内含肽原理-NEB
内含肽分离原理
内含肽分离原理
内含肽（intein）的分离原理基于其自切割特性。
内含肽能够在蛋白质中自行剪切，实现目标蛋白与亲和标签的分离。
通过基因工程技术，可以将亲和标签、内含肽及目标蛋白的基因序列连接在一起，在合适的宿主系统中表达出一个标签-内含肽-目标蛋白的三联体。
当这个“三元”融合蛋白复合物流经结合有几丁质的亲和纯化柱时，固定在树脂上的配体会吸附三联体的标签，从而截留融合蛋白。
随后，在某些简单的理化因素作用下（如pH、温度的变化或者巯基化合物的加入），该三联体从内含肽的N端或者C端发生自切割，释放目标蛋白。
而内含肽与CBD 的复合物会结合在亲和纯化柱上，使目的蛋白直接被洗脱下来。
以上内容仅供参考，建议查阅关于内含肽的文献或者咨询生物学家，以获取更准确的信息。
原核表达困难解决
原核表达：遇到瓶颈怎么办我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。
一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。
在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。
Marker用于判断条带大小，标准品用于判断Western体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及精确判断大小；空白载体（诱导）负对照有助于判断在非诱导条件下的本底表达；而重组载体（不诱导）负对照则有助于判断诱导的效果以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰，或者是区分细菌内源和外源表达产物——偷懒可不是好习惯，会影响结果判断。
注意，接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4℃保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。
反正就是一种经验做法。
跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做Western了。
银染的灵敏度在0.1～1 ng；有钱还可以用Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western。
WesternBlot是蛋白质定性和半定量的最通用的技术，具体细节可参考生物通WesternBlot技术专题，我们有详细介绍的。
在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要开始进行下一步的分析了。
首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。
有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别是用到XbaI之类的酶要小心。
NEB常用酶介绍
NEB常用酶介绍NEB（New England Biolabs）是一家生物技术公司，专注于酶和相关试剂的研发和生产。
该公司开发了许多常用酶，其中一些被广泛应用于分子生物学和生物技术领域。
下面是一些常见的NEB酶的介绍。
1. 限制性内切酶（Restriction Enzymes）：限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在特定位点切割DNA的酶。
NEB生产了许多常见的限制性内切酶，如EcoRI、HindIII、BamHI等。
这些酶在DNA分析、克隆以及基因组工程等领域中广泛应用。
2. DNA连接酶（DNA Ligases）：DNA连接酶能够将两条DNA分子连接起来，形成一个连续的DNA链。
NEB提供了多种DNA连接酶，如T4 DNA连接酶、Quick DNA连接酶等。
这些酶在DNA克隆和结构修复等实验中起到至关重要的作用。
3. 反转录酶（Reverse Transcriptases）：反转录酶能够将RNA模板逆转录合成DNA，从而产生相应的cDNA。
NEB开发了多种反转录酶，如M-MuLV反转录酶、AMV反转录酶等。
这些酶广泛应用于转录组学、基因表达研究以及RT-PCR等实验中。
4. 核酸聚合酶（DNA Polymerases）：核酸聚合酶是一类能够在DNA合成过程中将新的核苷酸单元加入到已存在的DNA链上的酶。
NEB提供了多种高质量的核酸聚合酶，如Phusion DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶等。
这些酶在PCR、DNA扩增和DNA测序等实验中被广泛使用。
5. 电泳酶（Nucleases）：电泳酶能够在DNA或RNA的特定位置切割核酸链。
NEB生产的电泳酶包括RNase A等。
这些酶广泛应用于核酸纯化、RNA降解实验以及电泳分析中。
6. 磷酸二酯酶（Phosphatases）：磷酸二酯酶能够催化磷酸二酯键的水解反应，从而使DNA或RNA失去3'末端的磷酸基团。
NEB提供了多种磷酸二酯酶，如CIP碱性磷酸酯酶等。
常用蛋白酶切割位点
LifeSensors
Ni-NTA (6His recomb. enzyme)
Kex-2
-Arg-X-Lys/Arg-Arg▼
Invitrogen – Life Technologies,
Ni-NTA (6His recomb. enzyme)
?Ni-NTA (6His recomb. TEV)
PreScission（PreScission蛋白酶）
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln▼Gly-Pro
L-E-V-L-F-Q▼G-P
Amersham-Biosciences
GSTrap for GST fusion enzyme
TAGZyme（标记酶）
Factor Xa（Xa因子）
Ile-Glu/Asp-Gly-Arg▼?
