荧光探针简介
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与结合后，电子供体的HOMO 能级下降，从而供电子能力降 低。荧光猝灭消失。
注意分子结构特点：荧光团与 猝灭基团之间一般以非共轭基 团相连。
电子供体的基态能级高度处于 荧光团的HOMO和LUMO之间。 从而，荧光团被激发后，供体 电子转移到荧光团的HOMO轨 道上，使LUMO轨道上的电子 无法通过辐射驰豫回到基态， 从而使荧光猝灭。
(2) 含铜蛋白。如血浆蓝铜蛋白和质蓝体，前者参与机 体内铜的调节，后者是生物过程中的电子传递体。
(3)铁硫蛋白。是一类含铁、硫的天然原子簇化合物与 蛋白质链上半胱氨酸结合的金属蛋白，如细菌铁氧还蛋 白含Fe4S4原子簇，它是生物体中重要电子传递体。
(4)金属酶。具有催化生物体内化学反应的金属蛋白， 常常金属离子位于活性中心，如锌酶。
(HOOCH2CH2C)2N
O
O
H
O
N
N
(HOOCH2CH2C)2N
O
+Ca2+ -Ca2+
荧光探针与Ca2+结合后荧光增强
-OOC N
O
-OOC
O
Ca2+ O
H
N
N
-OOC N
O
-OOC
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445
与Ca2+结合前发生光诱导电子 转移（PET），无荧光发射。
生物体中参与代谢过程的金属离子， 往往以游离态和配合物的形式存在；
因此，其金属离子的浓度及其分布情 况就成为十分关键的热力学和动力学 参数。
如何检测生物体内离子的浓度和分布？
例如，细胞内Ca2+等的检测： 1）核磁共振波谱法； 2）化学修饰电极（电化学探针）； 3）发光蛋白法；
4）荧光探针方法（最常用）。
测定神经细胞中的Ca2+
-OOC N
Oห้องสมุดไป่ตู้
-OOC
O
Ca2+ O
H
N
N
-OOC N
O
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445 -OOC
怎样设计荧光探针？
基本要点： 荧光探针分子由识别基团和荧光团两部分
键合而成； 依据一定的原理进行设计，使探针分子与
目标物结合前后的荧光光谱有显著区别。
1、背景干扰较强
生物体中的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的残基以及某些辅 酶也能够被紫外光激发并发出荧光，从而产生背景干扰。
荧光减弱：
1、仅含与共轭体系直接相连的吸电子基团；
2、含有可导致荧光猝灭的基团。
如何使探针与客体结合前后发生荧光光 谱的显著变化？
1）光诱导电子转移机理（PET）； 2）光诱导电荷转移机理（PCT）； 3）荧光共振能量转移机理（FRET）； 4）基于其它原理的设计。
光诱导电子转移机理（PET）
O
O
H
O
N
N
(HOOCH2CH2C)2N
O
+Ca2+ -Ca2+
配体与Ca2+络合后，荧光显著增强
-OOC N
O
-OOC
O
Ca2+ O
H
N
N
-OOC N
O
-OOC
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445
荧光探针方法的优点
灵敏度高（一般用量10-4~10-5mol/L）； 选择性好； 可用显微镜直接观察，时空分辨率很高； 响应时间短； 操作方便、成本低； ∙∙∙∙∙∙
20世纪60年代以来，随着配位化学、生物化 学、分析化学等多个学科的发展，出现了 一门新的交叉学科——生物无机化学。其 研究对象是生物体内的金属（和少数非金
属）元素及其化合物，特别是痕量金属元
素和生物大分子配体形成的生物配合物，
如各种金属酶、金属蛋白等。侧重研究它 们的结构-性质-生物活性之间的关系以及在 生命环境内参与反应的机理。
引自：J.Am.Chem.Soc.,2002,124 (36),10650
荧光共振能量转移机理（FRET）
以485nm做激发波长时，加 入Zn2+前，该分子在518nm 附近显示荧光素基团的特征 发射；而当加入 Zn2+后，发 射峰红移至罗丹明基团的特 征发射峰（590nm）。
引自：Anal.Chem.,2010,82,3108
就可以观察到荧光能量由供体向受体转
移的现象，即用供体的激发波长激发时， 可观察到受体的荧光发射。
