分子生物学讲义

2 DNA与染色体

2.1 DNA的一般性质

2.2 DNA的二级结构及多态性

2.3 DNA的超螺旋结构

2.4 染色体结构

2.1 DNA的一般性质

1868年，瑞士的内科医生Friedrich Miescher从外科医院包扎伤口的绷带上的脓细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质(nuclein)；后来他又从鲑鱼精子中分离出类似的物质，并指出它是由一种碱性蛋白质与一种酸性物质组成的。20年后称为核酸(nucleic acids)，其功能不清楚。

1944年Avery等，发现从S型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化为S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关。若将DNA预先用DNA酶降解，转化就不发生。

结论是：S型菌的DNA将其遗传特性传给了R 型菌，DNA就是遗传物质。

1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用35S和32P双标记T2噬菌体证明DNA是遗传物质。噬菌体在35S 培养基中外壳蛋白被标记；在32P培养基中DNA被标记；这种双标记的噬菌体感染大肠杆菌时，DNA 进入细胞大量复制（只有亲本DNA链才有32P）并装配成子代颗粒，只有少量的噬菌体有32P，而无外壳有35S。

2.1.1 多核苷酸链

2.1.1.1 核酸的化学成分

核酸是生物体内的高分子化合物。它包括脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)和核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)两大类。

DNA和RNA是由单个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的。

RNA平均长度大约为2000个核苷酸；人DNA 可长达3×109个核苷酸。

核苷酸是由碱基、戊糖和磷酸构成。

碱基(base)：嘌呤(purine) ：腺嘌呤(adenine，A)、鸟嘌呤(guanine，G)；嘧啶(pyrimi-dine) ：胞嘧啶(cytosine，C)、胸腺嘧啶（thymine，T)、尿嘧啶(uracil，U)。

DNA中存在：A、T、G、C；

RNA中存在：A、U、G、C。

嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1是构成核苷酸时与核糖（或脱氧核糖）形成糖苷键的位置。核酸分子中还有数十种修饰碱基(themodified component)，又称稀有碱基，(unusual component)。是五种碱基环上的某一位置被一些化学基团（如甲基化、甲硫基化等）修饰后的衍生物。一般这些碱基在核酸中的含量稀少，在各种类型核酸中的分布也不均一。如DNA中的修饰碱基主要见于噬菌体DNA，RNA中以tRNA 含修饰碱基最多。

戊糖:RNA中的戊糖是D-核糖，DNA中的戊糖是D-2-脱氧核糖。D-核糖的C-2所连的羟基脱去氧就是D-2脱氧核糖。

戊糖C-1所连的羟基是与碱基形成糖苷键的基团，糖苷键的连接都是β-构型。

核苷（nucleoside)：由D-核糖或D-2脱氧核糖与嘌呤或嘧啶通过糖苷键连接组成的化合物。核酸中的主要核苷有8种。

核苷酸(nucleotide)：核苷与磷酸残基构成的化合物，即核苷的磷酸酯。

核苷酸是核酸分子的结构单元。核酸分子中的磷酸酯键是在戊糖C-3‘和C-5‘所连的羟基上形成的，构成核酸的核苷酸为3‘-核苷酸或5‘-核苷酸。DNA分子中是含有A、G、C、T四种碱基的脱氧核苷酸；RNA分子中则是含A、G、C、U四种碱基的核苷酸。核酸分子中的核苷酸都以多聚核苷酸形式存在，但在细胞内有多种游离的核苷酸，其中包括一磷酸核苷、二磷核苷和三磷酸核苷。

核苷酸分子中的主要化学成分为：碱基、戊糖、核苷、核苷酸。

2.1.1.2 核苷酸的连接方式

核酸是由多个核苷酸以3‘,5‘-磷酸二酯键聚合成的多聚核苷酸(poly nucleotide)，相邻二个核苷酸之间以3‘,5‘-磷酸二酯键连接。

寡核苷酸(oligonucleotide)：是指二至十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。三十甚至更多个核苷酸残基的多核苷酸分子也称作寡核苷酸。

寡核苷酸可由仪器自动合成，它可作为DNA合成的引物(primer)、基因探针(probe)等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。

核酸链的简写式：核酸分子的简写式可简明表示高度复杂的核酸分子。简写式表示的中心含义就是核酸分子的一级结构，即核酸分子中的核苷酸（或碱基）排列顺序。

字符式：用A、T、G、C、U代表碱基，用P代表磷酸残基。核酸分子中的糖基、糖苷键和酯键等均省略不写，将碱基和磷酸相间排列即可。因省略了糖基，故不再注解―脱氧‖与否，简写式中出现T的为DNA链，出现U则为RNA链。以5‘和3‘表示链的末端及方向，分别置于简写式的左右二端。

5’pApCpTpTpGpApApCpG3’ DNA

5’pApCpUpUpGpApApCpC3’ RNA

简化为：

5’pACTTGAACG3’DNA

5’pACUUGAACG3’RNA

简写式的5‘-末端均含有一个磷酸残基（与糖基的C-5‘位上的羟基相连），3‘-末端含有一个自由羟基（与糖基的C-3‘位相连），若5‘端不写P，则表示5‘-末端为自由羟基。双链DNA分子的简写式多采用省略了磷酸残基的写法，在上述简式的基础上再增加一条互补链（complentarystrand)即可，链间的配对碱基用短纵线相连或省略。

5’GGAATCTCAT3’

3’CCTTAGAGTA5’

