有机小分子荧光探针的研究

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罗丹明内酰胺螺环结构具以下特点：1）罗丹明的内酰 胺螺环是非共轭结构的，因此在长波长处无吸收，无色， 无荧光；2）内酰胺螺环结构在酸性条件或者与被分析物 结合后能够诱导罗丹明内酰胺结构开环，氧杂蒽结构电子 重新排布，共轭结构恢复，因此在长波长有吸收，有颜色， 强荧光。由于此结构的优势，罗丹明内酰胺类衍生物是一 类很好的OFF-ON型荧光传感器荧光团。因此可以用罗丹明 作为母体来进行设计，首先使它形成具有酰胺螺环结构的 化合物，当它与被分析物作用时，内酰胺螺环结构被打开， 信号从无到有，达到对被分析物的识别的目的。
染料 ，由于苯环间氧桥的存在，从而分子具有刚 性共平面结构，使其分子结构稳定性增强，开环 状态下，在激发光的作用下能产生强烈的吸收和 荧光，其最大发射波长位于500-700 nm之间，为 红色可见光区，可有效的避开生物体系背景荧光， 从而能提高探针的灵敏度，因此是生物分析中经 常用到的荧光探针，具有很高的研究和应用价值。
PET1 识别基团对荧光团的PET过程发生和受阻的前线轨道理论解释
第一种是识别基团对荧光基团的电子转移（PET1），如图1.9所示， 即识别基团的HOMO轨道介于荧光基团的HUMO和LUMO轨道之间，当被 分析物不存在时，荧光基团被激发后，识别基团的HOMO轨道的电子转移 到荧光基团的HOMO轨道，致使荧光基团被激发到LUMO轨道上的电子无 法回到基态而难以产生荧光，导致荧光淬灭，即PET1过程发生。 当识别基团与被分析物结合后，识别基团HOMO轨道能量降低，使 PET过程受阻，这样荧光基团的激发态电子可以返回基态，荧光恢复 。
1 光诱导电子转移（PET, photo-induced electron transfer）
光诱导电子转移是指电子给体或电子受 体受光激发后，激发态的电子给体与电子 受体之间发生电子转移的过程。 识别基团与被分析物结合之前，荧光基 团受激发，最终被光激发到激发态的电子 不能跃迁到基态，使得荧光基团的荧光淬 灭。而识别基团与被分析物结合后，PET过 程受阻，荧光基团的荧光得以恢复。
荧光基团
该原理是利用识别基团分别与荧光基团和被分析物结合能 力的不同来实现对被分析物的检测。
识别基团和荧光基团形成络合物，当被分析物加入到该体系中时，由 于识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基团与荧光基团的结合能力， 因此被测物将荧光基团置换出来，从而引起了整个体系荧光等化学参数的 变化，进而为仪器或者裸眼识别，该原理常用于设计阴离子荧光探针。



灵敏度高 选择性好 使用方便 成本低 不需预处理 不受外界电磁场影响 远距离发光
荧光分子探针的结构
荧光分子探针通常由 三部分组成：

Fluorephore Spacer hv F S
Receptor
识别基团（receptor） 报告基团（fluorophore） 连接体部分（spacer）
激基缔合物对距离的要求更为苛刻，只有激 发态分子和基态分子达到碰撞距离～3 Å 时才可 能形成激基缔合物，因此可以利用各种分子间作 用力改变两个荧光团之间的距离，通过结合客体 前后单体和激基缔合物的荧光光谱的变化来表达 客体被识别的信息。由于萘、芘、葸等荧光团具 有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合物等 特点，因此常常被用于此类探针中。
作为荧光基团的香豆素和作为识别基团的邻氨基苯硫 醚以席夫碱相连，加入锌离子后，与硫醚上的硫原子、席 夫碱上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到结构2，抑 制了席夫碱上C=N键的旋转，实现了荧光从无到有的变化
1
2
基于键合-信号输出法设计的锌离子荧光探针
2、置换法
识别基团 结合荧光基团
被分析物
识别基团 结合被分析物 基于置换法设计的荧光探针
3、化学计量计法
探针分子 被分析物 新物质A
探针分子
被分析物
中间体
新物质B
新物质C
基于化学计量计设计的荧光探针 （I）被分析物和探针分子反应形成了共价化合物； （II）被分析物催化探针分子反应生成两种新物质
化学计量计法是利用探针分子和被分析物之 间发生的特定化学反应（一般是不可逆反应） 来改变探针所处的化学环境，从而对被分析物 进行识别的一种方法。根据化学计量计法设计 的探针可以称为化学计量计，主要包括两种类 型：
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化合物10是以氟硼荧和罗丹明为荧光团设计的FRET荧 光探针，由于氟硼荧的荧光发射光谱与罗丹明的吸收光谱 有较大范围重叠，通过连接臂连接，氟硼荧作为能量供体， 罗丹明作为能量受体，加入被分析物后，荧光共振能量转 移过程便能实现。加入汞离子之前，表现为氟硼荧的绿色 荧光，汞离子的存在能促使氨基硫脲形成噁二唑酮类化合 物而致使罗丹明内酰胺结构开环，此时氟硼荧的能量传递 给罗丹明，最终使得共振能量转移发生，氟硼荧的发射峰 减弱，从而发射出罗丹明的红色荧光，从而实现了对汞离 子的比率型检测。
3 荧光共振能量转移（FRET, fluorescence resonace
energy transfer）