I-E/D-G-R▼
Amersham-Biosciences,
New England Biolabs,
Roche
Benzamidine-Agarose
Enterokinase（肠激酶）
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys▼
D-D-D-D-K▼
His-tag removal by Exoproteolytic Digestion
Qiagen
Ni-NTA (6His recomb. enzyme)
Intein Site（内含肽）
dithiothreitol cleavage（二硫苏糖醇清除）
New England BiolabsDTT eliminati源自n by dialysis?（透析）
常用融合蛋白切割位点
PROTEASE
NEB产品知识和市场(ppt)-NEB产品知识和市场
分子量标准
DNA分子量标准
NE
2-log DNA Ladder
常用类型：整数分子量的 Marker
W
1kb DNA Ladder 100bp DNA Ladder
DNA分子量标准
噬菌体DNA和质粒DNA 酶消化型的DNA分子量标准 非整数型的
DNA分子量标准 PGF 分子量标准
13402 7857
15747 7056
15218 13454
4997
8091
April
May
June
July
2000
2001
NEB2000年度月销售统计
NEB
40,000.00 30,000.00 20,000.00 10,000.00
0.00 April-00 June-0A0ugust-O0c0toberD-e0c0emberF-e0b0ruary-01
针对于常用在克隆实验中的酶 检验过量酶切对DNA末端的完整性是否有破坏
目录书中出现的标志符号的含义
DNA限制性内切酶
NEB自主克隆的酶基因 从重组菌株中提纯的酶
最佳的工具酶反应温度
随酶另附一管BSA
酶所对应的缓冲液编号
酶识别位点被dam或dcm甲基化后不能被切动
酶是否耐热
经过蓝白斑法检测
DNA限制性内切酶 小常识： Homing 核酸内切酶 识别12-40碱基的长的、对称识别位点的稀有内切酶 ❖ 同裂酶的概念 识别同一酶切位点的一组内切酶 ❖ BSA的作用 酶保护剂，在反应中保证酶具有最佳的活性
目前的小酶库存
ECOR I Msp I SnaB I PST I BGI II Pvu II SAU3A I STU I ECOR V T4 DNA Ligase Mung Bean Nuclease Vent (exo-) Mse I
氨基末端b型利钠肽
氨基末端b型利钠肽1.引言1.1 概述概述部分的内容大致如下：氨基末端b型利钠肽，也称作ANP（Atrial Natriuretic Peptide），是一种重要的内源性多肽激素。
它主要由心房分泌，并在体内发挥广泛的生理功能，特别是在调节血压和体液平衡方面具有重要作用。
ANP通过与身体中的利钠激素受体结合，调节肾脏排钠排液，导致体液体积减少、血管扩张和血压降低。
因此，ANP不仅在心血管疾病的研究中备受关注，而且在肾脏疾病、高血压和心力衰竭等多种疾病的治疗中也显示出巨大的潜力。
随着对ANP的研究逐渐深入，人们对其氨基末端b型利钠肽的各个方面进行了广泛的探索。
研究发现，氨基末端b型利钠肽可以通过多种途径发挥作用，包括通过cGMP介导的信号转导通路、通过改变心血管系统的活性物质水平以及通过调节离子通道的活性等。
此外，氨基末端b型利钠肽还与其他激素和细胞因子相互作用，形成复杂的调控网络。
尽管氨基末端b型利钠肽的生理学功能已经得到了初步认识，但仍然存在许多未解之谜。
例如，尚不清楚氨基末端b型利钠肽在不同生理和病理状态下的表达和分泌规律，以及在治疗上的潜力如何得到最大发挥等。
因此，进一步研究氨基末端b型利钠肽的生物学功能和作用机制，将有助于深入了解其在健康和疾病中的作用，并为相关疾病的预防和治疗提供新的思路和方法。
本文将对氨基末端b型利钠肽的相关研究进行综述，包括其生物合成和分泌、受体与信号转导机制、生理功能及其在药物研发中的应用等方面的内容。
通过对现有研究的总结和分析，我们期望能够为氨基末端b型利钠肽的进一步研究提供一定的参考和理论基础，同时也希望能够促进其在临床上的应用和开发出更好的药物治疗策略。
1.2文章结构文章结构本文将按照以下结构进行阐述和讨论氨基末端b型利钠肽的相关内容：1. 引言部分将提供对氨基末端b型利钠肽的概述和介绍。
首先，将介绍氨基末端b型利钠肽的基本概念和定义，以及其在生物体内的作用和重要性。
表达载体
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
双质粒系统
一 个 质 粒 带 有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带 有 T7 启动子和目的基因
两个质粒的复制子和抗 性标记不能相同，调控方式 为控制 T7 RNA 聚合酶的启 动子调控类型
ColE1 ori
AmpR
T7 启动子
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四、 表达产物的纯化
1、包涵体蛋白的纯化
通过机械法、超声波处理等方法破碎外源蛋白的细胞 → 离心 → 获得包涵体 → 洗涤 → 去除包涵体结合的 细胞蛋白→ 利用盐酸胍、尿素和SDS等溶解包涵体 → 蛋白质重新折叠
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2、可溶性蛋白的纯化
融合蛋白的表达标签可用于分离纯化目的蛋白
分泌表达载体也有助于分离纯化可溶性的表达产 物。
阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。 T7噬菌体启动子：较复杂
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二、利用T7噬菌体启动子的表达载体
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强 的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建 的表达系统称为 T7 表达系统。
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T7 表达系统
T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活 T7噬菌体启动子的转录。
