乳酸菌的分离和初步鉴定

乳酸菌的分离和初步鉴定

刘海音张超

(长春师范学院生物系，长春，130032)

摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。

关键词：乳酸菌分离鉴定

乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶

1.1.2 培养基

BCG牛乳培养基

A(溶液)：脱脂奶粉100g, 水500 ml, 加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1 ml,

80 摄氏度灭菌20 min.

B(溶液)：酵母膏10 g, 水500 ml, 琼脂20 g, PH : 6.8 121摄氏度灭菌20 min 以无菌操作趁热将A ,B 溶液混合均匀后倒平板。

乳酸菌培养基

牛肉膏5 g , 酵母膏5 g , 蛋白胨10 g ,葡萄糖10 g , 乳糖5 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 6.8

121摄氏度湿热灭菌20 min

蛋白胨水培养基

蛋白胨10 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4

121 摄氏度湿热灭菌20 min

糖发酵培养基

蛋白胨水培养基1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各10 ml.

制法：

1）.将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（PH : 7.6 ）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（Durhem tube）,使充满培养液。

2）.将已分装好的蛋白胨水培养基和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水培养基121摄氏度灭菌20 min ,糖溶液112摄氏度灭菌30 min .

3) . 灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的糖溶液0.5 ml , 则成1%的浓度。

1.1.3 有关溶液

1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6 g 溶于100 ml 乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。

吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛8 g , 95 % 乙醇760 ml , 浓盐酸160 ml.

10 % 硫酸

2 % 高锰酸钾

含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银2 g , 蒸馏水100 ml ,待硝酸银溶解后，取出10 ml 备用，向其余的90 ml 硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分离提纯

直接用接种环蘸取纯酸奶平板划线分离，置40摄氏度培养48小时。挑选出乳酸菌进行连续6次以上的传代，以达到提纯。

1.2.2 乳酸菌的鉴定

吲哚试验

1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。

3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。

糖发酵试验

1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。

3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。

1.2.3 乳酸的检测

选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。

2.结果和分析

2.1 乳酸菌的分离提纯

在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状（如图一）

（图一）

2.2乳酸菌的鉴定

该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。

（图二）说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