荧光比率探针及其应用研究进展

７前　言荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。

该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。

可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。

荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用，　此外还包括应用于体内荧光探针。

分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。

探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。

荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。

因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据，　通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。

同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。

一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。

通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。

它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。

另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。

通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。

这些反应在不连续的能量状态。

荧光比率探针及其应用研究进展杨柳＊　，郭成海，张国胜（防化研究院第四研究所，北京　１０２２０５）摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。

关键词 荧光分析，比率测量＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。

荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。

如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。

探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。

Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。

消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。

比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。

１应用比率测量的阳离子探针：各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用，　如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。

阳离子比率测量探针也在不断发展。

１．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针：探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。

主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－　Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、　ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２（ｆｕｒａｐｔｒａ）、Ｆｕｒａ－２ＦＦ、香豆素苯并噻唑ＢＴＣ、绿荧光蛋白、ＢＡＰＴＡ和３－苯并咪唑基亚氨基香豆素结合的探针、钙绿－１和ＢＳ混合组成的双波长Ｃａ２＋比率测量探针、Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ和ＦｕｒａＲｅｄ混合的使用双波长Ｃａ２＋比率测量探针等。

Ｓｈｉｍｏｚｏｎｏ等应用绿荧光蛋白作为Ｃａ２＋比率测量探针，探针有双激发荧光谱，４１５　ｎｍ　ｔｏ　４９４　ｎｍ。

探针可应用于游动的细胞。

可比率测定海拉细胞中的Ｃａ２＋浓度［１］。

Ｌｉｅｐｏｕｒｉ等用ＢＡＰＴＡ和３－苯并咪唑基亚氨基香豆素结合的探针结合形成在细胞膜附近测量Ｃａ２＋比率测量探针。

它是同Ｃａ２＋结合能力低的探针［２］。

Ｅｌｓ　Ｃｉｅｌｅｎ等２００２年报道了Ｃａ２＋　ａｎｄ　Ｍｇ２＋的比率测量探针［３］。

三铯盐　ｏｆ　｛２－［双（羰基甲基）氨］－５－（５－苯－２－噻吩）苯氧基｝乙酸，　巯基－Ｈ合成作为Ｃａ２＋　ａｎｄ　Ｍｇ２＋阳离子的比率测量探针，并报道了在生理条件下的结合能力。

巯基－Ｈ可增强与Ｃａ２＋的结合能力，强于其它的比率测量Ｃａ２＋探针Ｍａｇ－ｆｕｒａ－２，　Ｍａｇ－ｆｕｒａ－５，　Ｍａｇ－ｉｎｄｏ－１，　Ｆｕｒａ－ＦＦ，　ａｎｄ　ＢＴＣ。

１．２ Ｎａ＋比率探针：Ｋａｒｌ　Ｈ报道了苯并呋喃、异邻苯二甲酸盐（ＳＢＦＩ）作为与Ｎａ＋结合的荧光比率测定探针，该探针用于活体检测，可以检测７５－１５０ｍＭ的Ｎａ＋。

１．３ Ｚｎ２＋比率探针：由于Ｚｎ２＋在生物体内有特殊的功能，如明显抑制多种因素诱导的凋亡等功能，因此Ｚｎ２＋的探针被不断研究。

Ｍａｇｅｄ　Ｍ．　Ｈｅｎａｒｙ在２００４年报道了，在中性ＰＨ条件下，已合成的２－（２　－苯亚磺酰氨基苯基）　苯并咪唑的一系列衍生物用作Ｚｎ２＋荧光比率测定探针，通过同阳离子结合引起分子内质子传导机制（ＥＳＩＰＴ）［４］。

Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｊ．　Ｃｈａｎｇ等２００４年报道了（ＺＮＰ１）作为荧光探针，与Ｚｎ２＋结合后单激发波长，双发散波长　（６２４／　５４８）强度改变。

该探针存在醌和羟基的互变异构体。

文章报道了该探针应用于ＣＯＳ－７细胞中Ｚｎ２＋的测量［５］。

Ｒｏｎｇｈｕａ　Ｙａｎｇ老师等报道了采用了卟啉组装的β－环糊精通过双发射荧光比率测定Ｚｎ２＋，同Ｚｎ２＋结合后６５６－ｎｍ波长强度减小６０６　ｎｍ波长强度增加［６］。

Ｃａｒｏｌｙｎ等发现了一系列双发色团的Ｚｎ２＋比率探针在可见光区被激发的荧光。

探针Ｃｏｕｍａｚｉｎ－１是由ｃｏｕ－ｍａｒｉｎ　３４３和ＺＰＡ－１两种荧光发色团通过酯化连接。

它本身是无荧光的，通过酯水解释放出发色团。

在４８８ｎｍ　（　ｅｘｃ　＝　４４５　ｎｍ）　同ＺＰＡ－１　激发的５３４　ｎｍ　（　ｅｘｃ　＝　５０５ｎｍ）进行比率测量［７］。

Ｍａｒｕｙａｍａ　Ｓ等合成了一系列Ｚｎ２＋比率探针ＺｎＡＦ－Ｒｓ，它是第一种可在生物体使用的比率测量的Ｚｎ２＋探针，可渗透细胞的Ｚｎ２＋比率探针，可通过数据Ｋｄ看其应用方面有合适的连接能力［８］。

Ｓｈａｗｎ等２００２年报道了［９］合成一系列Ｚｎ２＋比率探针，合成了ＲＦ－１（９－（ｏ－羰基苯基）－２－氯－６－［双（２－吡啶基甲基）氨基］－３－黄原胶，Ｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ－１和ＲＦ－２。