，是构建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
2
3、转录的有效延伸和终止 外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何
保证mRNA有效地延伸、终止。 转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。
措施： （1）除去衰减子 （2）插入抗转录终止序列 （3）强转录终止序列
3
4、有效的翻译起始（关键因素） 原核：SD序列，能帮助从起始AUG处开始翻译。 真核：kozak（科扎克）序列，核糖体能够识别
几丁质亲和层析纯化蛋白的方法改良
几丁质亲和层析纯化蛋白的方法改良齐齐晗尔医学院2008年第29卷第4期几丁质亲和层析纯化蛋白的方法改良张可勇刘兴汉赵炜明【摘要】目的探索亲和层析的方法,采用有效的方法提高几丁质树脂的使用效力和使用次数,降低成产成本使之更有利于提高产量.方法考察几丁质纯化的过程.探索出如何提高几丁质珠的重复使用次数,寻找出适合工业生产的纯化步骤结果用高浓度的碱液进行洗枉,并延长浸泡时间到1h,可以使几丁质珠使用次数由原来的4～5次增加到7～8次.结论实验结果证实采用提高碱液浓度并延长浸泡时问可以增加几丁质树脂的使用次数,有利于指导实验室实验和药物开发.【关键词】蛋白质纯化亲和层析凡丁质ChitinaseproteinpurifiedbyaffinitychromatographymethodsimprovedZHANGKe——yong,eta1.(DepartmentofBiochemiatryandMolecularBiology,HarbinMedicalUniversity,ttarbin,H eilorl卣iang150086China)[Abstract]0bjectiveExploreaffinitychromatographymethod,theadoptionofeffectivemea nsto enhancechitinresineffectivenessandtheuseoffrequencyofuse,lower—costproductiontomakeitmoreconducivetoraisingoutput.MethodsInvestigationchitinpurificationprocess,andexpl orehowtoimprovethechitinbeadsrepetitionfrequencyofuse,findingsuitableindustrialproductionandpurifica—tionsteps.ResultsWithahighconcentrationofcausticwashingcolumn.andtheextensionofi mmer—siontimetolh,canmakeuseofchitinbeadsfrom4—5timesthenumberincreasedto7～8times.Con-clusions,l,heexperimentalresultsconfirmedusinglyeimproveconcentrationandtheextensi onofim—mersiontimechitincanincreasethefrequencyofuseresin,toguidethelaboratoryexperiment sanddrugdevelopment.[Keywords]ProteinpurificationChromatographyChitinase蛋白的纯化离不开层析.层析通常用于蛋白的后期纯化过程中,包括离子交换层析,凝胶层析(分子筛),亲和层析.前两种成本低但效果不理想,不同程度造成目的蛋白的损失和杂蛋白的混人,甚至使目的蛋白稀释,活性降低等.亲和层析由于目的蛋白与层析介质问能发生特异性结合,可以去除所有的杂蛋白,只保留目的蛋白,特异性高.小分子多肽由于分子量小,在纯化过程中极易丢失,所以亲和层析尤其适合以融合形式表达的小分子多肽的纯化.内含肽介导的纯化系统由NEB公司建立,可以仅用一步亲和层析从融合蛋白中纯化出目的蛋白j】.我室前期构建的多种工程菌表达的均采用TYB类质粒载体.由该载体转化的工程菌表达的融合蛋白含有几丁质结合域和内含肽两部分功能元件.几丁质结合域可与几丁质树脂紧密结合,这样目的蛋白,内含肽和几丁质结合蛋白在一起以融合蛋白形式表达.内含肽足一种自剪接元件,一端与几丁质结合蛋白构成载体蛋白,另一端与目的多肽相结合,当含有巯基的化合物(DTT.8一巯基乙醇)存在时,内含肽与目的多肽间肽键断裂,经缓冲液洗脱而得到目的多肽,而载体蛋白仍吸附在几丁作者单位:哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室:作地址:齐齐哈尔医学院邮编150086收稿日期2008—01～17质柱上.然后,用碱液洗脱将几丁质结合蛋白释放,从而实现柱的再生.但传统的方法柱的再生只能重复使用4～5次,由于树脂的成本较高,如何提高几丁质柱的使用次数使几丁质使用效力最大化是限制其临床应用及产业化开发的重要因素.1材料与方法1.1材料1.1.1菌种本实验室前期构建的内皮抑素(en—dostatin,ES)抗肿瘤相关的3O肽_4.1.1.2试剂酵母提取物,胰蛋白胨(TaKaRa),异丙基硫代8一D一半乳糖苷(IpTG,TakaRa),二硫苏糖醇(DTT),考马斯亮蓝G250(TaKaRa),考马斯亮蓝R250(TaKaRa),Tris(Sigma),甘氨酸(Prorna—ga),溴酚兰(Promaga),几丁质亲和树脂(Chitinbeads,NEB),HEPES(TaKaRa),-f二烷基硫酸钠(SDS)EDTA,甲叉双丙烯酰胺(Sigma),过硫酸铵,丙烯酰胺,其它试剂均为国产分析纯.1.2实验方法1.2.1几丁质结合使用效力的测定挑取平板上3O肽基因工程表达菌的单菌落至20ml含氨苄青霉素(100tLg/m1)的IB培养基中,37℃,110r/min振荡过夜.次日,按1:50比例将前一日培养的菌液接种于1000ml含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡培养至A∞一0.5时加入IPTG终浓度为0.5mmol/L,28℃诱导表达6h,将菌液5000r/min, 4℃,离心10min,收集菌体沉淀,称量菌体湿重(3.5 克).