基于其它原理的荧光探针
钠离子与大环结合后限制了分子的构象异构，使分子结构具有了更好的刚 性和平面性，从而增强了荧光。
引自：J.Am.Chem.Soc.,2005,127,6956-6957
单光子荧光探针的缺点
光合作用中能量在叶绿素分 子间传递
Zn2+的引入加强了供体 与受体之间的荧光共振 能量转移，导致了荧光 光谱的变化。
荧光共振能量转移（PRET）是指在两 个不同的荧光团中，如果一个荧光团(供 体)的发射光谱与另一个荧光团(受体)的
吸收光谱有一定的重叠，则当这两个荧 光团间的距离较近时(一般小于10nm)，
识别基团
螯合剂类
Ca2+
-OOC
COO-
-OOC N N COO-
超分子配体
-OOC N
-OOC
O
Ca2+ O
-OOC N -OOC
O O Na+ O
OO
O
O
O
K+
O
O
O
O
O
O
Cs+
O
O
OO
荧光团
荧光增强：
1、分子中含有较大的共轭体系； 2、分子结构较好的平面性和刚性； 3、含有与共轭体系直接相连的供电子基团。
荧光探针在检测生物体中 金属离子方面的应用
有机化学
生物体中的金属元素
Na、K
维持细胞两侧渗透压、形成神经冲动；
Ca
抑制脑神经的异常兴奋，使人保持镇静；
Zn
对大脑的记忆与思维过程有重要影响；
金属蛋白
(1)含铁蛋白。如血红蛋白、细胞色素C等，前者具有载 氧、释氧功能，细胞色素C是电子传递体。
引自：科学技术与工程，2004，4（11），948~953
荧光探针法
利用某种能与特定目标分子或离子特异性结合， 且复合后荧光光谱发生显著变化的探针分子，对 细胞样品进行染色，然后在紫外光照射下发射荧 光，从而通过显微镜直接观察和测量得到金属离 子浓度和分布等信息的方法。
(HOOCH2CH2C)2N
正常发出荧光
光诱导电荷转移机理（PCT）
当直接连有供电子基的荧光团和吸电子基共扼连接时，在光的激发下，分子内 就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。此即光诱导电荷转移（PCT）。 PCT效应可以使分子的荧光增强并且光谱红移。
识别基团与Zn2+结合后，造成与稠杂环相连的N原子的供电子能力下降，减弱了 光诱导电荷转移，从而荧光强度降低，荧光光谱蓝移。
注意分子结构特点：荧光团与 猝灭基团之间一般以非共轭基 团相连。
电子供体的基态能级高度处于 荧光团的HOMO和LUMO之间。 从而，荧光团被激发后，供体 电子转移到荧光团的HOMO轨 道上，使LUMO轨道上的电子 无法通过辐射驰豫回到基态， 从而使荧光猝灭。
(2) 含铜蛋白。如血浆蓝铜蛋白和质蓝体，前者参与机 体内铜的调节，后者是生物过程中的电子传递体。
(3)铁硫蛋白。是一类含铁、硫的天然原子簇化合物与 蛋白质链上半胱氨酸结合的金属蛋白，如细菌铁氧还蛋 白含Fe4S4原子簇，它是生物体中重要电子传递体。
(4)金属酶。具有催化生物体内化学反应的金属蛋白， 常常金属离子位于活性中心，如锌酶。
(HOOCH2CH2C)2N
O
O
H
O
N
N
(HOOCH2CH2C)2N
O
+Ca2+ -Ca2+
荧光探针与Ca2+结合后荧光增强
-OOC N
O
-OOC
O
Ca2+ O
H
N
N
-OOC N
O
-OOC
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445
与Ca2+结合前发生光诱导电子 转移（PET），无荧光发射。
生物体中参与代谢过程的金属离子， 往往以游离态和配合物的形式存在；
因此，其金属离子的浓度及其分布情 况就成为十分关键的热力学和动力学 参数。
如何检测生物体内离子的浓度和分布？
例如，细胞内Ca2+等的检测： 1）核磁共振波谱法； 2）化学修饰电极（电化学探针）； 3）发光蛋白法；
4）荧光探针方法（最常用）。
测定神经细胞中的Ca2+
-OOC N
Oห้องสมุดไป่ตู้
-OOC
O
Ca2+ O
H
N
N
-OOC N
O
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445 -OOC
怎样设计荧光探针？
基本要点： 荧光探针分子由识别基团和荧光团两部分
键合而成； 依据一定的原理进行设计，使探针分子与
目标物结合前后的荧光光谱有显著区别。
1、背景干扰较强
