腐乳中乳酸菌的分离与鉴定_王夫杰

腐乳中乳酸菌的分离与鉴定

王夫杰1,鲁绯1*,渠岩2,张建1,黄持都1

(1.北京市食品酿造研究所,北京 100050;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

摘要:文章主要对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离鉴定。从青方和白方腐乳中分别分离到乳酸菌7株和5株,红方中没有分离到乳酸菌。鉴定结果表明,白方中4株为鼠李糖乳杆菌,1株清酒乳杆菌;青方中有1株为植物乳杆菌,1株干酪乳杆菌,3株鼠李糖乳杆菌,2株清酒乳杆菌。最后,对不同菌株的耐盐性和耐酒精性进行了测试。

关键词:腐乳;乳酸菌;分离;鉴定

中图分类号:T S264.25 文献标识码:B 文章编号:1000-9973(2010)07-0098-04 Separation an d identification of lactic acid bacteria isolated from Su fu WANG Fu jie1,LU Fei1*,QU Yan2,ZH ANG Jian1,H UANG Chi du1

(1.Beijing Foo d Brew ing Institute,Beijing100050,China; 2.Fo od

Science and Nutr itional Engineering Co lleg e of China A gricultural

U niv ersity,Beijing100083,China)

Abstract:The lactic acid bacteria in gr ey Sufu、w hite Sufu and red Sufu w er e separated and identify. Seven str ains w ere isolated from gr ey Sufu,five strains w ere iso lated fr om w hite Sufu,no o ne w as i solated fr om red Sufu.The identification show ed that four str ains w ere Lactobacillus rhamnose and one w as Lactobacillus sake in white Sufu.In grey Sufu,three str ains w ere Lacto bacillus rham nose, tw o strains were Lactobacillus sake,the tw o other w ere Lactobacillus plantar um and Lactobacillus ca sei respectiv ely.At last,the salt and alco ho l tolerance of different strains w er e tested.

Key words:Sufu;lactic acid bacteria;separ ation;identificatio n

乳酸菌的应用历史非常悠久,4000年前古人已有酸奶饮用的历史。随着现代微生物学的发展,食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的关注,乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬制品、软饮料等食品。乳酸菌在酿造工业中的应用受到越来越多的关注。

腐乳是中国独创的调味品,在世界发酵食品中独树一帜,它既可单独食用,也可用来烹调风味独特的菜肴,被称为 中国奶酪 。商品腐乳中含有高水平的适度耐盐菌,其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌,它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用,一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义[1-5]。

乳酸菌是潜在地加快腐乳成熟和改进风味的协同菌株。研究表明,从特定食品中分离出的乳酸菌是该食品进行乳酸发酵的最佳出发菌株,因为它们比其它来源的乳酸菌具有更强的竞争力[6-8]。本文对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离纯化和鉴定,旨在揭示腐乳中乳酸菌的群系分布特征,对腐乳发酵中风味乳酸菌的研究和开发提供依据,对乳酸菌应用于腐乳生产、改善腐乳风味的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品

收稿日期:2010-03-27 *通讯作者

基金项目:北京市优秀人才培养资助(20081D010*******);北京市自然科学基金(6093022)作者简介:王夫杰(1980-),女,硕士,研究方向为生物技术与发酵工程;

鲁绯,女,副教授,食品科学与工程博士。

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腐乳(青方、红方和白方):市售。

1.2 培养基

MRS液体培养基(用于乳酸菌富集培养):蛋白胨10g,牛肉膏8g,酵母膏4g,葡萄糖20g,乙酸钠5g,柠檬酸氢二氨2g,吐温801m L,K2H PO42g,M n SO4 4H2O0.04g,M gSO4 7H2O0.2g,水1000mL。pH自然,121 灭菌15m in。

改良M RS培养基(用于乳酸菌分离纯化):向MRS培养基中加入2%的琼脂,3%碳酸钙。灭菌后放入60 恒温水浴中备用,用前加入0.1%的纳他霉素,抑制霉菌和酵母菌生长。

MRS琼脂培养基(用于乳酸菌保存计数):向MRS培养基中加入2%的琼脂。

细菌微量生化反应管:购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌锅BL 50 上海东亚压力容器制造有限公司;数显圆周振荡器MS3 德国IKA;超净工作台CJ 1B 北京半导体设备一厂;电热恒温水浴锅DK 98 IIA 天津市泰斯特仪器有限公司;电热恒温培养箱DH5000 天津市泰斯特仪器有限公司;高速台式离心机H1650 长沙湘仪离心机仪器有限公司;Bausch&Lom b显微镜 日本。

1.4 实验方法

1.4.1 乳酸菌的富集

为达到更好的分离效果,分离前先进行乳酸菌增殖培养。按接种量10%将腐乳汤汁接入M RS液体培养基中,37 培养48h,连续增殖2~3次。

1.4.2 乳酸菌的分离

制备样品梯度稀释液 使用改良MRS培养基,通过倾注平皿分离法进行分离 37 倒置培养 挑取有溶钙圈的单菌落,通过平板划线分离法反复分离纯化 经革兰氏染色和接触酶反应,挑出革兰氏阳性、接触酶阴性菌株 在MRS液体培养基中增殖培养 在MRS琼脂培养基上培养进行形态与生理生化检测鉴定 甘油管冷冻保存。

1.4.3 乳酸纸层析

把分离出的菌株进行乳酸纸层析分析。菌株37 恒温培养24h,将菌液在8000r/min速度下离心5m in,以5 L的点样量进行乳酸纸层析实验;展开剂是水 苯甲醇 正丁醇为1 5 5,另加1%的甲酸;显色剂为0.04%溴甲酚蓝酒精溶液,pH为7.6;2%的分析纯乳酸和空白培养液作对照。

1.4.4 菌株的培养特征和形态特征

将菌株分别接在M RS琼脂和液体培养基上, 37 恒温培养,观察菌落特征。从琼脂培养基上挑取37 恒温培养24h的单一菌落,涂片,革兰氏染色,在光学显微镜下观察细胞形态。

1.4.5 菌株的生化特征

将37 恒温培养24h的液体培养液离心(25 ,8000r/min,10m in),收集新鲜菌体,接入生化鉴定管中,37 恒温培养,18~24h后观察并记录现象。参照 常见细菌系统鉴定手册 对鉴定结果进行判定。

1.4.6 菌株耐盐性和耐酒精性实验

分别将M RS液体培养基调不同盐浓度和酒精度,把培养21h的菌株接种于其中,37 培养,观察其生长状况。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离

将腐乳汤汁在MRS液体培养基中富集培养后,取培养液进行梯度稀释,通过倾注平皿法进行分离,挑取有溶钙圈的单菌落,通过平板划线分离,反复纯化。通过革兰氏染色和接触酶反应,从青方中分离出7株菌,编号为Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7,从白方中分离出菌株5株,编号为B1、B2、B3、B4、B5。

2.2 乳酸菌鉴定

2.2.1 菌株培养特征

实验将菌株在液体培养基和琼脂平板上分别培养48h,对菌株的液体培养特征和固体培养特征进行了观察。以Q1为代表,其琼脂平板培养特征见图1和图2

。

图1 菌株Q1的培养特征(琼脂平板表面)

Fig.1T he cultural per for mances of Q1(sur face

o f Petr i dish)

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