将菌体沉淀加入裂解液,超声波细胞粉碎仪进行裂解,400Hz,工作2s,间歇4s,共用时50min.裂解的菌液12000r/rain,4℃,离心15min,取上清.以略超载的菌体上清量上样.获得目的多肽的同时,记录几丁质使用次数与0.3mol/LnaOH洗脱载体蛋白风高度的关系,保持记录器灵敏度及基线刻度不变. 1.2.2几丁质再生使用次数的测定分别取四支儿丁质层析柱各加入lml几丁质珠,每支几丁质柱用最大承载的工程菌量上样.第一支儿丁质柱样结束后用1.5ml的微量离心管(eppendorf)取样备用.第二支几丁质柱反复上样4次,每次在进行洗柱的过程中用至少l0倍柱床体积的0.3mol/ LNaOH洗柱,此时出现的峰即是载体蛋白峰(内含肽一几丁质结合蛋白),继续洗脱,待基线平稳后,用20倍柱床体积的水洗柱除去柱内的NaOtt,再用3倍柱床体积的缓冲液进行柱平衡.在进行第五次上样结束后用1.5ml的微量离心管(eppendorf)取样备用.第三支几丁质柱同样进行反复上样7次,每次在进行洗柱的时加大NaOH的浓度,延长洗脱时间.每次用l0倍柱床体积的0.5mol/INa()H进行洗柱,待基线平稳后,将几丁质柱上下接口对接,让NaOH在几丁质注中浸泡lh有效的去除载体蛋白.然后用20倍柱床体积的水洗柱除去柱内的NaOH,再用3倍柱床体积的缓冲液进行柱平衡.在进行第八次上样结束后用1.5ml的微量离心管(eppendorf)取样备用.同样用0.5mol/LNaOH进行洗柱,待基线平稳后,将几丁质柱上下接口对接.让NaOH在几丁质注中浸泡1h有效的去除载体蛋白.然后用2o倍柱床体积的水洗柱除去柱内的NaOH,再用3倍柱床体积的缓冲液进行柱平衡.进行第九次上样,上样结束后用1.5ml的微量离心管(eppendorf)取样备用.分别将留取的四个样品进行SDS—PAGE电泳.浓缩胶为5,分离胶为12的SDS—PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,取1O.ul的样品加入4O肚l的凝胶上样缓冲液,混匀,煮沸5min,瞬时离心,将2oj上1的样品混合液上样.浓缩胶采用80V电压,分离胶采用120V电压,电泳待溴芬兰接近电泳槽底部时卸下胶[】.考马斯亮蓝R一250染色过夜后用脱色液进行脱色,观察判定结果.2结果2.1几丁质结合使用效力的测定结果利用同一组1ml几丁质树脂进行重复试验,获得几丁质柱复性峰样(图1).由于复性时间不均等,峰高存在不规律性. JournalofQiqiharMedicalCollege,2008,V o1.29.No.41,2再生时间4O分钟;3,4,8,1O再生时间6O分钟;5,7,9再生时间30分钟;6再生时间50分钟.峰高直接显示瞬时载体蛋白浓度. 峰宽与液体流速有关,与蛋白■无关.图1同一组3ml几丁质树脂使用次数,再生时间与结台载体蛋白■关系图.图示续号为几丁质树脂使用次数2.2几丁质再生使用次数的测定结果将述四个样品连同上样液进行SDS—PAGE电泳,如图2显示,四条条带均未出现融合蛋白条带,说明经过上述处理,用0.5mol/INa0H进行洗柱,浸泡lh后能有效的去除载体蛋白.能最大限度的提高几丁质柱的使用次数.12341.第一支几】质柱;2.第二支几丁质柱(使用五次);3.第三支几丁质柱(使用八次);4.第四支几丁质柱(使用九次) 图2几丁质再生使用次数测定结果3讨论3.1几丁质结合使用效力的测定在几丁质结合效力测定过程中,采用1O轮亲和再生验证(图1所示),结果证明使用次数对柱子的结合力影响并不明显.另外,可看载体峰高与浸泡时间成正比关系,再生时.浸泡1小时能有效的去除载体蛋白.而浸泡时间不足,造成再生不充分,将使大量无效载体蛋白占据结合位点,影响柱子的结合效力,不利于下一轮结合,降低了蛋白产量.3.2几丁质再生使用次数的测定在几丁质再生使用次数的测定过程中,四个样品进行SDS—PAGE电泳(如图2所示),结果证明采用高铱度的Na()H,由0.3mol/L提高到0.5mol/L,并增加浸泡时问1h能更有效的去除载体蛋白.此外,由于目的蛋自裂解效力很难达到百分之百,为防止其他蛋白污染.建议同一根柱子不要用于不同蛋白的纯化.向时建议几丁质柱使用次数不要超过8次,因为经过多次的使用,几丁质柱难免会受到污染.通过本实验初步证实了几丁质树脂可重复利用齐齐喻尔医学院2008年第29卷第4期粘着斑激酶在喉及下咽鳞状细胞癌组织芯片中的表达及意义姜洪波肖玉丽鲁建光陈伟刚【摘要】目的应用组织芯片免疫组化技术探讨粘着斑激酶(FAK)表达与喉和下咽鳞状细胞癌生物学行为的相关性.方法设计制作喉及下咽鳞状细胞癌组织芯片,应用免疫组化技术在组织芯片上检测FAK的表达,分析FAK表达与喉及下咽鳞状细胞癌临床和病理分期的相关性.结果FAK在原发癌中的阳性表达率为96.Oof72/75),明显高于癌旁正常组织(13,/29,44.83,P<0.01);淋巴结转移癌中FAK的阳性表达率为1oo.oo(20/20),明显高于癌旁正常组织(P<0.001);有淋巴结转移组FAK表达率为95.35(41/43).明显高于无淋巴结转移组(12/32,37.50,P<0.01);高分化组FAK表达率明显低于中,低分化组(P<o.001);而FAK的表达率与肿瘤的原发部位,浸润范围(T分期),年龄和性别等因素均无明显相关性(P>0.05).结论FAK在喉癌和下咽癌组织中高表达,其表达率与喉癌和下咽癌的分化程度和淋巴结转移有关,可作为临床预测喉癌和下咽癌颈淋巴结转移趋势和估计预后的主要参考指标之一.【关键词】喉肿瘤癌鳞状细胞下咽肿瘤抗原粘着斑激酶Expressionandsignificanceoffocaladhesionkinase(FAK)intissuemicroarrayoflaryngeal andhypopha'ryngealsquamouscellcarcinomaJlANGHong一.eta1.