生物体中的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的残基以及某些辅 酶也能够被紫外光激发并发出荧光，从而产生背景干扰。
荧光减弱：
1、仅含与共轭体系直接相连的吸电子基团；
2、含有可导致荧光猝灭的基团。
如何使探针与客体结合前后发生荧光光 谱的显著变化？
1）光诱导电子转移机理（PET）； 2）光诱导电荷转移机理（PCT）； 3）荧光共振能量转移机理（FRET）； 4）基于其它原理的设计。
光诱导电子转移机理（PET）
O
O
H
O
N
N
(HOOCH2CH2C)2N
O
+Ca2+ -Ca2+
配体与Ca2+络合后，荧光显著增强
-OOC N
O
-OOC
O
Ca2+ O
H
N
N
-OOC N
O
-OOC
引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445
荧光探针方法的优点
灵敏度高（一般用量10-4~10-5mol/L）； 选择性好； 可用显微镜直接观察，时空分辨率很高； 响应时间短； 操作方便、成本低； ∙∙∙∙∙∙
20世纪60年代以来，随着配位化学、生物化 学、分析化学等多个学科的发展，出现了 一门新的交叉学科——生物无机化学。其 研究对象是生物体内的金属（和少数非金
属）元素及其化合物，特别是痕量金属元
素和生物大分子配体形成的生物配合物，
如各种金属酶、金属蛋白等。侧重研究它 们的结构-性质-生物活性之间的关系以及在 生命环境内参与反应的机理。
引自：J.Am.Chem.Soc.,2002,124 (36),10650
荧光共振能量转移机理（FRET）
以485nm做激发波长时，加 入Zn2+前，该分子在518nm 附近显示荧光素基团的特征 发射；而当加入 Zn2+后，发 射峰红移至罗丹明基团的特 征发射峰（590nm）。
引自：Anal.Chem.,2010,82,3108
就可以观察到荧光能量由供体向受体转
移的现象，即用供体的激发波长激发时， 可观察到受体的荧光发射。
基于其它原理的荧光探针
钠离子与大环结合后限制了分子的构象异构，使分子结构具有了更好的刚 性和平面性，从而增强了荧光。
引自：J.Am.Chem.Soc.,2005,127,6956-6957
单光子荧光探针的缺点
光合作用中能量在叶绿素分 子间传递
Zn2+的引入加强了供体 与受体之间的荧光共振 能量转移，导致了荧光 光谱的变化。
荧光共振能量转移（PRET）是指在两 个不同的荧光团中，如果一个荧光团(供 体)的发射光谱与另一个荧光团(受体)的
吸收光谱有一定的重叠，则当这两个荧 光团间的距离较近时(一般小于10nm)，
识别基团
螯合剂类
Ca2+
-OOC
COO-
-OOC N N COO-
超分子配体
-OOC N
-OOC
O
Ca2+ O
-OOC N -OOC
O O Na+ O
OO
O
O
O
K+
O
O
O
O
O
O
Cs+
O
O
OO
荧光团
荧光增强：
1、分子中含有较大的共轭体系； 2、分子结构较好的平面性和刚性； 3、含有与共轭体系直接相连的供电子基团。
荧光探针在检测生物体中 金属离子方面的应用
有机化学
生物体中的金属元素
Na、K
维持细胞两侧渗透压、形成神经冲动；
Ca
抑制脑神经的异常兴奋，使人保持镇静；
Zn
对大脑的记忆与思维过程有重要影响；
金属蛋白
(1)含铁蛋白。如血红蛋白、细胞色素C等，前者具有载 氧、释氧功能，细胞色素C是电子传递体。
引自：科学技术与工程，2004，4（11），948~953
荧光探针法
利用某种能与特定目标分子或离子特异性结合， 且复合后荧光光谱发生显著变化的探针分子，对 细胞样品进行染色，然后在紫外光照射下发射荧 光，从而通过显微镜直接观察和测量得到金属离 子浓度和分布等信息的方法。
(HOOCH2CH2C)2N
正常发出荧光
光诱导电荷转移机理（PCT）
当直接连有供电子基的荧光团和吸电子基共扼连接时，在光的激发下，分子内 就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。此即光诱导电荷转移（PCT）。 PCT效应可以使分子的荧光增强并且光谱红移。
识别基团与Zn2+结合后，造成与稠杂环相连的N原子的供电子能力下降，减弱了 光诱导电荷转移，从而荧光强度降低，荧光光谱蓝移。