荧光探针
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− 灵敏度低
TaqMan探针法
• 水解型
− 报告基团，淬灭基团
− FRET（荧光谐振能量传递）
− 识别特异性产物
• 优点
− 特异性高，可准确定量
− 灵敏度高
− 设计不同标记的探针，可进行多重检测
• 缺点
− 一个探针只适用于一个目标
− 价格较高
− 探针设计较繁琐
因为Fret机制没有荧光产生
发生水解fret机制消失，荧光发生
= 0 × 2
对于一个非理想 PCR 反应：
= 0 (1 + )2
式中，n 为扩增反应的循环次数； 为第 n 次循环后的产物量； 为初始模板量； 为扩
增效率。
在实时荧光定量 PCR 反应中，在扩增产物达到阈值线时：
= 0 (1 + ) =
式中， 为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后， 是一个常
数，我们将其设为 N。
两边同时取对数得：
lg0 = − lg 1 + × + lg
整理此式，得：
1
lg
Ct = −
× lg 0 +
lg 1 +
lg
(1 + )
对一个特定的 PCR 反应来说， 和均是常数，所以Ct 和 lg0成负相关，即初始模板的对
含量的新方法。方法快速、简便、灵敏度高、选择性好,应用到实际样品的测
定中,取得了满意的结果。
Β—二酮类配体
芳环-多羧酸类配体
大环配体
稀土离子中Eu和Tb为荧光探针,建立了一种简单而灵敏的测定痕
量喹诺酮类药物的分析方法。这种方法是基于喹诺酮类药物能与
稀土离子Eu或Tb形成络合物,发生分子内能量转移,并发射特征荧
detection for
GAPDH
样品扩增：正常vs肿瘤
PMT1-FAM detection- ERBB2
肿瘤
来自百度文库
PMT2-VIC detection- GAPDH
肿瘤
正常
正常
稀土荧光探针法
稀土离子可以与多种有机化合物形成配合物，用合
适的激发光激发该稀土有机配合物，配合物中的配体分
子可以吸收激发光，然后通过分子内能量转移的方式将
荧光探针
（Fluorescence Probe）
荧光探针的应用
荧光素类探针
无机离子荧光探针
荧光量子点
分子信标
荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析
定量PCR技术以及DNA测序
荧光探针的原理
•
•
•
•
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面有了很大发展。本论文利用稀土荧光探针技术建立了哇诺酮类药物及血清白
蛋白新的测定方法,并以荧光光度法为研究手段,对药物与血清白蛋白的相互作
用进行了研究,主要做了以下工作以稀土离子中铺和试为荧光探针,建立了一种
简单而灵敏的测定痕量哇诺酮类药物的分析方法。这种方法是基于哇诺酮类药
物能与稀土离子铺或试形成络合物,发生分子内能量转移,并发射铺或试离子强
吸收的能量传递给稀土离子，从而发射稀土离子的特征
荧光。因为稀土离子荧光探针具有斯托克斯位移大、荧
光寿命长、发光强度大、选择性好、荧光稳定以及受外
界影响小等优点，使一些本来不发荧光，或者量子产率
很低的荧光测试成为可能，所以稀土离子荧光探针法成
为一种非常重要的定量检测手段。
由于稀土荧光探针技术的独特优势,使其在药物分析及生物大分子分析方
或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。
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示剂，又要设计对被分析物能特异识别的识别基团。该类设计方法多用于阴离子
传感器的设计。
(3) 化学计量型荧光探针
化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特
异不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行
检测的一类探针。
主要包括两种类型：Ⅰ类是目标离子和探针分子发生化学反应后
仍旧通过共价键相连接；Ⅱ类是目标离子催化了一个化学反应。
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导
与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以
荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有
三个：
识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结
合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这
种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。
信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分
析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察
扩增过程中扩增物的荧
光信号达到设定值的所
经过的扩增循环次数。
Ct值和荧光阈值有关。
荧光信号（扩增产物）
到达阈值时所经过的扩
增循环次数。（Ct值相
对固定）
荧光阈值：在荧光扩增
曲线指数增长期设定的
一个荧光强度标准。是
循环开始3～15个循环
的荧光信号的标准偏差
的10倍，设定在扩增曲
线指数增长期。
对于一个理想 PCR 反应：
数值和循环数呈线性关系，因此可计算出样品中模板量，以上理论只在荧光信号的指数扩增
