HbAc基础知识培训

数据统计于NCCL历年室间质评数据
1993 CAP Survey (Mean +/- 2sd)
%GHB
22.0
20.0
18.0
HbA1c
16.0
HbA1
14.0
Total
GHB
12.0
10.0
8.0
在DCCT和UKPD结果发表之前，美国有800个试验室在做A1c检测，CAP实验调查 显示在不同的实验室，用不同的检测方法得出的A1c结果存有巨大的差异。
方法学特异的干扰因素
▪ 血红蛋白变异体 (如.HbS, HbC， HbD, HbE) ▪ 血红蛋白衍生物 (乙酰化、甲酰化衍生物等)
长期服用阿斯匹林的病人，体内乙酰化Hb高，结果偏高 肾衰病人的氨甲酰基化，导致结果偏高 ▪ Schiff碱（A1c中间产物） 某些血糖浓度急剧变化的1型糖尿病人，Schiff碱升高， ▪ 胎儿血红蛋白HbF ▪ 严重的黄疸、高血脂
3. POCT方法的精确性不能满足临床要求，目前不能用于糖尿 病的诊断
中国三级医院的实验室检测情况
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
2008
2009
2010
2011
2012
2013
NGSP方法实验室 总实验室数
采用NGSP标准化方法的实验室占比81%
小结
▪ 影响HbA1c检测结果的非方法学特异的干扰因素 ▪ 影响HbA1c检测的方法学特异的干扰因素有哪些？ ▪ 变异体与A0没有分离开的情况下会导致检测结果偏高
还是偏低？为什么？ ▪ 变异体与A1c没有分离开的情况下会导致检测结果偏
高还是偏低？为什么？ ▪ 血红蛋白变异体会通过两个方面影响糖化血红蛋白，
例： ▪ A0后有变异体的糖尿
病人样本， ▪ HbF正常 ▪ G8标准模式试剂的检
测结果偏低1%
G8 Variant 模式试剂 （1.6分钟/test）
G8 标准模式试剂 （1.0分钟/test）
血红蛋白变异体与血糖监控
▪ 血红蛋白变异体会影响红细胞的寿命，红细胞的寿命 会影响糖化血红蛋白的生成
▪ 这些病人或许应该有不同的糖化血红蛋白的监控时间 或者改用其他指标来评估血糖
目的: 1. 糖化血红蛋白检测项目实现标准化 2. 以使各临床试验室的检测结果与DCCT的报告 结果具有可比性
( 该DCCT试验建立了平均血糖与糖尿病并发症的发病风险之间的关
系)
NGSP 程序
NGSP 网络
1
校准品
新鲜血
2
认证
(精密度与偏差)
新鲜血
3
能力比对测试
新鲜血
厂商 临床实验室
NGSP标准化对A1c检测的贡献 从无序到有序
NGSP Certified Not Certified
NGSP Certified
Not Certified
2008年调查显示2000多家CAP实验室间使用不同的检测方法的CVs在1.3-7.1% 之间，基于A1c检测结果已经能够有效的标准化
IFCC标准化
2002年IFCC发表文件， ▪ 正式推荐
Hb 血红蛋白
成人血红蛋白分三种 HbA为主要成人Hb
非糖化Hb HbA0
HbA (ß ß )
95%
HbA2 ()
1-3.5%
HbF ()
<2%
HbA1
糖化Hb
87-89%
6-8%
HbA1a
HbA1b
HbA1c
HbA1c是如何计算的？ A1c%=A1c/A0+HbA1
离子交换色谱所分离的组分解释 （非糖尿病样本）
缺点： 需要单独的检测设备 试剂成本较高 （操作人员对异常色谱图的辨别有一定的要求）
硼酸亲和色谱法
▪ 血红蛋白被糖化后，会产生一个特殊的顺式二糖醇基团， 该基团可与分析柱上的硼酸基团之间特异和可逆的结合；
▪ 而非糖化血红蛋白（A0）不与分析柱结合，最先被洗脱出 来
▪ 从而实现糖化成分与非糖化成分分离，检测物为总糖化血 红蛋白
HbA1c检测的参考方法为HPLC-MS(质谱)或HPLC-CE(毛细管电泳) ▪ 校准品为纯化的 HbAo 和 HbA1c 混合物，共 6 个浓度 ▪ 室内CV0.47～2.07%；室间CV1.35～2.27%
请详述。 ▪ 临床上对于有血红蛋白变异体的病人有什么建议？实
验室应该怎么满足临床的这一需求？
糖化血红蛋白实验室检测指南的要求
2013年中国糖尿病杂志8月刊
分析系统的要求
1. 测定方法要求溯源到IFCC参考方法，如NGSP认证方法
2.