探针的检测浓度为＜１ｎｍ。

在一定的ＰＨ条件下发散波长从５０７ｎｍ转移到５２９ｎｍ。

１．４ Ａｇ＋的荧光比率探针：Ａｇ＋可以和探针形成１∶２的配合键，引起激发态的强度变化，从而进行比率测量［１０］。

１．５ 其它阳离子比率探针：　Ｚｈｅｎ－Ｃｈａｎｇ　Ｗｅｎ等２００５年报道了用硫脲衍生物通过分子内质子传导机制（ＥＳＩＰＴ）同阳离子结合，进行双波长荧光比率测定［１１］。

２应用比率测量的阴离子探针：２．１ 氰离子比率测量探针：三种水溶性的荧光探针用于检测游离的氰离子，不同取代的探针ＤＳＰＢＡ（４－［４－Ｎ，Ｎ－二甲基－氨基］苯乙烯基－１－（ｘ－－硼酸基苯甲基）吡啶溴代物，其中ｘ＝２，３，４取代。

与氰离子螯合后荧光波长发生了移动，探针可以通过激发和发射荧光谱感知氰离子，并进行比率测量，可应用于氰离子的远程传感［１２］。

Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００５年报道了［１３］合成数种硼酸化合物作为检测ＣＮ－的比率荧光探针，探针的设计通过不同的机理引发波长转移，激发态质子转移（ＣＴ），光致电子转移（ＰＥＴ），共振交换（ＲＩ）。

可在致命中毒浓度下限以下检测。

Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００４年报道［１４］合成数种不同类型的ＢＡＱＢＡ化合物作为检测ＣＮ－的比率荧光探针，可在致命中毒浓度下限以下检测。

ＢＡＱＢＡ探针还可在复杂的生理背景下使用，如在葡萄糖，Ｃｌ－，果糖下背景下使用形成比率测量。

Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００４年报道［１５］合成数种不同类型的ＢＭＯＱＢＡ化合物作为检测ＣＮ－的比率荧光探针。

２．２ 氯离子比率测量探针：Ｃｌ－比率荧光探针是拥有ＳＰＱ　发色团（Ｎ－取代　６－甲氧基喹啉；激发谱为３５０　ｎｍ，　发射谱４５０　ｎｍ）和　Ｎ－取代　６－氨基喹啉（ＡＱ）　发色团共同结合。

形成的Ｃｌ－双波８长比率测定探针。

与Ｃｌ－结合在３８０　ｎｍ和５４６　ｎｍ处响应。

２．３ 氟离子比率测量探针：Ｙｏｈｅｉ　Ｋｕｂｏ等２００３年报道了新型荧光探针测定Ｆ－离子的荧光比率测定探针，三芳基硼烷－卟啉Ｔｒｉａｒｙｌｂｏｒａｎｅ－　Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ　同Ｆ－离子结合后会产生三个发散波长变化［１６］。

Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００５年报道了［１７－１８］水溶性的喹啉和硼酸的ＢＡＱＢＡ化合物作为检测Ｆ－的比率荧光探针，探针表现出了波长转移，和荧光强度变化。

ＢＡＱＢＡ探针还可在复杂的生理背景下使用，如在５０ｍＭ葡萄糖，５０ｍＭＣｌ－，５ｍＭ果糖下使用形成比率测量。

３ｐＨ、极性、氧化性比率探针：３．１ ｐＨ检测的比率测量探针：应用于ｐＨ测量的比率测量探针主要有ＢＣＥＣＦ　和ＳＮＡＲＦ　ＳＮＡＦＬ－２［１９］。

Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００４年报道了［２０］水溶性的喹啉和硼酸的ＢＡＱＢＡ化合物Ｎ－（２－硼酸基苯甲基）－６－氨基喹啉溴代物作为ＰＨ响应的比率荧光探针，探针表现出了波长转移，和荧光强度变化。

ＢＡＱＢＡ探针同ＢＡＱ进行了比较，ＢＡＱＢＡ探针还可在复杂的生理背景模拟使用，形成比率测量。

荧光强度随ＰＨ增加在４５０ｎｍ升高在６５０ｎｍ降低。

Ｓａｎｄｒｉｎｅ　Ｃｈａｒｉｅｒ在２００４年报道了［２１］探针化合物作为ＰＨ探测的荧光比率探针，检测范围在ＰＨ值３．４－９．１。

Ｋｅｒｍｉｓ　ＨＲ等２００２年报道了８－羟基－１，３，６－三磺酸芘用于ＰＨ探测的荧光比率探针［２２］，在ＰＨ值６－９的条件下，在４０８　ｎｍ　到４６８　ｎｍ　激发５１５　ｎｍ发散，该探针是固定在树脂上的非加入的比率探针且响应迅速＜９　ｍｉｎ，该探针可用于封闭环境的比率检测。

Ｈａｎｓｏｎ　ＧＴ等２００２年报道了不同的绿荧光蛋白（ＧＦＰ）用作ＰＨ探测的荧光比率探针［２３］。

该探针是可用于活体测量的探针，在ＰＨ值６－９的范围内，发射波长随ＰＨ的酸化，从绿色５１５ｎｍ转移到蓝色４６０ｎｍ。

极性比率探针：３．２ 极性比率测量探针：６－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－２，３－ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ　（６ＤＭＮ）用于生物探针在５００－６００　ｎｍ处有激发荧光［２４］，并随着环境极性不同而改变。