化妆品菌类检测剖析

化妆品中菌类的检测

一、菌落总数的检测

1.检测菌落总数的意义

菌落总数(aerob ic bac terial c ount)是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度、培养时间、p H值、需氧性质等)，1g(1m L)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。

测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。

2．操作步骤及检验结果

（1）检验步骤

①用灭菌吸管吸取1:10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。吸取2m L，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:10000，……等，每种稀释度应换1支吸管。

②将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h，为空白对照。

③为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100m L卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。

（2）菌落计数方法

先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。

（3）菌落计数及报告方法

①首先选取平均菌落数在30～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表1中例1)。

②若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表1中例2及例3)。

③若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例4)。

④若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1例5)。

⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300

个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例6)。

⑥若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每m L小于10CF U。

⑦菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见表1报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。

表1 菌落计数结果及报告方式

二、粪大肠杆菌的检测

1.检测粪大肠杆菌的意义

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示化妆品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。是重要的卫生指示菌。

2. 检测粪大肠杆菌的生化特性

粪大肠菌群为一群需氧及兼性厌氧的菌群，呈革兰氏阴性反应，能在普通培养基上生长繁殖。其生化活动能力较强，能发酵多种糖类，产酸产气，其特点是能较快发酵乳糖。

粪大肠菌群在乳糖培养基中于37℃下进行培养，在24h内能使乳糖发酵产酸，还有甲酸氢酶进行甲酸分解，生成氢气和二氧化碳，产生大量气体，这时，若加入伊红美蓝指示剂，分解乳糖所产生的酸(带正电荷)与伊红相染呈紫色且有金属光泽，故常用此特征来鉴定识别粪大肠菌群。将粪大肠菌群接种于蛋白胨水培养基中，于37℃培养24h，粪大肠菌群能分解培养基中蛋白质的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，当与试剂(对二甲基氨基苯甲醛)作用后，形成红色化合物-玫瑰靛基质(玫瑰吲哚)，此种反应在生化中称为吲哚反应。

3.检验操作及结果报告

（1）操作步骤

①取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24h～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。

②如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18 h～24 h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培养24h。

经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。

③挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。

④在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。

（2）检验结果报告

根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。

三、绿脓杆菌的检测

1．检测绿脓杆菌的意义

绿脓杆菌(Pseudomo nas aerugin osa)为革兰氏阴性细菌，属假单胞菌属。它在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力比其他细菌强，抗干燥的能力也强。

含水分较多的原料、化妆品易受其污染，绿脓杆菌对人类有致病力，常引起人体的眼、皮肤等处感染，特别是烧伤、烫伤及外伤患者感染上绿脓杆菌常使病情恶化，严重时可引起败血症，眼睛受伤感染后可使角膜溃疡并穿孑L，严重可致失明。目前，该菌已是防止医院感染和药品、化妆品及水等必须严加控制的重要病原菌之一。我国化妆品卫生标准规定：在化妆品中不得检出绿脓杆菌，因此，在化妆品中检测绿脓杆菌具有重要意义。

2．绿脓杆菌的生化特性

绿脓杆菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能在普通培养基上生长繁殖，为需氧及兼性厌氧类细菌。绿脓杆菌能代谢产生一种绿色的水溶性色素，使培养基变成绿色，受它而引起的化脓感染，脓液就常带绿色，因此而定名为绿脓杆菌。

绿脓杆菌可分解葡萄糖；对明胶具有液化、溶解作用；能还原硝酸，盐成为亚硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氢气；绿脓杆菌具有氧化酶(靛基氧化酶)能将试剂(盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺)氧化成红色的醌类化合物；还可在42℃的温度下生长繁殖。绿脓杆菌的这些生化特性常用来作为分离和鉴别它的方法。

3．检验操作及结果报告

(1)检验操作步骤

增菌培养：取1:10样品稀释液10m L加到90mL SCDL P液体培养基中，置37℃进行24h分离培养。该类培养基选择性强，大肠杆菌不能生长，革兰氏阳性菌生长完全受到抑制。观察培养基上所形成的菌落，典型绿脓杆菌菌落特征是菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩张有水溶性色素。

证实试验：

①染色镜检：取上述可疑为绿脓杆菌的菌落，进行革兰氏染色、镜检试验。