（NGSP认证的有效期是1年）
3. 2. 实验室要知晓所选分析系统可能存在的干扰因素
变异体对HbA1c准确性的影 响
Ross J.Molinaro,Targeting HbA1c:standardization and clinical laboratory measurement. MLO Jan,2008,
血红蛋白变异体对HbA1c结果准确性的影响
▪ 对部分方法的检测结 果准确性有影响
离子交换HPLC检测原理
色谱图的横坐标是时间 ，纵坐标是信号强度， 反映Hb各分析峰浓度的
高低
被校准的峰 被阴影化
离子交换HPLC的特点
▪ 采用离子交换原理基于HPLC的平台 HPLC方法的试剂组成包括：分析柱、缓冲液、校准品 采用分析柱内填充的离子交换树脂作为固定相，树脂上面偶
联了带电荷基团 以可形成不同离子强度洗脱梯度的缓冲试剂作为流动相。 溯源性由试剂盒配套的校准品保证
分离效果的影响因素 ▪ 分析柱内的填充物（颗粒越小，分离效果越好，速度越慢） ▪ 分析柱柱长（越长，分离效果越好，速度越慢）
离子交换HPLC的优缺点
优点： 1.全自动 2.结果准确，可靠 分析物为HbA1c。 高分辨率方法可同时区分常见血红蛋白变异体，给临床
医生已额外的医疗提示 3. 精密度好 CV<3%
HbA1c定义
HbA1c: 葡萄糖与血红蛋白β链氨基酸末端的6个氨基酸结 合产生的一种特定的糖化血红蛋白
血红蛋白被糖化后，氨基酸末端所带负电荷会增加 HbA0：没有结合葡萄糖的血红蛋白β链氨基酸末端的6个氨
基酸 HbA1c以百分比表示，即以和葡萄糖结合的血红蛋白占全部
血红蛋白的比例 正常参考范围：4%-6%（NGSP/DCCT标化的方法）
胎儿血红蛋白在胎儿及出生6个月以内的新生儿体内为高浓度 ，6个月后基本降为成人水平
妇产科 HbA1c主要用于糖尿病妊娠的筛查
色谱图举例
• A0
• HbA1c • LA1c (希夫碱) 和氨甲基乙
酰化的 Hb • HbA1a & HbA1b HbA的次要组分
•总面积为 100万-500万 • A1c 结果
*Kohne E. Hemoglobinopathies: clinical manifestations, diagnosis, and treatment. 1. Dtsch Arztebl Int. 2011;108(31-32):532-540.
**河南省异常血红蛋白的调查与化学结构的分析研究,新乡医学院学报, 1988, (02) 9-12 ***中国丝绸之路地区血红蛋白病的遗传流行病学的特点，人类学学报，2001，V20
▪ HbA1c的结果是计算出来的
硼酸亲和HPLC的优缺点
▪ 优点： 仅区分糖化和非糖化，不受变异体的检测干扰
▪ 缺点： 非直接检测HbA1c，HbA1c存在计算错误的可能 胎儿血红蛋白高的病人结果偏低 血红蛋白变异体纯合子（如HbSS）的病人仍然报告 HbA1c 不能区分血红蛋白变异体，无法给临床以额外的信 息
小结
▪ 什么是HbA1c和HbA0？ ▪ A1c被糖化后什么电荷增加了？为什么糖化血红蛋白
在A0峰之前被洗脱下来？ ▪ 测量糖化血红蛋白为什么要先对样本溶血？ ▪ HbA1c是如何计算的？ ▪ 成人血红蛋白包括哪几种？ ▪ HbF是什么？浓度高时是否会对A1c造成干扰？为什么？ ▪ 伯乐的糖化试剂能报告HbF吗？为什么？ ▪ 糖化的血红蛋白包括哪几种？
HbA1c检测的标准化
▪ 美国从1996年起开展国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP），在HbA1c的 检测值一致性方面取得了巨大成功
▪ 在NGSP的中心实验室所采用的参考方法是 离子交换HPLC
▪ NGSP 由指导委员会和实验室网络组成。实验室网络包括一级中心参考实 验室（CPRL）、一级参考实验室（PRL）和二级参考实验室（SRL）
Hb的组成 HbA1a
% of Hb <1%
HbA1b HbF LA1c HbA1c HbA0
<1% <1% <1% 4~6% <90%
Hb与糖类的结合 HbA1与1,6-二磷酸果糖结合而成