期成立。
C(t)与初始模板含量
• 初始模板量越多，C(t)值越小
C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
106
105
104
103
102
10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
实时荧光PCR病原菌检测
常规vs实时
• 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析
• 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循
环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析
定量PCR
灵敏度高
高精确度
安全省时
常规PCR
只能进行半定量或定
性分析
不安全易污染
费时费力
循环阈值（Ct）：PCR
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试卷下载：www.1ppt.com/shiti/
(1) 结合型荧光探针
(2) 置换型荧光探针
利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂和被分析物
结合能力的强弱来实现对被分析物的检测。该类传感器对识别基团和荧光指示剂
的要求都比较高，既要选择能和识别基团结合但结合能力又不是特别强的荧光指
利用荧光光谱法和紫外分光光度法研究了四环素类药物
米诺环素与牛血清白蛋白的相互作用。用Stern—
Volmer曲线求出了不同温度下的碎灭常数,讨论了碎灭
机理,应用Farster型偶极一偶极非辐射能量转移机理,确
定了药物与蛋白质的最近距离,并用同步荧光技术考察
了米诺环素对构象的影响。
谢谢，敬请指正
到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输
的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换
成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(
荧光等)。
连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基
团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多
种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链
烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有
输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强
的新方法。方法快速、简便、灵敏度高、选择性好,应用到实际
样品的测定中,取得了满意的结果。
第二部分基于血清白蛋白对喹诺酮一铽络合物的荧光增
强效应,建立了灵敏检测血清白蛋白的喹诺酮一铽络合
物荧光探针。该探针具有高的灵敏度、选择性和低毒性,
将其应用于血清样品中血清白蛋白含量的测定,结果令
人满意。并探讨了其增敏机理。
光。据此建立了以铺或试离子为荧光探针分析痕量喹诺酮类药物
含量的新方法。利用该方法测定了药物制剂中喹诺酮类药物含量
,检测限达到级。由于生物样品具有很强的背景荧光,其荧光与药
物的光谱发生重叠,常常干扰测定。本文采用的稀土离子荧光探
针,能很好的避开生物样品中蛋白质荧光对喹诺酮类药物荧光的
干扰,据此提出了不经预处理直接测定尿样中喹诺酮类药物含量
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实时荧光PCR病毒检测
实时荧光PCR基因突变和临床
实时荧光PCR遗传病研究中应用
实时荧光PCR在肿瘤中应用
实时荧光PCR在环境微生物检测的应用
实时荧光PCR在肿瘤中应用
利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组
织标本中的表达差异（相对标准曲线法）
• 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以
作为一个检测标准
• 选用GAPDH作为内标基因
− FAM标记的ERBB2探针
− VIC标记的GAPDH探针
• 构建标准曲线
• 双重PCR反应
• 阴性对照
− 无RNA对照（空白）
− 无逆转录酶对照（基因组）
标准曲线
Color 1 – FAM
detection for
ERBB2
Color 2 - VIC
有发射的荧光猝灭剂。
SYBR Green I法
• 结合双链DNA分子小沟
− 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green
结合到双螺旋小沟中，当受到适合光
源激发，发射出荧光，反映产物浓度
• 优点
− 使用方便，无需复杂的设计
− 成本较低
• 缺点
− 与非特异性产物结合，无模板特异性
− 试验方法较难优化
的特征荧光。据此建立了以铺或试离子为荧光探针分析痕量哇诺酮类药物含量
的新方法。利用该方法测定了药物制剂中哇诺酮类药物含量,检测限达到级。
由于生物样品具有很强的背景荧光,其荧光与药物的光谱发生重叠,常常干扰测
定。本文采用的稀土离子荧光探针,能很好的避开生物样品中蛋白质荧光对哇
诺酮类药物荧光的干扰,据此提出了不经预处理直接测定尿样中哇诺酮类药物
荧光共振能量转移(FRET)机理
• 荧光共振能量转移是指当一对合适的能量