(ENT,FirstHospital,Qiqihar,Hei' lOilgJiang161005China)[Abstract]Objective7"oinvestigatetheexpressionofthefocaladhesionkinase(FAK)inlary n—gemandhypopharyngealsquamouscellcarcinomasandanalyzetherelationshipbetweenFA Kexpression andbiologicalbehaviorofthiscancerbyusingtheimmunohistochemistryintissuemicroarra y.MethodsWedesignedandmadeatissuemicroarrayoflaryngealandhypopharyngealsquam ouscellcar—cinoma(SCC).andinvestigatedtheexpressionofFAKinSCCofthelarynxandhypopharynx byimmu—nohistochemistryinthetissuenficroarray,thenanalyzedtheclinicalsignificanceofFAKexpr essioninthiscancer.ResultsInprimarycancertissue,theexpressionrateofFAKwas58.67(44/75),sig nifi—cantlyhigherthannormaltissue(34.48,lo/29,P<o.05);FAKexpressionrateinlymphnode meta—staticcarcinomais95.00(19,20),obviouslyhigherthannormaltissue(P<0.001)andprima rycane—ertissue(P<0.01);FAKexpressionraleofthegroupwithlymphnodemetastasisishigherth angroupwithoutlymphnodemetastasis(P<0.05);theexpressionrateofthewell～differentiatedgroupwas higherthanmoderatelyandpoorlydifferentiatedgroup(P<0.001).ConclusionsFAKisov erexpres—sioninSCCoflarynxandhypopharynx,theexpressionrateisconcernedwithdegreeofcelldif ferentia—tionandmetastasisoflymphnode,itmaybecomeapredictindexofmetastasisandprognosiso fthela—ryngealandhypopharyngealsquamouscellcarcinoma.【Kcyords]Laryngealneop[asmsCarcinomasq,lalllOUScellhypopharyngealneoplasms An?tigensFAK粘着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)是一种非受体酪氨酸激酶,在肿瘤的增殖,生存,迁移,埕作者单位;黑龙江省齐齐哈尔市第一医院耳鼻咽喉科(姜洪波,陈伟)哈尔滨医科大学附属第::医院耳'鼻咽喉一头颈外科(肖玉丽,鲁趱光)通讯作者:鲁建光哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻咽喉一头颈外科邮编161005收稿一期2008 (0113)393?袭,转移和血管生成等生物行为中起着重要的调控作用【.研究发现,FAK在多种上皮及间充质源的肿瘤中高表达或过度激活,参与肿瘤的发生,发展和侵袭转移.作为一种细胞粘附分子,FAK及其变异体在肿瘤的发生,发展和转移过程中所起的作用被引起广泛重视.喉和下咽鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤.严重威胁着人类的健康.本研究应用多次而结合效力不会明显下降,通过提高碱液的浓良能增加柱子的使用次数,在一定程度上降低了药物生产的成本,为利朋基因工程技术从事小分子多肽新药的生产提供了技术借鉴,具有一定的实践意义.一i-9—]E33参考文献[4]r1]O'ReillyMS.BoehmT,ShingY,eta1.Endostatin:ai1enck)g—enousinhibitorofanglogenesisandtumorgrowth[J].Cel1.1997,88(2):27_,_一285骆成玉,赵丹宁,李世拥,等.内皮抑素对结肠癌肝转移的干预作用EJ].中华外科杂志,2001,39(3):188—200黄培堂译.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2002: l564一l594朱厚础译.蛋白质纯化与鉴定实验指南[M].北京:科学出版社,2000:l4l—l92。
内源性生物活性肽的名词解释
内源性生物活性肽的名词解释内源性生物活性肽是由我们自身体内产生的一类生物活性分子，这些分子在人体内起着重要的调控作用。
内源性活性肽通常由氨基酸链构成，能够与细胞表面的受体结合，并通过激活受体来传递信号，调节生物过程。
1. 产生与功能内源性生物活性肽是由细胞内的酶切或剪接作用形成的。
它们具有多种功能，包括调节神经递质的释放、免疫系统的调节、细胞增殖和凋亡的调控等。
举例来说，内源性生物活性肽中的一种叫做内啡肽，能够与神经元表面的受体结合，并模拟与吗啡类似的镇痛效果。
2. 作用机制内源性生物活性肽的作用机制通常是通过与细胞表面的特定受体结合，使得受体发生构象变化，从而激活下游信号传导通路。
这种信号传导可以触发细胞内的一系列生理反应，例如改变细胞内钙离子浓度、激活蛋白激酶等。
由于具有高选择性和高亲和力，内源性生物活性肽的作用通常非常具体，能够精准地调控目标细胞或组织的功能。
3. 分类与代表性肽内源性生物活性肽的种类繁多，根据其结构和功能特点，可以将其划分为不同的类别。
例如，某些肽能够促进血管扩张和血压降低，被称为血管活性肽，其中代表性的肽包括血管紧张素和钠尿肽。
另一类肽则被称为免疫活性肽，包括肽激素、细胞因子等，它们在免疫反应中发挥重要作用。
4. 应用前景由于内源性生物活性肽在调控生理过程中的重要作用，研究人员对其应用前景非常乐观。
例如，利用血管活性肽已经开发出降压药物，用于治疗高血压。
同时，内源性生物活性肽还有潜力用于癌症治疗、抗炎治疗等。
此外，一些人工合成的活性肽正在研究中，以期能够扩展其生物活性和应用范围。
5. 挑战与展望尽管内源性生物活性肽具有巨大的潜力，但其在应用过程中面临一些挑战。
例如，生物活性肽的稳定性和制剂的传递问题需要解决。
此外，一些活性肽的副作用也需要进行深入研究。
未来的发展方向包括寻找更加稳定的活性肽和改进活性肽的传递方式，以及深入研究其副作用和安全性。
总结起来，内源性生物活性肽是由自身产生的具有重要调控作用的生物分子。
内含肽
内含肽生物体本身就是一个神秘而精密地高效运作的机器。