丙酮酸与β链氨基末端缬氨酸结合而成 胎儿血红蛋白 血红蛋白形成HbA1c之前的中间产物 链氨基酸端与葡萄糖结合的产物 非糖化血红蛋白
%GHB
22.0
21.0 1993
20.0 19.0 18.0 17.0 16.0 15.0 14.0 13.0 12.0 11.0 10.0
9.0 8.0 7.0
CAP Survey: Mean +/- 2sd
1999
2001
2008
HbA1c
HbA1
Total GHB
DCC来自百度文库 Target
NGSP Certified Not Certified
HbA1c实验室检测干扰因素
常见检测干扰因素
非方法学特异的干扰因素
▪ 改变红细胞寿命的生理条件可影响 HbA1c结果
▪ 导致检测结果假性偏低
镰刀细胞性贫血和溶血性贫血 维他命 C和 E （抑制糖化作用）
▪ 导致检测结果假性偏高
铁缺乏性贫血，脾切除术后 真性红细胞增多症（高原地区）
▪ 妊娠期
Hb浓度偏低，HbA1c比正常人偏低
HbA1c实验室检测方法
常见的HbA1c检测方法
主要有三种检测方法:
1.离子交换高压液相色谱（HPLC）
直接分离HbA1c
2.硼酸亲和高压液相色谱
检测产物为总糖化血红蛋白
3. 免疫法
检测产物为HbA1c
各检测方法的精密度
方法 电泳 免疫法 低压液相色谱（LPLC） 高压液相色谱（HPLC）
精密度 + ++ +++ +++++
糖化血红蛋白-血红蛋白的糖基化产物
葡萄糖进入红细胞，在内部与血红蛋白发生反应
红细胞 葡萄糖 血红蛋白
糖化血红蛋白的生物合成过程（两步）
血红蛋白 葡萄糖
中间产物-LA1c Schiff碱
第一部：快速反应，生成不稳定A1c（LA1c） 第二步：缓慢反应，生成稳定的A1c（HbA1c）
HbA1c
糖化和非糖化的血红蛋白
血红蛋白变异体的发生率
全世界已经发现了超过一千种血红蛋白变异体 全球的血红蛋白变异体发生率的最新数据是7%*
▪ 非洲裔美国人：HbS 7.8%；HbC 2.3% ▪ 1988年,2.5‰ ,河南** ▪ 2001年,3.2 ‰ ,丝绸之路*** ▪ 云南：4% ▪ 云南省的阿昌族HbE的发病率为41.2%
小结
▪ 糖化血红蛋白的主要检测方法有什么？检测产物分别是什么？ ▪ HPLC的中文全称是什么？ ▪ HbA1c检测的金标准方法是？为什么？ ▪ 离子交换HPLC的检测原理是基于什么的不同？检测试剂应该包括哪些主要
的组分？ ▪ 分析柱中填充的是什么？上面偶联了什么？不同缓冲液的区别是什么？ ▪ 不同离子交换HPLC方法的分辨率一样吗？分辨率的关键影响因素是什么？ ▪ 糖化血红蛋白检测结果的溯源性由哪种试剂保证？ ▪ 伯乐糖化产品的色谱图横坐标是什么？纵坐标是什么？ ▪ 硼酸亲和色谱法的检测原理是基于什么？色谱图有几个峰？分别是什么？ ▪ 硼酸亲和色谱法是怎么检测HbA1c的？ ▪ 免疫法检测糖化血红蛋白的原理是基于什么反应？ ▪ 国产免疫法试剂的缺点有哪些？
各检测方法的分析物
HbA (22)
HbA1
HbA0
HHbbAA11离ba 子交换H色b谱A和1免c疫法检测物非糖化成分硼酸糖亲和化色成谱检分测物
离子交换HPLC
▪ 检测糖化血红蛋白HbA1c的金标准方法 DCCT研究中唯一所采用的HbA1c检测方法 NGSP标准化的参考方法
▪ 检测原理： 基于HbA1c 与其它血红蛋白组分所带电荷不同， 在一定的缓冲液离子强度下可与分析柱树脂表面 偶联的离子基团有不同程度的结合，从而将 HbA1c与其它组分(HbA1b, HbA1a,HbF,HbA0) 区 分开而得到分离。
免疫分析法
▪ 抗原抗体反应 ▪ 试剂有一种特有的凝集物导致抗体-乳胶的凝集，浊度增加 ▪ HbA1c与抗体-乳胶的结合对凝集物的凝集有抑制作用，浊度降
低
免疫分析法的特点
▪ 基于生化分析仪的平台（需要手工预处理样品） ▪ 精密度一般较差（CV%>5%） ▪ 只报HbA1c一个数值，不能检测血红蛋白变异体 ▪ 高血红蛋白F样本的HbA1c检测结果偏低 ▪ 严重的黄疸和高脂血影响比色结果 ▪ 国产糖化试剂的非标准化问题