给体分子(Donor)和受体分子(Acceptor)相
距一定距离(一般为2-5 nm)，且给体的发
射光谱与受体的吸收光谱能有效重叠时，
处于激发态的给体将把一部分或全部能量
转移给受体，使接受体被激发的过程。受
体可以是荧光物质也可以是只有吸收而没
TaqMan探针法
• 水解型
− 报告基团，淬灭基团
− FRET（荧光谐振能量传递）
− 识别特异性产物
• 优点
− 特异性高，可准确定量
− 灵敏度高
− 设计不同标记的探针，可进行多重检测
• 缺点
− 一个探针只适用于一个目标
− 价格较高
− 探针设计较繁琐
因为Fret机制没有荧光产生
发生水解fret机制消失，荧光发生
= 0 × 2
对于一个非理想 PCR 反应：
= 0 (1 + )2
式中，n 为扩增反应的循环次数； 为第 n 次循环后的产物量； 为初始模板量； 为扩
增效率。
在实时荧光定量 PCR 反应中，在扩增产物达到阈值线时：
= 0 (1 + ) =
式中， 为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后， 是一个常
数，我们将其设为 N。
两边同时取对数得：
lg0 = − lg 1 + × + lg
整理此式，得：
1
lg
Ct = −
× lg 0 +
lg 1 +
lg
(1 + )
对一个特定的 PCR 反应来说， 和均是常数，所以Ct 和 lg0成负相关，即初始模板的对
含量的新方法。方法快速、简便、灵敏度高、选择性好,应用到实际样品的测
定中,取得了满意的结果。
Β—二酮类配体
芳环-多羧酸类配体
大环配体
稀土离子中Eu和Tb为荧光探针,建立了一种简单而灵敏的测定痕
量喹诺酮类药物的分析方法。这种方法是基于喹诺酮类药物能与
稀土离子Eu或Tb形成络合物,发生分子内能量转移,并发射特征荧
detection for
GAPDH
样品扩增：正常vs肿瘤
PMT1-FAM detection- ERBB2
肿瘤
来自百度文库
PMT2-VIC detection- GAPDH
肿瘤
正常
正常
稀土荧光探针法
稀土离子可以与多种有机化合物形成配合物，用合
适的激发光激发该稀土有机配合物，配合物中的配体分
子可以吸收激发光，然后通过分子内能量转移的方式将
荧光探针
（Fluorescence Probe）
荧光探针的应用
荧光素类探针
无机离子荧光探针
荧光量子点
分子信标
荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析
定量PCR技术以及DNA测序
荧光探针的原理
•
•
•
•
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面有了很大发展。本论文利用稀土荧光探针技术建立了哇诺酮类药物及血清白
蛋白新的测定方法,并以荧光光度法为研究手段,对药物与血清白蛋白的相互作
用进行了研究,主要做了以下工作以稀土离子中铺和试为荧光探针,建立了一种
简单而灵敏的测定痕量哇诺酮类药物的分析方法。这种方法是基于哇诺酮类药
物能与稀土离子铺或试形成络合物,发生分子内能量转移,并发射铺或试离子强
吸收的能量传递给稀土离子，从而发射稀土离子的特征
荧光。因为稀土离子荧光探针具有斯托克斯位移大、荧
光寿命长、发光强度大、选择性好、荧光稳定以及受外
界影响小等优点，使一些本来不发荧光，或者量子产率
很低的荧光测试成为可能，所以稀土离子荧光探针法成
为一种非常重要的定量检测手段。
由于稀土荧光探针技术的独特优势,使其在药物分析及生物大分子分析方
或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。
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示剂，又要设计对被分析物能特异识别的识别基团。该类设计方法多用于阴离子
传感器的设计。
(3) 化学计量型荧光探针
化学计量型荧光探针分子是利用探针分子与识别客体之间特
异不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行
检测的一类探针。
主要包括两种类型：Ⅰ类是目标离子和探针分子发生化学反应后
仍旧通过共价键相连接；Ⅱ类是目标离子催化了一个化学反应。
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导
与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以
荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有
三个：
识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结
合，并使传感器所处的化学环境发生改变。这
种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。
信号报告基团(发色团, F)，把识别基团与被分
析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察
扩增过程中扩增物的荧
光信号达到设定值的所
经过的扩增循环次数。
Ct值和荧光阈值有关。
荧光信号（扩增产物）
到达阈值时所经过的扩
增循环次数。（Ct值相
对固定）
荧光阈值：在荧光扩增
曲线指数增长期设定的
一个荧光强度标准。是
循环开始3～15个循环
的荧光信号的标准偏差
的10倍，设定在扩增曲
线指数增长期。
对于一个理想 PCR 反应：
数值和循环数呈线性关系，因此可计算出样品中模板量，以上理论只在荧光信号的指数扩增
期成立。
C(t)与初始模板含量