荧光共振能量转移指一个荧光体系含有两个荧 光团，一个充当能量供体D，另一个为能量受体A， 当用供体D的激发去激发荧光体系时，可以发生从 D到A的非辐射能量转移，从而发射出受体荧光团 的荧光。荧光共振能量转移发生必须具备以下几 个条件：
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化合物12基于激基缔合物的荧光探针，加 入汞离子之前两个芘分子相距很远，因此发射 的是芘单体荧光，当汞离子存在时，O、N原 子与其配位形成化合物13，从而拉近了两个芘 分子之间的距离，且让其平行排列，最后产生 二聚体荧光。
5、 有机载体在荧光分子探针中的应用

罗丹明罗丹明及其衍生物是一种氧杂蒽类荧光
一、探针分子和被分析物发生化学反应后形成共价化合物（I）； 二、被分析物催化探针分子反应生成两种新物质（II）。 一般而言，基于化学计量计原理设计的荧光分子探针通常具有不 可逆性和较好的选择性。
基于化学计量计法设计的次氯酸根离子荧光探针
根据次氯酸根可以氧化羟胺的特性，设计合 成了化合物5，当次氯酸根存在时可氧化羟胺结构， 使罗丹明开环，从而形成结构6，最终进一步水解 为罗丹明6G本身7，而产生强烈的荧光。而其它 氧化性分子没有这样的特性，因此可以实现对水 相中次氯酸根的高选择性检测。

芘芘分子由四个苯环构成，是一种四环多
环芳香类物质，有很强的荧光，在丙酮中 量子产率可达0.99，其晶体加电压可发光， 最初用于电致发光研究。芘荧光基团是最 有用的荧光化学敏感器之一，芘基团附近 连接一氨基已被广泛采用的在选择具体的 金属离子，通过控制信号光诱导电子转移 （PET）过程来选择性识别金属离子。
有机小分子荧光探针的研究
什么是荧光探针？
荧光探针是建立在光谱化学和光学波导 与测量技术基础上，选择性的将分析对象 的化学信息连续转变为分析仪器易测量的 荧光信号的分子测量装置。 荧光探针受到周围环境的影响，使其 发生荧光发射发生变化，从而使人们获知 周围环境的特征或者环境中存在的某种特 定信息
荧光分子探针的优点
分子内电荷转移是指分子在激发态时发生分 子内电子转移，造成正负电荷分离，形成分子电 荷转移态。分子内电荷转移荧光探针分子通常是 荧光团上同时连有推电子基团（电子给体，Donor） 和吸电子基团（电子受体，Acceptor）,通过π键提 供电子转移的通道，形成强的推-拉作用的共轭体 系，其吸电子基团或推电子基团本身充当识别基 团的一部分。当识别基团和被分析物结合后，作 为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推拉电 能力发生的改变，整个体系的的π电子结构重新分 布，从而导致吸收光谱，发射光谱发生变化，主 要是光谱红移或蓝移 。
连接体
识别 基团
被分析物
信号输出
键合-信号输出法是指将探针中的识别基团和荧光基团 通过共价键连接起来设计荧光探针的方法。
当识别基团与被分析物结合时会引起荧 光基团的化学环境发生变化，通过颜色的 改变、光谱的移动、荧光强度的增减等现 象来表现，这些变化可被裸眼或者仪器识 别。这是目前为止在设计荧光探针中应用 最广泛的方法 。
（1）能量供体荧光团D的荧光发射位于短波长处，且发射 光谱和能量受体荧光团A的吸收光谱有一定重叠，能量受 体能够在能量供体的发射波长处吸收能量； （2）能量供体与能量受体相隔的距离必须远大于它们之 间的碰撞直径（有时甚至为70-100Å ）； （3）能量供体与能量受体还必须以适当的方式排列。
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4 激基缔合物/复合物（ excimer / exciplex ）


