科学仪器学复习内容第二部分

第一部分PCR及其相关的技术

1. P C R 技术原理

PCR技术实际上是DNA体外合成放大反应。其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

①模板DNA的变性: 模板DNA经加热至94 - 95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR

扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

②模板DNA与引物的退火(复性)

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40-70℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

③引物的延伸:

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

2. PCR反应体系

缓冲液；模板DNA；引物；脱氧核糖核苷三磷酸（dA TP dTTP dGTP dCTP)；TaqDNA 聚合酶；Mg2+

3. 引物设计原则

①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%，两个引物的Tm值应

基本接近(<5 ℃)，且以在55 – 65℃为好。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补（发夹结构）。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补（引物二聚体），特别是一引物的3…端不能结合到另一引物。⑧引物5′端可以修饰（标记、酶切位点等）。

⑨引物3′端不可修饰，最好选G/C，一般不放A。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

4. PCR的特点

（1）灵敏度高

皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平

能从100万个细胞中检出一个靶细胞

病毒检测的灵敏度可达3个RFU

细菌检测的最小检出率为3个细菌

（2）简便、快速

一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增

扩增产物一般用电泳分析

（3）对标本的纯度要求低

血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA

5. RT-PCR及其应用

RT-PCR指逆转录PCR, 是指从RNA或mRNA直接扩增获得目的DNA片段的过程.

主要应用：1）RNA序列分析

2）基因表达研究

3）遗传病诊断

6.荧光定量PCR

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应

过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。

7.荧光定量PCR定量原理及计算方法

反应最初，虽然产物是指数增长,但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加.当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即CT。

由于CT值处于指数期内，这时的反应成份不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量PCR 结果是可靠的，可以准确地反应体系中模板的初始量。如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式“2n=稀释倍数“决定；n为阈值线上扩增曲线之间的循环数（CT的差值）

例如：10倍稀释的DNA样品，2n=10 因此n=3.32，即CT值相差3.32个循环8. 荧光定量PCR的应用

（1）实时监测产物量，计算初始模板量

（2）基础研究的基因表达分析研究

（3）临床病原体检测

病人体液中目标基因的检测：病毒,寄生虫,细菌

市场上有各种开发好的试剂盒

（4）食品卫生检疫

a.转基因食品的检疫：根据转入基因的特异性区段设计探针

b.食品中病原微生物的检测

第二部分蛋白质的分离纯化

1.蛋白质分离纯化的依据

①蛋白质的分子大小

主要取决于蛋白质的肽链数目及每条肽链的氨基酸残基数目，透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的；

②蛋白质的带电特性

蛋白质肽链的氨基末端、羧基末端、酸性氨基酸残基的侧链R基以及碱性氨基酸残基的侧链R基等，在不同的pH条件下会带有不同的电荷，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是以此为依据来分离纯化蛋白质；

③蛋白质的溶解特性

大多数蛋白质在水溶液中会形成稳定的胶体溶液，易溶于稀酸、稀碱或稀盐等，当破坏胶体稳定存在的条件时，蛋白质会沉淀析出，硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离等均依据此原理；

④蛋白质的变性与复性：

蛋白质在一定的物理化学条件下会失去原有的空间结构、生物学功能以及部分理化特性等称为变性，在变性条件不剧烈，某些蛋白质在除去变性条件后会恢复原有的空间结构和生物学功能即为复性。例如，采用尿素变性复性的方法从包含体中纯化原核表达蛋白；

⑤蛋白质的结晶：

天然蛋白质在一定的物理化学条件下，浓度达到过饱和状态时就会结晶析出，如从鸡蛋中纯化溶菌酶等就可以采取结晶与再结晶的方法；

⑥蛋白质分子表面的特性：

蛋白质分子表面疏水氨基酸残基的数目、比例以及分布区域不同，因此它们与吸附剂的

吸附作用力不同，蛋白质的吸附层析就是依据此原理；

⑦蛋白质的分子形状：

不同的蛋白质具有不同的分子形状，因此其与特定的配基(或配体)具有专一的结合特性，如酶与底物、酶与其抑制剂或激活剂，抗体与抗原，凝集素与葡聚糖等，亲和层析就是以此为依据；

2. 蛋白质分离纯化与鉴定的主要步骤

（1）选择实验材料

（2）实验材料的预处理

（3）蛋白质的提取

（4）蛋白质粗分级

（5）蛋白质细分级

（6）蛋白质的鉴定

3. 蛋白质粗分级方法

⏹硫酸铵分级沉淀

⏹有机溶剂分级沉淀

⏹超速离心

⏹等电点沉淀

⏹透析

⏹超滤

⏹蛋白质结晶

⏹

4. 蛋白质细分级方法

⏹分子筛层析

⏹离子交换层析

⏹亲和层析

⏹聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、毛细胞电泳、等电聚焦电泳等

5蛋白质鉴定的相关要素

⏹蛋白质分子质量

⏹等电点

⏹氨基酸组成及其顺序

⏹免疫特性

⏹结晶特性

⏹生物学功能

6.实验设计大肠杆菌中表达的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白的分离纯化

(1)选择实验材料：大肠杆菌(含有His-GFP表达质粒)在液体LB培养基中培养，离心，

除去LB培养基，收集菌体沉淀。

(2)实验材料预处理：用蛋白质提取缓冲液悬浮菌体，离心后收集菌体沉淀，再用蛋白质

提取缓冲液洗涤菌体一次，用少量提取缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下超声波破碎菌

体，离心后的上清液即为绿色荧光蛋白粗提取液。

(3)蛋白质粗分级：将绿色荧光蛋白粗提取液装入透析袋中浓缩，透析除去小分子杂质。

(4)蛋白质细分级：使用镍亲和层析柱亲和纯化带有组氨酸标签的绿色荧光蛋白。

(5)蛋白质的鉴定：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定绿色荧光蛋白分子质量，使用荧光分光

光度计测定绿色荧光蛋白荧光光谱等。

7．常用的分子筛层析凝胶