内含肽原理-NEB
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 几丁质结合域可与几丁质树脂紧密结合，这样 目的蛋白、内含肽和几丁质结合蛋白在一起以 融合蛋白形式表达。
• 内含肽是一种自剪接元件，一端与几丁质 结合蛋白构成载体蛋白，另一端与目的多 肽相结合，当含有巯基的化合物（DTT，β巯基乙醇）存在时，内含肽与目的多肽间 肽键断裂，经缓冲液洗脱而得到目的多肽， 而载体蛋白仍吸附在几丁质柱上。然后， 用碱液洗脱将几丁质结合蛋白释放，从而 实现柱的再生。
NEB内含肽原理
Biblioteka Baidu
• 内含肽介导的纯化系统由NEB公司建立， 可以仅用一步亲和层析从融合蛋白中纯化 出目的蛋白（ IMPACT™ 试剂盒）。 • 包含载体为pTYB11 系列 • pTYB11载体结构为
• 设计的正向引物酶切位点会和载体上相同的位 点融合，因此内含肽的切割位点正好位于目的 基因的N端，因此不会添加多余序列 • 由该载体表达的融合蛋白含有几丁质结合域 (CBD)和内含肽(Intein)两部分功能元件，其C端 为目的蛋白。
纯 化 流 程 示 意 图
• 内含肽自我剪切效率 • 切割效率一般为为23度16小时切割80%-90% • N端首个氨基酸为Cys, 该氨基酸存在时会影 响切割效率，所以NEB认为不适合采用内含 肽载体来构建。
切割位最佳氨基酸
• 内含肽是一种自剪接元件，一端与几丁质 结合蛋白构成载体蛋白，另一端与目的多 肽相结合，当含有巯基的化合物（DTT，β巯基乙醇）存在时，内含肽与目的多肽间 肽键断裂，经缓冲液洗脱而得到目的多肽， 而载体蛋白仍吸附在几丁质柱上。然后， 用碱液洗脱将几丁质结合蛋白释放，从而 实现柱的再生。
NEB内含肽原理
Biblioteka Baidu
• 内含肽介导的纯化系统由NEB公司建立， 可以仅用一步亲和层析从融合蛋白中纯化 出目的蛋白（ IMPACT™ 试剂盒）。 • 包含载体为pTYB11 系列 • pTYB11载体结构为
• 设计的正向引物酶切位点会和载体上相同的位 点融合，因此内含肽的切割位点正好位于目的 基因的N端，因此不会添加多余序列 • 由该载体表达的融合蛋白含有几丁质结合域 (CBD)和内含肽(Intein)两部分功能元件，其C端 为目的蛋白。
纯 化 流 程 示 意 图
• 内含肽自我剪切效率 • 切割效率一般为为23度16小时切割80%-90% • N端首个氨基酸为Cys, 该氨基酸存在时会影 响切割效率，所以NEB认为不适合采用内含 肽载体来构建。
切割位最佳氨基酸