干细胞向心肌细胞转化的途径

干细胞向心肌细胞转化的途径
摘要：心脏是人和脊椎动物身体中最重要的一个器官，心脏病是发病率和死亡率最高的疾病之一，基于细胞的心脏修复给心肌再生提供了一个较好的途径，很多学者应用干细胞进行心脏病治疗和其他组织再生的研究。

关键词：心脏；干细胞：心肌细胞
Stem cells to Myocardial cells
Abstract：Heart is and vertebrate one of the most important organ in the body, heart disease is one of the highest morbidity and mortality of disease, heart repair based on cells to myocardial regeneration provides a better way, a lot of stem cells for treatment for heart disease and other scholars study of tissue regeneration.
Key words：Cardioid ; Stem cells; Myocardial cell
引言
心肌梗死和心力衰竭是严重威胁人类健康的疾病，其共同的病理改变是心肌的损伤。

心肌细胞是一种终末分化的细胞，再生能力非常有限; 目前针对心肌梗死和心力衰竭的治疗方法大多仅限于延缓疾病的进展。

因此，患有心肌梗死和心力衰竭的病人无法得到根本的治疗。

而细胞替代治疗作为一种非常有前景的新方法，有望治疗心肌损伤。

胚胎干细胞(ESC) 由于处于未分化状态，具有自我更新和多分化的潜能，在诱导因子的刺激下可分化成为心肌细胞，因此是细胞替代治疗较理想的细胞来源。

1.血管紧张素II对胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用
胚胎干细胞分化心肌细胞(ESC-CMs) 与成人心肌细胞的结构和功能特性相似［1］，具有收缩功能和表达心肌特异性基因，并且电镜结果显示，其肌纤维与早期心肌细胞相同。

既往研究已经表明，内源性激素和神经递质可能影响干细胞的分化，如u 和k 鸦片受体对胚胎干细胞向神经祖细胞分化是至关重要的［2］，胰岛素可抑制人胚胎干细胞向心肌分化［3］。

本课题组先前的研究［4］表明，小鼠胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞表达功能性血管紧张素II1型受体，血管紧张素II 作为AT1R的激动剂，其对心肌分化影响的研究还不清楚。

本研究目的是明确
血管紧张素II对心肌分化的影响。

血管紧张素II是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽。

血管紧张素II主要通过AT1R发挥其主要生理和病理作用，如血管收缩，炎症反应，细胞增殖等。

近来有研究［5］报道，AT1R 在心脏功能失调中发挥重要的作用。

另外AT1R 缺陷小鼠心脏萎缩，血压偏低，表明了AT1R在心血管系统发育中发挥重要的作用［6］。

近来有研究发现，血管紧张素II参与干细胞或前体细胞的分化，Ishizuka 等［7］报道了血管紧张素II通过AT1R 促进诱导的多潜能干细胞分化为中胚层前体细胞。

然而，血管紧张素II是否在心肌细胞的分化中发挥作用还不清楚。

另外，由于AT1R 阻滞剂洛沙坦在临床上常用于治疗心梗，考虑到干细胞在心肌损伤治疗中的临床应用潜能，有必要明确血管紧张素!对干细胞向心肌细胞分化的影响，为将来的临床应用提供一定的线索。

