嘌呤霉素筛选程序

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嘌呤霉素筛选程序

一、杀伤曲线

1. 在24 孔板内接种细胞,约3x104/孔,共11孔,培养过夜。

2. 第二天,观察细胞密度为20%-30%。稀释嘌呤霉素(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 µg/ml)至培养基, 每孔加入0.75m l培养基。

3. 每隔2天观察细胞的存活情况(贴壁细胞飘起即为死亡,悬浮细胞,可以通过观察细胞的膜情况来判断,死亡细胞的细胞膜较为粗糙,有皱褶,没光泽,准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准),每隔2天更换0.75m l含相应浓度嘌呤霉素的培养基。

4. 筛选4-7天内使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度,即为杀伤浓度(筛选浓度);

二、细胞筛选

1.转染(24孔板进行)或电转后培养24小时,按10%密度传代(传至35mm

平皿),继续培养24小时,待细胞密度增至20%~25%汇合时;

2.去掉培养液,PBS洗一次,加入按最佳筛选浓度(杀伤曲线实验确定)配制

好的嘌呤霉素筛选培养基2-3ml。

3.根据培养基的颜色和细胞的存活情况,每隔2天更换一次筛选培养基(培养

基用量为2-4ml,细胞多,多加培养基,细胞少,少加培养基), 一般在3-4天内出现细胞大量或少量死亡情况(如果转染效率或电转效率高,则死亡少;

如果转染效率或电转效率低,则死亡多;如果筛选浓度偏低,筛选培养基用量少,细胞密度大于80%,会导致大量假阳性克隆)。如果筛选第一周,出现细胞大量死亡,则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周;如果

筛选第一周,出现细胞少量死亡,则把细胞按10%密度传代(传至35mm平皿,传一个皿即可,多余细胞丢弃),利用筛选培养基进行筛选一周;

4.筛选第二周结束后,则把细胞消化下来,进行终点稀释(10ul培养基中含1

个细胞,用筛选培养基),把上述10ul细胞悬液加入96孔板中(提前加入40ul 筛选培养基),一共加24孔,4小时后观察每个孔的情况,记录只含一个细胞的孔,含有一个细胞的孔用于继续筛选,其余孔舍弃;

5.根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基,待细胞密度为80%

时,将其传代至24孔板中增殖,待细胞密度为80%时,将其传代至6孔板中增殖,待细胞密度为80%时,将其传代至T25瓶(一传3)中增殖, 每隔3天换液。

6.细胞大量扩增后,一瓶用于提取总RNA进行QPCR检测,一瓶用于总蛋白

进行WB检测,另一瓶用于保种,根据QPCR和WB结果取舍阳性克隆;

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