大到各系统之间，小到每个细胞，无一不展示着生命的神奇，他们之间的配合是那样的天衣无缝。
继内含子的自我剪接功能发现之后，第一个内含肽——命名为Sce VMA1 发现了，它的发现使内含肽陆续在各种生物中发现，它们在单细胞真核生物、真细菌、古细菌、噬菌体和病毒的基因组中均有分布. 自我剪接机制的发现为蛋白质工程提供方便，尤其是对蛋白质的提纯方面，是一个开创性的突破。
与传统的蛋白质提纯相比存在许多优势，成本低而且快捷。
下面对内含肽的结构与功能做一些简单的介绍。
1内含肽的性质1.1内含肽的定义：内含肽intein是位于宿主蛋白质中的一段插入序列，前缀in一取自inventing, 后缀tein一取自protein。
与内含肽相对应的另一专用术语是外显肽。
内含肽基因不是一个独立的, 必须插人于外显肽基因才能复制转录，可从前体蛋白中切除并将两侧外显肽连接起来成为成熟蛋白质。
其对应的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白对应的核酸序列之中，与宿主蛋白基因存在于同一开放阅读框架(open reading frame，ORF)内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体后，内含肽从宿主蛋白质中切除，从而形成成熟的具有活性的蛋白。
1.2内含肽结构和种类1.2.1结构被人们公认的标准内含肽的结构模体为：N端剪接区+中部归巢核酸内切酶区域+ C剪接区域。
两端剪接区参与蛋白质的剪接，中部区域参与蛋白质归巢过程，少数内含肽不含核酸内切酶区域。
全功能型内含肽包括8个保守区或基序，一般由244～1650个氨基酸碱基组成，大部分在500个氨基酸残基左右。
自导引归巢核酸内切酶将剪接功能区分为含有A和B保守区的N端和含有G和F的C端功能区。
从N端开始到C端依次为A、B、C、D、E、H、F、G，其中C、D、E、H属于自导引归巢核酸内切酶家族。
微型内含肽均带有A、B、F、G保守区，一般由128～1309个氨基酸残基组成，大部分为160个左右氨基酸残基自导引归巢核酸内切酶(Homing endonuclease)活性在识别序列和功能上与核酸内含子(Intron)的自导引归巢核酸内切酶类似，具有位点特异性，可以在无Intein等位基因的双链DNA位点定点切割，引起Intein的插入。
内含肽的名词解释
内含肽的名词解释肽是由氨基酸通过肽键连接而成的生物分子，是蛋白质的组成部分。
而内含肽则是指存在于生物体内的特定肽分子。
内含肽在生物体内起着重要的生理功能，具有调节器官和组织功能的作用。
下面将以内含肽的研究领域、生理功能和应用价值三个方面，进一步探讨内含肽的名词解释。
一、内含肽的研究领域内含肽的研究领域涉及多个学科，如生物化学、生物学和医学等。
这是因为内含肽可以影响真核细胞的功能，调节细胞信号传导、细胞增殖和细胞分化等生理过程。
例如，许多内含肽通过与细胞膜上的特定受体结合，触发细胞内信号传导通路，影响细胞的生长和功能。
内含肽的研究也涉及到了一些前沿领域，如肿瘤学、神经科学和免疫学等。
二、内含肽的生理功能内含肽在生物体内展现出多种生理功能，下面将介绍其中部分。
1. 调节食欲和能量代谢一些内含肽在调节食欲和体重方面起着重要作用。
例如，胰岛素和胰高血糖素等激素能够通过调节血糖水平和能量代谢，影响体重控制和相关疾病的发生。
2. 调控心血管系统内含肽如生长抑素、研究科学家和巴斯德肽等，能够通过调节心血管系统的结构和功能，参与心血管疾病的发生和治疗。
3. 调节免疫功能内含肽可以调节免疫系统的功能，提高机体的抗病能力。
例如，抗菌肽是一类具有抗菌活性的内含肽，能够杀灭病原体，维护机体的免疫平衡。
4. 调控神经系统一些内含肽在调控神经系统方面发挥着重要作用。
例如，催产素和抗利尿激素是调节神经系统和肾脏功能的内含肽。
三、内含肽的应用价值内含肽在医学、药物和生物技术等领域具有广泛的应用价值。
1. 药物开发内含肽作为靶向药物开发的重要对象，可以通过结构优化，设计出具有高效、低毒副作用的药物。
目前已有许多内含肽药物进入了临床应用阶段。
2. 诊断与治疗某些内含肽可以作为诊断和治疗分子用于疾病的早期诊断和治疗。
例如，某些神经肽可以用于神经退行性疾病的诊断，重要的药物类别如外源性内含肽类肽激素疗法。
3. 生物工程与农业内含肽还被广泛应用于生物工程和农业领域。
NEB常用酶介绍
NEB常用酶介绍NEB（New England Biolabs）是一个位于美国的生命科学公司，致力于研究和开发分子生物学工具。
NEB是全球领先的酶制造商之一，其产品被广泛应用于分子生物学、基因工程和遗传学等领域。
下面将介绍几种NEB常用的酶。
1. EcoRI：EcoRI是一种限制性内切酶，它能够识别GGATCC序列并将DNA切割成两段。
这种酶广泛应用于DNA的定量分析、基因克隆和DNA序列分析等领域。
2. Taq DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶，能够在高温（最高可达95℃）下工作。
由于其特殊的酶活性和热稳定性，Taq DNA聚合酶广泛应用于PCR（聚合酶链反应）技术，用于DNA扩增和基因分析。
3.T4DNA连接酶：T4DNA连接酶可以将DNA分子连接起来，形成DNA链的连续片段。
这种酶在基因克隆、DNA重组和DNA构建等实验中被广泛应用。
4. RNase H：RNase H是一种核酸内切酶，能够特异性地降解RNA/DNA杂合体分子中的RNA链。
RNase H广泛用于亲和纯化、DNA杂交、基因表达调控和RNAi技术等领域。
5.T4DNA解旋酶：T4DNA解旋酶是一种能够解旋双链DNA的酶，可以将DNA解开成两条单链的DNA。
这种酶可以用于DNA复制、转录、重组和修复等过程的研究。
6. DNase I：DNase I是一种降解DNA的核酸酶，能够将DNA分解成较小的片段。
DNase I广泛应用于DNA纯化、DNase footprinting等实验中。
7.克隆充填酶：NEB提供多种克隆充填酶，用于将DNA片段克隆到克隆载体中。
这些酶通常具有3'→5'外切内切酶活性，可以将3'末端的不互补碱基去除，并将DNA片段插入到克隆载体中。
8.T4DNA聚合酶：T4DNA聚合酶是一种特殊的DNA聚合酶，具有内切酶活性和3'→5'外切酶活性。
这种酶可以在DNA合成的同时修复DNA末端的缺口，用于DNA修复和DNA重组等研究。
NEB常用酶介绍
DpnI
识别位点
