大豆磷脂中溶血磷脂酰胆碱含量测定方法研究

大豆磷脂中溶血磷脂酰胆碱含量测定方法研究

摘要：目的：采用HPLC法测定大豆磷脂中有关物质溶血性磷脂酰胆碱的含量。方法：采用C18色谱柱，以甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）为流动相，紫外检测器，进样量20μL。结果：大豆磷脂中主成分磷脂酰胆碱和溶血性磷脂酰胆碱能很好地分离检出，LPC线性浓度范围为2.3625μg/mL～189.0μg/mL；平均回收率98.05%，RDS为0.86%（n=6），溶血性磷脂酰胆碱的最低检测限为1.0ng，所含其它物质对检测无干扰。结论：该法准确、灵敏、快捷，可作为大豆磷脂中有关物质溶血性磷脂酰胆碱的测定方法。

关键词：大豆磷脂；溶血性磷脂酰胆碱；HPLC

大豆磷脂主要含有磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、胞苷二磷酸（CDP）等。在大豆磷脂原料的制备、纯化及其注射液的制备、贮藏过程中，均会有部分PC分解产生LPC，LPC具有溶血或溶解细胞膜作用，故对大豆磷酯中LPC含量需进行严格控制。目前，对大豆磷脂中杂质LPC含量测定的研究不太多，大多采用TLC和HPLC法。TLC法具有仪器设备简单价廉等优点，但操作烦琐。HPLC法虽具有快速、易于自动化等特点，但所用检测器多采用蒸发光散射检测器和质谱检测器，仪器价格昂贵。针对目前企业单位一般的液相配置的情况，为了快速、简便地测定大豆磷脂中的溶血磷脂酰胆碱，我们选择紫外检测器。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药

HP1100型高效液相色谱仪；PHS-2C型精密酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；Sartorius211型电子天平；UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）。

溶血磷脂酰胆碱（LPC）、磷脂酰胆碱（PC）对照品，Sigma公司；大豆磷脂（含磷脂酰胆碱量>90%），实验室自制；甲醇（色谱试剂）；乙腈（色谱试剂）。

1.2 色谱条件

HypersilC18色谱柱：150mn×4.6mn，流动相：甲醇-乙腈-水（50∶40∶10），柱温：室温，流速：1.0mL/min，进样量：20μL；紫外检测器；进样量20μL。

1.3 对照品溶液和样品溶液的配制

取样品约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得样品试液。取溶血磷脂酰胆碱对照品约10mg，精密称定，置100mL

量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即对照品溶液。吸取样品试液和对照品溶液各20μL进样，即得。

2 结果

2.1 色谱的定性与分离

以甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）为流动相，对大豆磷脂中的磷脂酰胆碱（PC）和溶血磷脂酰胆碱能达到较好的分离。本法理论板数按磷脂酰胆碱计为8562；磷脂酰胆碱与溶血磷脂酰胆碱的分离度为5.76，PC的保留时间为17min，LPC 保留时间约为22分钟。分离的色谱图见图1。

2.2 线性范围

精密称取溶血磷脂酰胆碱对照品10.50 mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶

解并稀释至刻度，作为预试液，分别吸取预试液适量，用甲醇稀释制成浓度为2.3625μg/mL，9.45μg/mL，23.625μg/mL，47.25μg/mL，94.5μg/mL，189.0μg/mL 的溶液，分别定量注入20μL，经HPLC法测得峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=4256.9X+3193.5，r=0.9999。结果显示，溶血磷脂酰胆碱在线性范围2.3625μg/mL～189.0μg/mL内，线性关系

良好。

2.3 精密度

精密称取溶血磷脂酰胆碱对照品9.12mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得对照品溶液，取此液连续进样5次，按峰面积计算精密度。测得平均峰面积为441169，RSD为0.1%。结果显示，进样精密度良好。

2.4 回收率实验

精密称取大豆磷脂样品约12.5mg于50mL量瓶中；再精密称取溶血磷脂酰胆碱对照品约20.0mg于50mL容量瓶中，制得一定浓度的对照A液，再精密量取对照A液5mL，加入其中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，作为对照回收液，按1.3项进行测定。再按此方法制得5个对照回收液，测定。见表1。

2.5 稳定性考察

取试验样品，照1.3项下的方法，制得样品液，在2~8℃放置，分别于0、2、4、6h进样检测，以峰面积的变化考察供试液的稳定性，RSD为0.97%，说明本检测方法的供试液在6h内稳定。见表2。

2.6 样品测定

精密吸取3个批号的样品溶液，另取LPC对照品溶液20μL，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的10%～15%；再分别取对照品溶液和样品溶液各20μL进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。结果，按外标法计算出3个批号样品中LPC占样品总量的0.56%，0.64%，0.63%。

3 讨论

（1）分别取PC和LPC对照品适量，在200nm~400nm范围进行波长扫描。确定有关物质LPC检测波长为205nm。此吸收波长短，会造成检测灵敏度不高，干扰严重，同时限制了流动相的选择。本实验中，参考相关文献资料，我们选择了条件Ⅰ：正己烷-异丙醇-冰醋酸-三乙胺（梯度洗脱）；条件Ⅱ：异丙醇-水-冰醋酸-三乙胺（梯度洗脱）；条件Ⅲ：异丙醇-正己烷-水，为流动相进行测试，结果表明：大豆磷脂主峰能与其它杂质峰有效分开，但杂质溶血磷脂酰胆碱与其它

杂质不能达到基线分离。调节酸碱性，对溶血磷脂酰胆碱与相邻杂质峰的分离度基本无影响。参照文献［1］中流动相的配比，采用甲醇-乙腈-水（50∶40∶10）为流动相检测，主峰保留时间约为17min，溶血磷脂酰胆碱与相邻杂质峰能达到基线分离。经过本法研究，对大豆磷脂样品（含PC量大于90%）中LPC含量测定，用本方法的条件测试，重现性较好，能满足实测要求。

（2）逐级稀释溶血磷脂酰胆碱对照液，测定溶血磷脂酰胆碱的峰高，同时测定相同条件下的色谱基线噪声，取基线噪声的10倍值作为溶血磷脂酰胆碱测定的定量限。本法测出溶血磷脂酰胆碱的定量限为1.0ng。

（3）在本文研究范围内，HPLC-UV法具有良好的线性关系、分析准确度和分析精密度。该法可方便地检测大豆磷脂中溶血磷脂酰胆碱的含量。

参考文献：

［1］卢学清，洪筱坤.HPLC法测定熊胆中磷脂类化合物PC、PI和PE的含量［J］.中成药，1999，21（7）：372-374.

［2］刘琳琳，张辉.大豆磷脂的开发与利用［J］.陕西科技大学学报，2004，22（4）：50-53.［3］王威，张彤.高效液相色谱_蒸发光散射检测器法对大豆磷脂原料药中各种成分的含量测定［J］.首都医药，2002（8）：49-50.

［4］蒋玲，陈亮.HPLC_ELSD法测定大豆磷脂注射液中有关物质［J］.药学进展，2007，31（8）：366-369.