研究证实，AT1R 在间充质干细胞以及胰腺干细胞的分化中发挥一定的作用［8-9］不少研究也表明，AT1R在心脏系统的发育中发挥重要的作用［5，6，10］。

然而，AT1R 在胚胎干细胞向心肌分化中作用还不清楚。

由于胚胎干细胞具有自我更新和多分化的潜能，在诱导因子的刺激下可分化为心肌细胞，是细胞替代治疗理想的种子细胞。

另外，AT1R阻滞剂洛沙坦在临床上广泛应用于治疗心梗。

因此，研究AT1R 在胚胎干细胞向心肌细胞分化中作用具有非常重要的意义。

从我们的结果来看，激活AT1R 可能有利于心肌细胞的分化，而阻断AT1R会部分阻碍这种有利的作用。

总之，我们通过工具药激动或抑制AT1R，第一次证实了AT1R激动剂AII能够促进心肌分化，抑制AT1R可部分阻碍这种作用。

本研究为将来干细胞应用到临床时药物的使用提供了一定的参考依据。

2.Smad信号通路在骨髓源性心肌干细胞向心肌分化中的作用
Smad信号通路在BMP_2诱导MCSCs向心肌分化中发挥重要的介导作用。

MCSCs是从成年鼠骨髓中筛选的已提交心肌谱系的多能干细胞，在体外诱导条件下或者在体内特定的微环境中，MCSCs可以分化为心肌细胞和再生血管[15]。

近来研究显示，BMP_2在胚胎心脏的发生以及干细胞向心肌分化方面发挥重要作用。

本实验和我们先前实验的结果证实，BMP_2可将MCSCs诱导分化为心肌。

诱导后的细胞在形态上发生了明显改变，细胞相互连接形成肌管，细胞内早期转录因子Nkx215、GATA_4的表达增强，并表达心肌特异性基因cTnT、Cx43，表现出成熟心肌细胞的特性[13]。

然而，对于BMP_2诱导成体干细胞向心肌分化的
机制尚不清楚。

在胚胎干细胞研究方面，有人提出BMP_2可能通过Smad信号通路诱导胚胎干细胞向心肌分化[8]。

目前已知，特异性转导BMP_2受体信号的Smad包括Smad1、Smad5和Smad8[16]。

我们先前的研究发现，MCSCs表达BMP_2的Ñ型和Ò型受体，BMP_2可上调此两型受体的表达，故提出BMP_2通过其受体发挥诱导作用[13]。

BMP_2通过与Ò型受体结合使Ñ型受体激活，从而使下游信号分子Smad的C端末两个丝氨酸发生磷酸化，由此启动Smad信号通路[10]。

Smad转导BMP_2受体信号，通过促进多种心肌早期转录因子的表达使干细胞向心肌分化[11]。

早期心肌转录因子Nkx215和GATA_4均为Smad蛋白的下游靶基因[11]。

然而，对于BMP_2诱导MCSCs向心肌分化的受体下游信号转导机制目前还不清楚。

本实验应用特异性识别p_Smad1P5P8的两个磷酸化位点(ser463和ser465)的抗体，观察到BMP_2在短时间内激活Smad1P5P8。

磷酸化后的Smad1/5/8向细胞核内转移，1 h后几乎全部进入细胞核。

Smad的磷酸化和核转位发生在相同时间段内。

用SB203580抑制Smad的磷酸化后，Smad的核转位也被抑制。

由此可见，Smad向核内转移依赖于Smad磷酸化过程。

另外，本实验观察到，抑制Smad信号后，BMP_2诱导细胞GATA_4和cTnTmRNA的表达明显降低。

我们首次发现，BMP_2主要通过Smad信号通路的介导作用促进MCSCs的心肌早期转录因子和心肌特异性基因的表达。

结合以前的研究结果，我们提出BMP_2诱导MCSCs向心肌分化的可能机制为，BMP_2与MCSCs胞膜上的Ò型受体结合，使Ñ型受体激活，引起下游Smad1/5/8与受体的胞内段结合，并发生磷酸化。

磷酸化的Smad1/5/8与Smad4结合形成复合体，进入核内，直接与DNA结合或与其他转录调节因子相互作用，从而上调Nkx215、GATA_4及cTnT等的表达，最终使MCSCs向心肌定向分化。