在不同反应缓冲液的活性 NEBuffer 1.1: 100% NEBuffer 2.1: 100% NEBuffer 3.1: 75% CutSmart Buffer: 100% 来源 重组 E. coli 菌株，包含有从 Diplococcus pneumoniae G41 (cks) 克隆的 DpnI 基因。 特性 CutSmart、重组酶、省时酶。 连接和再切 经过 DpnI 20 倍过量消化，大约 25% 的 DNA 片段能被连接，连接片段中 > 95% 能被再切。 反应条件 CutSmart 缓冲液，37℃。 热失活：80℃ 20 分钟。 浓度 20,000 units/ml。【通过 pBR322 DNA（dam 甲基化后）鉴定】。 甲基化敏感性 只有当识别位点被甲基化时，DpnI 才能切割。从 dam+ 菌株纯化而来的 DNA 才是 DpnI 切割的底 物。对哺乳动物基因组 DNA CpG 甲基化敏感。
只要在反应体系中补加 1 mM ATP，连接反应就可以在 NEB 提供的四种限制性内切酶缓冲液或在 T4 DNA 多聚核苷酸激酶反应缓冲液中进行。
参考文献 (1) Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). In P.D. Boyer (Ed.), The Enzymes , Vol. 5, (p. 3). San Diego: Academic Press. (2) Remaut, E., Tsao, H. and Fiers, W., (1983) Gene , 22,103–113. (3) Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual , (2nd ed.), (pp.1.53–1.73). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
原核表达系统
生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101原核表达系统***基因公司技术讲座***生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 /bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101原 核 表 达 系 统 分 类分类方式表达调控方式 表达产物定位 产物纯化方式 产物溶解状况分 类组成型，诱导型分泌型，不分泌型（细胞内、细胞膜、周质空间）是否融合蛋白、是否一步亲和纯化 可溶、包含体、分泌型生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101主 要 用 途* 基因功能研究 * 重组蛋白特性研究 * 重组蛋白制备/制药生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101NEB 公 司 的 IMPACTTM 系 统Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag世界首创 独家提供采用了最新的“可诱导的内含肽自身剪切 ”技 术，使内含肽在适当的pH或还原条件进行自身剪 切，无需另外加入蛋白酶就可将目的蛋白经过一步亲 和层析从融合表达的蛋白中分离出来，大大提高了纯 化效率。
Target Gene CBD Intein MCSMultiple cloning siteChitin Binding DomainChitin-bound intein tag生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101内 含 肽 （Intein)内含肽是一种蛋白剪切元件（Protein splicing element), 是一些读框区中打断宿主基因 编码区的序列。
与内含子 (Intron) 不同的是，它们是在翻译后通过自身催化的蛋白剪切 机制从蛋白前体中被剪切的。
InBase(The Intein Database)NEB’s web site: <> Technical Resource section生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101IMPACT-CN 系 统特 点独家的Intein 介导的肽连接技术 （IPL）* 操作灵活——目的蛋白可在C端或N端与标记融合 * 目的蛋白产物序列不变 * 一步亲和纯化——无需另加蛋白酶除亲和标记 * 严谨的转录控制 * 目的蛋白能够进行C端标记生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101IMPACT-CN 系 统 流 程生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101IMPACT-TWIN 系 统特 点* 操作灵活——目的蛋白可在C端或N端与标记融合 * 目的蛋白产物序列不变 * 一步亲和纯化——无需另加蛋白酶去除亲和标记 * 可选择硫醇试剂或pH和温度条件诱导Intein 自身剪切 * IPTG诱导的T7启动子，可实现高水平表达及严谨的表达调控 * 唯一可直接产生带N端Cys 和C端硫酯 的蛋白的表达纯化系统 纯化产物可方便地进行标记、连接及环化等操作独家的Intein 介导的肽连接技术 （IPL）生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101IMPACT-TWIN 系 统 流 程Protein cyclization生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbs生物秀实验频道——生命科学实验中心/bio101生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区/bbsPRO Bacterial Expression SystemQIAexpress以6×His标记和Ni-NTA亲和纯化为基础的完整的表达纯化系统QIAexpress以6×His标记和Ni-NTA亲和纯化为基础的完整的表达纯化系统QIAexpress以6×His标记和Ni-NTA亲和纯化为基础的完整的表达纯化系统QIAexpress以6×His标记和Ni-NTA亲和纯化为基础的完整的表达纯化系统QIAexpress以6×His标记和Ni-NTA亲和纯化为基础的完整的表达纯化系统。
第5章 表达载体
