肽指纹图谱PMF鉴定

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蛋白的选择



一般以protein score C.I.%大于95或者单个肽段的 Total Ion C.I.%大于95作为蛋白成功的标准 对于一个样品点鉴定得到多个成功鉴定的结果， 以蛋白得分（ protein score ）最高的最为可信 一般而言，多个成功鉴定的不同蛋白之间相似性 也是非常高的，也可以通过这个特点来判定结果 的可靠性
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数据库检索
采用GPS Explore (V3.6 ，ABI) 软件进行分析 使用MASCOT（V2.1, Matrix Science, London, U.K） 搜库软件对本地数据库进行检索 检索数据库为NCBInr，切割的酶为trypsin ，允许最 大的未被酶切位点数为1, 可变修饰为半胱氨酸乙酰 胺化和甲硫氨酸氧化，没有固定修饰，母离子质量 容差为50 ppm，片段离子质量容差为0.25Da
质谱测试分析
蛋白质质谱鉴定流程
样品 酶解 酶解片断
PMF 肽指纹图谱
序列数据库
一级质谱
成功鉴定
PSMs及后筛选
对库 检索
串联质谱
未知蛋白
De-novo 序列分析
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胰蛋白酶酶解
采用含乙腈的脱色液脱色至胶块变为白色 真空干燥仪中冷冻干燥 蛋白质组学级胰蛋白酶酶解过夜 采用含TFA和乙腈的溶液溶进行肽提取 真空干燥 采用含TFA和乙腈的溶液溶解样品并点样进 行质谱测试
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优点与缺点
优点： 是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法，算法简单， 速度快 缺点： 质量相近的多肽增加匹配难度 无法实现混合蛋白的鉴定
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二级质谱鉴定


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质谱仪选择一级质谱中的一个峰，让这些峰所代 表的离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽 键断裂，并对库搜索鉴定蛋白质 常用MALDI-TOF／TOF仪器进行
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优点与缺点
优点： 鉴定准确度更高，可以得到蛋白的序列 可以实现多个蛋白的鉴定 缺点： 增加了一步操作 算法更复杂，而且需要更多的操作经验
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肽指纹图谱（PMF）鉴定



PMF（Peptide Mass Fingerprinting）是根据一级质谱 （MS）所测酶解片段的精确分子质量鉴定蛋白质的 一种方法 一般采用MALDI-TOF进行鉴定。因为MALDI质谱 图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算 其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的 信息与实际测得的质量信息进行对比而实现鉴定
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质谱分析
ABI MALDI-TOF/TOF 4800 质谱仪 先用MS反射模式得到一级图谱 一级质谱激光总shots: 800次 选择5-10个母离子做MS/MS分析 二级MS/MS激光总shots: 2000次，碰撞能量1KV, CID on
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串联质谱结果
——质谱图
二级质谱图
一级质谱图
从一级质谱图里 选出部分峰做二 级质谱
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串联质谱结果
——报告单
蛋白点编号 理论分子量
蛋白名称
蛋白GI号
蛋白得分 理论等电点 串联质谱离 子得分 串联质谱匹 配的序列 可信度
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蛋白信息查询


首先根据蛋白名称可以了解该蛋白的大致功能 使用该蛋白的GI号码可以到NCBI数据库进一 步查询该蛋白的信息 对于未知蛋白，可以采用BLAST或者其它功能 预测软件预测该蛋白的功能
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