• 初始模板量越多，C(t)值越小
C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系
106
105
104
103
102
10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
实时荧光PCR病原菌检测
常规vs实时
• 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析
• 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循
环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析
定量PCR
灵敏度高
高精确度
安全省时
常规PCR
只能进行半定量或定
性分析
不安全易污染
费时费力
循环阈值（Ct）：PCR
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(1) 结合型荧光探针
(2) 置换型荧光探针
利用该方法设计的荧光探针是通过识别基团分别与荧光指示剂和被分析物
结合能力的强弱来实现对被分析物的检测。该类传感器对识别基团和荧光指示剂
的要求都比较高，既要选择能和识别基团结合但结合能力又不是特别强的荧光指
利用荧光光谱法和紫外分光光度法研究了四环素类药物
米诺环素与牛血清白蛋白的相互作用。用Stern—
Volmer曲线求出了不同温度下的碎灭常数,讨论了碎灭
机理,应用Farster型偶极一偶极非辐射能量转移机理,确
定了药物与蛋白质的最近距离,并用同步荧光技术考察
了米诺环素对构象的影响。
谢谢，敬请指正
到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输
的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换
成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号(
荧光等)。
连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基
团连接起来，根据设计的不同连接基团可有多
种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链
烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有
输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强
的新方法。方法快速、简便、灵敏度高、选择性好,应用到实际
样品的测定中,取得了满意的结果。
第二部分基于血清白蛋白对喹诺酮一铽络合物的荧光增
强效应,建立了灵敏检测血清白蛋白的喹诺酮一铽络合
物荧光探针。该探针具有高的灵敏度、选择性和低毒性,
将其应用于血清样品中血清白蛋白含量的测定,结果令
人满意。并探讨了其增敏机理。
光。据此建立了以铺或试离子为荧光探针分析痕量喹诺酮类药物
含量的新方法。利用该方法测定了药物制剂中喹诺酮类药物含量
,检测限达到级。由于生物样品具有很强的背景荧光,其荧光与药
物的光谱发生重叠,常常干扰测定。本文采用的稀土离子荧光探
针,能很好的避开生物样品中蛋白质荧光对喹诺酮类药物荧光的
干扰,据此提出了不经预处理直接测定尿样中喹诺酮类药物含量
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实时荧光PCR病毒检测
实时荧光PCR基因突变和临床
实时荧光PCR遗传病研究中应用
实时荧光PCR在肿瘤中应用
实时荧光PCR在环境微生物检测的应用
实时荧光PCR在肿瘤中应用
利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组
织标本中的表达差异（相对标准曲线法）
• 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以
作为一个检测标准
• 选用GAPDH作为内标基因
− FAM标记的ERBB2探针
− VIC标记的GAPDH探针
• 构建标准曲线
• 双重PCR反应
• 阴性对照
− 无RNA对照（空白）
− 无逆转录酶对照（基因组）
标准曲线
Color 1 – FAM
detection for
ERBB2
Color 2 - VIC
有发射的荧光猝灭剂。
SYBR Green I法
• 结合双链DNA分子小沟
− 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green
结合到双螺旋小沟中，当受到适合光
源激发，发射出荧光，反映产物浓度
• 优点
− 使用方便，无需复杂的设计
− 成本较低
• 缺点
− 与非特异性产物结合，无模板特异性
− 试验方法较难优化
的特征荧光。据此建立了以铺或试离子为荧光探针分析痕量哇诺酮类药物含量
的新方法。利用该方法测定了药物制剂中哇诺酮类药物含量,检测限达到级。
由于生物样品具有很强的背景荧光,其荧光与药物的光谱发生重叠,常常干扰测
定。本文采用的稀土离子荧光探针,能很好的避开生物样品中蛋白质荧光对哇
诺酮类药物荧光的干扰,据此提出了不经预处理直接测定尿样中哇诺酮类药物
荧光共振能量转移(FRET)机理
• 荧光共振能量转移是指当一对合适的能量
给体分子(Donor)和受体分子(Acceptor)相
距一定距离(一般为2-5 nm)，且给体的发
射光谱与受体的吸收光谱能有效重叠时，
处于激发态的给体将把一部分或全部能量
转移给受体，使接受体被激发的过程。受
体可以是荧光物质也可以是只有吸收而没