2）终止子：依赖于ρ 因子或不依赖于ρ 因子（遇茎环结构
而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)：
Shine-Dalgarno (SD)序列，ATG与RBS之间的距离很重要， 一般3-11bp。
2、表达形式 完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，
但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白 的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达 了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶 连两个或多个相关基因的表达。
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3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq PL启动子受cⅠ的调控，低温(30℃)下阻抑转录， 高温(40-45℃)下解除抑制。 二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 pET系列，表达能力强，可控性好，只受T7噬 菌体RNA聚合酶识别，不受大肠杆菌RNA聚 合酶识别，可用IPTG诱导表达。
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2 ） 植 物 Ac-Ds 转 座 子 双 因 子 插 入 突 变 ： 玉 米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转 座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因 的缺失体，但具两端的反向重复序列。
分别构建含Ac 和Ds 的质粒载体载体并分别转化植物， 转基因植株杂交 (Ac×Ds) 后代中会发生转座事件 而产生突变体。 利用Ac-Ds序列作探针或引物克隆目标基因。
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3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系 统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白 酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切 除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
一种胸腺肽α1的原核表达方法
一种胸腺肽α1的原核表达方法朱政斌【摘要】In order to obtain a economic method of producing recombinant thymosin α1（Tα1）. The chemically synthesized Tctl and ELP were inserted into pET41a（＋） vector. The RimJ was amplified by PCR and inserted into pACYCDuetl vector. Then the recombinant plasmids were cotransformed into BL21. After expression in self-induced medium, the fusion protein was purified by precipitation under a temperature higher than transition temperature and cleavage with hydroxylamine. The results show that the yield of fusion protein was 240mg from 1 liter of self-induced medium. The fusion protein was cleaved with hydroxylamine, and 29.5mg of target protein （purity： 98%） was obtained. A production method of thymosin α1 was established by non-chromatographic purification and affinity purification.%采用融合表达方式表达Tα1基因，通过人工合成Tα1和ELP基因，构建Tα1-G—ELPn／pET41a（＋），同时构建RimJ-pA-CYCDuet1载体，共转BL21，采用自诱导表达培养基进行蛋白表达，表达蛋白通过变温自动聚合沉淀获得高纯度融合蛋白，将融合蛋白羟胺裂解，变温沉淀，收集上清，最终获得目标蛋白．结果显示，1L培养基最终获得纯度为98％的目标蛋白29．5mg．建立了一种不需色谱和亲和纯化的生产胸腺肽α1的方法。
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纯 化 流 程 示 意 图
• 内含肽自我剪切效率 • 切割效率一般为为23度16小时切割80%-90% • N端首个氨基酸为Cys, 该氨基酸存在时会影 响切割效率，所以NEB认为不适合采用内含 肽载体来构建。
切割位最佳氨基酸
• 几丁质结合域可与几丁质树脂紧密结合，这样 目的蛋白、内含肽和几丁质结合蛋白在一起以 融合蛋白形式表达。
• 内含肽是一种自剪接元件，一端与几丁质 结合蛋白构成载体蛋白，另一端与目的多 肽相结合，当含有巯基的化合物（DTT，β巯基乙醇）存在时，内含肽与目的多肽间 肽键断裂，经缓冲液洗脱而得到目的多肽， 而载体蛋白仍吸附在几丁质柱上。然后， 用碱液洗脱将几丁质结合蛋白释放，从而 实现柱的再生。
NEB内含肽原理
• 内含肽介导的纯化系统由NEB公司建立， 可以仅用一步亲和层析从融合蛋白中纯化 出目的蛋白（ IMPACT™ 试剂盒）。 • 包含载体为pTYB11 系列 • pTYB11体上相同的位 点融合，因此内含肽的切割位点正好位于目的 基因的N端，因此不会添加多余序列 • 由该载体表达的融合蛋白含有几丁质结合域 (CBD)和内含肽(Intein)两部分功能元件，其C端 为目的蛋白。