子放在 手背上试温，以片子不烫手为宜，可反复进行多次。烤片是制片过程中的一项很重要的步骤。通 过烤片可使细胞质颜色变浅，而染色体能得到充分鲜明的着色。烤片以后可在盖玻片上加一小块 吸水纸，以拇指或用带橡皮头的铅笔轻压盖片。应注意不要使盖片移动。如果镜检发现染色体染 色太浅，可在盖玻片周围稍加染色液再烤；如果染色太深，可从盖玻片一边滴加 45%冰醋酸，在 另一边用吸水纸吸，让冰醋酸从盖玻片下流过直至细胞质颜色较浅而染色体着色明显清析为止。 4．制作永久片：要使片子能长期保存应用，可制成永久片。永久片的制作主要包括分片、脱 水透时和封片三个步骤。首先用培养皿（内置 U 型玻璃管或一根短玻棒）若干套编号，配制多级 脱水剂（常用脱水剂见附录二） 。 （1）分片：准备制成永久片，首先使其翻转让盖玻片朝下浸入第一级培养皿内分片。让载玻 片的一端搭在短玻棒上，另一端和皿底接触，使盖玻片自然脱落，并标记载玻片和盖玻片原来相 对应的方向和位置。 （2）脱水透明：用一端劈开的去磷头火柴棒夹住盖玻片（方向不变，材料朝上） ，放入第二 级培养皿中。而载玻片要翻转使有材料的一面朝上。然后依次逐级脱水，一般每级约 1～2 分钟。 如用第三种脱水剂每级约 20～30 秒钟。为了防止在脱水过程中细胞从片上脱落，在制片时可先在 盖玻片上涂一层蛋白甘油胶，在酒精灯上烘烤至冒出轻烟后，稍凉片刻盖在有材料的载玻片上。 （3）封片：片子从最后一级培养皿内取出后稍凉，于载玻片上原来加盖玻片的位置中间滴一 滴完整的加拿大树胶，然后翻转盖玻片（使有材料的一面朝下） ，按原来的方向和位置轻轻盖在树 胶上。要使盖玻片随着胶的扩展自然下沉，不要施加压力或移动盖玻片。然后平放在阴凉处晾干 再镜检。对于镜检符合要求的片子，在载玻片右端贴上标签，注明标本名称，制片日期。 [附]冷冻分片法： 这种方法快速简单。 对准备制作永久片的玻片， 先用液态二氧化碳干冰冷冻， 或用冰冻致冷器进行冷冻，待完全冷冻结冰后，用刀片将盖玻片同载玻片分开，将载玻片和盖玻 片放在 37℃左右的温箱内烘干。取出后放在二甲苯内浸泡 10～20 分钟，滴加树胶封片即可。
三、实验内容和实验步骤
1．取材：可在室内培养根尖，也可以直接从田间挖取刚长出的幼嫩根尖。室内培养的方法是： （1）圆葱和大蒜根尖：发根前先将圆葱以根部向上在光下晒两天，然后置于盛清水的小烧杯 口上， 使根茎部与水接触,或将圆葱半埋于湿沙内。 在 20～25℃光照条件下培养 2～3 天， 待根长 1～ 2cm 时，选健壮根自尖端约 1cm 处剪下备预处理用。大蒜作材料可先将蒜瓣扒去皮，然后用细铁