简述转基因技术原理

转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。

1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。

1.转基因的细胞学原理：

(1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF 在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。

(2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡ期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的

特点。

2.转基因的胚胎学原理：

(1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通

过雌雄原核的融合把外源基因整合入受精卵。有的研究者认为，注射时间应选在精卵融合后的受精卵有丝分裂S期进行，外源基因可以借助受精卵自身基因组DNA复制时形成的缺口或缝隙及重组过程，整合到受精卵的基因组中。

(2)禽类转基因的胚胎学原理：家禽与哺乳动物相比其生殖生理特点有所不同，家禽卵子在输卵管中遇到精子完成受精，可能有多个精子进入卵细胞，精子进入时，卵子处于第二次分裂中期。精子入卵后，卵子排出第二极体，此时二者分别形成雄原核、雌原核，然后雌雄原核融合，雄原核很快被包上一层脂粒。融合后的受精卵在输卵管前移的过程中一边分裂，一边形成卵清、蛋壳等，鸡蛋产出体外时，已发育到6 000个细胞的囊胚期。由于单细胞期的卵子不易获得，因此不宜对卵子进行基因操作。鸡卵子受精时有多个精子进入卵细胞，无法辨清哪一个精子与雌原核融合，且雄原核很快包上一层脂粒，所以也无法像哺乳动物那样对雄原核注射。所以鸡的转基因操作，一般选择在刚产出蛋(即未孵蛋)的胚盘进行注射，注射位置是受精卵胚盘中央质膜下方30μm处的囊胚腔，靠近雌原核。

(3)鱼类转基因的胚胎学原理：Ozato等(1986)曾将外源基因注射到V期卵母细胞核中，使这种注射了外源基因的卵母细胞在体外成熟、受精，然后获得转基因鱼，但卵母细胞能够在体外条件下完全成熟的鱼类只有三种即金鱼、斑马鱼、青锵，所以这种方法受到限制。对于其他的鱼类，通用的方法是把外源基因注入细胞质。鱼卵子外被卵壳，存在受精孔，精子自受精孔进入卵子，受精后，受精卵的核看不清楚。但鱼卵是端黄卵，受精后，位于植物极端的细胞质向动物极方向集中而形成卵内细胞质流。这种细胞质流有助于导入的外源基因与受精卵原核DNA的接触。所以转基因鱼的制作是把外源基因注射到受精卵的卵原核附近的细胞质内，注射在第一次卵裂前进行。与哺乳动物不同的是鱼受精卵的发育是在体外进行的，无需进行胚胎移植，由此大大简化了转基因的程序。

3.转基因的分子生物学原理：无论是显微注射法、电穿孔法等物理方法，还是逆转录病毒载体法等生物学方法，目的是把外源基因导入细胞或胚胎，然而要得到转基因动物的关键是外源基因的整合和表达效率。Brinster提出假设，注入的DNA分子游离末段的诱导修复酶可能引起染色体的随机断裂，断裂点可能是整合位点，外源DNA分子游离末端和断裂点之间的相互作用能够诱导外源DNA整合入基因组。由于这种随机断裂、随机整合的位置效应，研究者很难驾驭转基因的表达效率和表达水平，而且实际应用中注射DNA线性分子比环性的整合效率要高。既然断裂是随机的，则转基因插入也是随机的，由此可导致内源基因的重排、缺失、移位，引起表达效果不理想。但也有一些基因构件不存在位置效应，其表达水平与该基因在宿主基因组中的拷贝数有关，某些情况转基因在整合位点上表现出独立性表达，如溶菌酶基因的“A”元件等。

外源基因整合后，当受体基因中含有转基因的同源序列时，转基因与内源基因的表达会同时受到抑制，这种现象称为共抑制，一般发生在转基因与同源的内源基因之间或者两个相同的转基因之间。共抑制的原因可能是：转基因与同源基因相互作用后，造成某种后成的存在性状而影响其表达；同源基因竞争性地结合核基质等结构出现相互抑制；产生反义RNA，并且正义链的RNA与其结合后而快速降解；由于外源基因的存在，使mRNA开始时大量堆积，并激发某种未知的机制使mRNA降解。许多研究者认为，转基因整合后由于所处的位置不合适，不能建立自己的结构域，从而无法独立调控，当然也无法表达。鸡溶菌酶基因的核基质附着区(DPA因子)，可以帮助转基因在不同的整合位点上形成完整的结构域(转基因即表达)。转基因表达量低也可能是因为存在翻译水平的错误剪接而影响其表达。近年来内含子对转基因表达的作用受到人们的重视，1991年Palmiter等进一步证实内含子能提高转基因动物的表达效率。据研究5'末端的内含子有利于进行mRNA的有效剪接，所以进行转基因操作，应尽量保留5'末端的内含子。随着研究的深入，对转基因的低水平表达又有新的解释，其理论认为，转基因不表达是由于多拷贝重复序列导致了该区域异染色质化从而使转基因沉默。