线条式：在字符书写基础上，以垂线（位于碱基之下）和斜线（位于垂线与P之间）分别表示糖基和磷酸酯键。

2.1.2 DNA的一级结构

DNA的一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序，简称为DNA顺序（或序列）。由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故可称为碱基顺序。DNA 是巨大的生物高分子，如人的DNA就包含了3×10９碱基对，如此数目的碱基可容纳巨大的信息量。生物界里的遗传信息都包含在组成DNA的A、G、C、T 这四种核苷酸的排列顺序之中。

DNA分子中不同排列顺序的DNA区段构成特定的功能单位，这就是基因，不同基因的功能各异，各自分布在DNA的一定区域。基因的功能取决于DNA 的一级结构，要解释基因的生物学含义，就必须弄清DNA顺序。因此，DNA顺序测定是分子遗传学中一项既重要又基本的课题。

2.2 DNA的二级结构及多态性

2.2.1 DNA的双螺旋结构

2.2.1.1 双螺旋结构建立的依据

Watson和Crick在1953年以立体化学上的最适构型建立了一个与DNA X-射线衍射资料相符的分子模型——DNA双螺旋结构模型。它可在分子水平上阐述遗传(基因复制)的基本特征。

DNA双螺旋结构的主要依据：多核苷酸的特定序列是遗传信息所在。

Watson和Crick集各项DNA研究成果于一体，提出了双螺旋结构的模型。对建立DNA 双螺旋结构有直接影响的主要有两方面的依据：

Chatgaff对不同来源的DNA进行了碱基定量分析，得出了组成DNA的四种碱基的比例关系。Franklin和Wilkins用X-射线衍射方法获得的DNA 结构资料。

①1949-1951年Chatgaff应用紫外分光光度法和纸层析等技术，对不同来源的DNA进行碱基定量分析，得出组成DNA四种碱基的比例关系。

碱基组成的共同规律：不同来源的DNA中[A]=[T]、[C]=[G]；A+G=T+C 。

不同物种组织DNA在总的碱基组成上有很大的变化，表现在A+T/G+C比值的不同，但同种生物的不同组织DNA碱基组成相同。

②Rosalind Franklin和Wilkins用X-射线衍射方法获得的DNA结构资料。X-射线衍射技术是一种在原子水平上间接观测晶体物质的分子结构的方法(分辨率1 10-9m)。利用DNA纤维晶体得到精确反映DNA某些结构特征的X-射线衍射图片。

影像表明了DNA结构的螺旋周期性，碱基的空间取向等。

2.2.1.2 双螺旋结构特征

①主链(backbone)：脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接成反向平行的两条主链，它们绕一共同轴心向右盘旋形成双螺旋构型。主链处于螺旋的外则。

②碱基对(base pair)：碱基位于螺旋的内则，它们以垂直于螺旋轴的取向。同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对。A-T、G-C。间以氢键配对。

③大沟和小沟：大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间，而大沟位于相毗邻的双股之间。

大沟和小沟是从螺旋轴心到两条主链划分出的两个不等扇形形成的，这两条沟，特别是大沟对蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息非常重要，只有在沟内蛋白质才能识别到不同碱基顺序。

④结构参数：螺旋直径2nm；螺旋周期包含10bp；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距0.34nm。

2.2.1.3影响双螺旋结构的因素

①氢键碱基存在供氢体（氨基和羟基）以及受氢体（酮基和亚氨基），它们之间可形成氢键。

在双螺旋中嘧啶和嘌呤之间的距离正好与一般氢键的键长(0.27nm)相一致。且供体氢原子和受体原子处于一直线上，利于形成氢键。单个氢键是不稳定的，分子平均的键能仅2.5KJ/mol。因此，DNA双螺旋结构中的氢键处于不断的断裂和复合的热平衡状态，但由20个以上的碱基对组成的双螺旋在室温下已相当稳定。由于这个原因在设计PCR引物时，一般至少在16nt，以使其较为稳定，但最好在20～24个nt，以增加特异性。氢键的形成有助于DNA复制、修复、重组、转录、翻译，以及各种分子杂交等。G－C间有三个氢键，A－T间只有2个氢键。这可用DNA的熔解温度Tm与(G＋C)%含量成正比来证明。根据Marmur-Doty关系式，在(G+C)%含量在30%到70％的范围内，0.15 mol/L NaCl+0.0l5 mol/L柠檬酸钠溶液中：

Ｔm＝69.3十0.41(G十C)%

②碱基堆集力

碱基堆集力是同一条链中的相邻碱基之间的疏水作用力和Van der Waal力。DNA的主链部分是亲水的，碱基的外围基团—氨基和酮基也是亲水的，但嘧啶和嘌呤本身带有一定程度的疏水性。因此在水溶液中这些疏水基团自发聚集。从热力学的角度来看，DNA顷向于形成三维结构是有利于高溶性的磷酸基团与水的接触增加到最大限度，使碱基与水的接触减少到最小限度，从而使双螺旋内部相邻碱基相互聚集，形成双螺旋，这是形成碱基堆集力的因素之一。在双螺旋中相邻碱基对的间隔是0.34nm，而Van der waals力的半径（引力和斥力正好相平衡的距离）平均为0.17nm。van der waal力加强了疏水作用力。DNA链中的大量的嘌呤环和嘧啶环，其累积的van der waal力是相当可观的，是构成碱基堆积力的另一个重要因素。在碱基堆集中，处于DNA中间的碱基比两端的稳定，两端碱基越多中间的堆集力越大，因此，DNA双链两端（3～7bp）经常绽裂（fraying）。某些具有单链特异性的脱氧核糖核酸酶，如BAL31，同时又具有双链核酸外切酶的活性，大概就是由双链末端的绽裂作用造成的。