激基缔合物指一些荧光团在激发态与另一相同或不同的基态荧光 团接近时往往能生产激基缔合物（通过π-π堆积作用形成激基缔合物） 可观察到双重荧光。它的发射光谱不同于单体的荧光，新的荧光会产 生一定的红移，且出现强而宽的，无精细结构发射峰。这种作用本质 上是光致电荷转移作用，在两个相同的荧光分子之间形成激基缔合物 以及在两个完全不同的荧光分子之间形成激基复合物，可以用下式表 示： A* + A A*-A ( excimer ) A* + B A*-B ( exciplex )
PET识别分析物理论示意图
PET过程可以用前线轨道理论具体解释：当识别基团 不存在时，荧光团被光激发后，其最高占据轨道（HOMO） 的一个电子跃迁到最低空轨道（LUMO）,能够产生荧光； 若外来识别基团的HOMO或LOMO轨道介于荧光团两 轨道能量之间，此时就可以发生识别基团与荧光团之间的 电子转移而导致荧光的猝灭。即PET过程阻止了荧光团的 一个电子从激发态到基态的非辐射跃迁途径，降低了荧光 团的量子产率，表现为荧光强度的减弱或淬灭。
Cu2+
CN-
Cu(CN)2
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化合物3以氟硼荧为荧光团修饰了DPA为识别基团，探 针本身荧光很强，但与铜离子络合后可形成结构3，从而淬 灭了氟硼荧的荧光，加入氰根离子后，由于铜离子与氰根离 子的结合常数更大，从而把作为荧光基团的氟硼荧衍生物从 络合状态中置换出来得到结构4，使之进入溶液，荧光恢复， 而其它的阴离子没有这样的现象，因此可以实现对氰根离子 的检测。
总的来说，识别基团对荧光基团的电子 转移，即识别基团的HUMO轨道上的电子占 据了荧光基团的HOMO轨道；荧光基团对识 别基团的电子转移(PET2),即识别基团LUMO 消耗掉了荧光基团被激发的电子，两者最 终导致荧光基团被激发的电子不能回到基 态，使荧光被淬灭。
2 、分子内电荷转移 （ICT，intramolecular charge transfer）
识别基团分别为电子供体和电子受体的ICT过程光谱移动示意图 （其中D、A分别表示电子给体和电子受体）
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化合物8是另一类香豆素荧光探针，在香豆素的3号位 以烯键连接了一个苯并拉电子基，7号位修饰了一个二乙 胺基供电子基，构成了推拉电子体系的荧光分子探针。当 羟基自由基存在时，能够将化合物8氧化为化合物9，这样 化合物9共轭度大大扩大，氮原子带正电荷增强了其拉电 子能力，使整个体系p电荷离域程度增大，从而导致吸收 光谱和荧光光谱分别红移了60 nm和156 nm，发射波长已 位于近红外，基本不受样品荧光背景的干扰，荧光颜色由 绿色变为红色，该探针可对细胞中的羟基自由基进行比率 检测，比率信号可达210倍。
R
Analyte
strongly fluorescent
识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，报告基 团则决定了识别的灵敏度，而连接体部分则可起到分 子识别枢纽的作用。
荧光分子探针的设计原理
荧光分子探针的设计原理主要有以下几种： 键合-信号输出法、置换法和化学计量计法。 1、键合-信号输出法
荧光 基团
荧光探针的响应机理
荧光分子探针主要有如下几种响应机理：
1、光诱导电子转移（PET, photo-induced electron transfer） 2、分子内电荷转移（ICT, intramolecular charge transfer） 3、荧光共振能量转移（FRET, fluorescence resonance energy transfer） 4、激基缔合物（excimer/exciplex）