在BMP_2诱导MCSCs向心肌分化中，Smad的磷酸化和向细胞核转位是Smad信号转导通路发挥作用的重要环节。

在BMP_2诱导干细胞向心肌细胞分化方面，除Smad 通路外还存在其他信号通路。

Lee等[14]在心肌祖细胞系P19CL6的定向分化研究中发现，BMP_2能够激活PI_3K通路，进而增强心肌转录因子MEF2A和收缩蛋白MHC的表达。

阻断PI_3K后，心肌终末分化被抑制。

p38MAPK能增强心肌转录因子MEF2C的转录活性，还能提高AP_1的表达和它的DNA结合活性，从而促进Nkx215的表达，促使P19细胞向心肌分化[12]。

Smad通路和PI_3K通路之间、Smad通路与p38MAPK通路之间均存在相互交联[13，14]。

本实验观察到，
与诱导前相比，用SB203580抑制MCSCs的Smad磷酸化后GATA_4和cTnTmRNA的表达减少，但并未完全消失。

在BMP_2诱导MCSCs向心肌分化中，除Smad信号通路外是否还有其他信号通路参与，有待于进一步研究。

心肌梗死时，局部病变组织释放BMP_2增多[15]，骨髓中的MCSCs被动员入血液循环，迁移至心肌梗死区。

在BMP_2的诱导作用下，MCSCs分化为成熟的心肌细胞，从而修复坏死心肌。

深入研究Smad信号通路在BMP_2诱导MCSCs向心肌分化中的作用，对于阐明心肌坏死后心肌修复的病理机制具有重要意义。

MCSCs 具有心肌特异性分化潜能[12-15]，依据Smad信号转导机制，在体外用BMP_2将MCSCs预处理后进行自体干细胞移植，或在MCSCs移植的同时注射BMP_2，对于心肌梗死的治疗可能具有良好的临床应用前景。

3.人胚胎干细胞向心肌细胞定向诱导分化
干细胞可以直接填充和修复受损的心肌，细胞移植是一个潜在可行的治疗心肌损伤的方法[17]。

尽管一些自体干细胞，如骨髓干细胞或骨骼肌细胞，在免疫原性和伦理问题方面具有优势，但成体干细胞非常少且很难分离。

胚胎干细胞(ESC)因具有无限增殖和多向分化的能力，被认为是细胞移植治疗心肌损伤最有希望的细胞来源。

目前为止，一些研究表明，人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞能移植到动物模型的心脏可与受体心肌整合[17，18]人类胚胎干细胞分化为心肌细胞的基本方法[19-20]一般为两种: 一种是用内脏内胚层样(endoderm-like cell line，END-2)与人类胚胎干细胞共同培养[21-13]但这种方法因为动物产品引入可能会增加潜在外来病原污染。

Kehat 等人[22]首次报道了通过拟胚体形成方法，以避免动物源细胞，但这种方法也需要在培养体系中加入牛血清[21，25]。

此外，一些试剂已被证实可以诱导或改善小鼠胚胎干细胞或骨髓基质干细胞向心肌细胞分化，如二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO) 、视黄酸(retinoic acid，RA)[30]、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic pro-tein-2，BMP-2)[14，17，18]，但结果不一致。

Takahashi 等人[22]仔细筛选了880 种化合物，发现抗坏血酸(ascorbicacid)是唯一可以增加从小鼠胚胎或骨髓基质干细胞分化心肌细胞数目的试剂。

研究旨在揭示牛血清添加在人胚胎干细胞向心肌细胞分化中是否必要。

筛选和比较了 3 个因素(维生素C(ascorbic acid，AA)，DMSO，5-氮杂2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dC))在促进心肌分化中的潜能。

通过
该方法，旨在建立一个由PKU1。

胚胎干细胞向心肌细胞分化的有效方法。

同时对分化的心肌细胞的相关标志物和基因表达以及细胞超微结构进行了验证。

研究结果表明，悬浮培养阶段含血清对人胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化具有关键作用。

促进PKU1。

1细胞向心肌细胞分化的最强因子是在EB形成晚期联合添加维生素 C 和5-aza-dC。

超过一半搏动细胞团的搏动频率类似于成人心脏搏动频率，并持续最长可至194 天。

相关心肌细胞标志物、基因表达和超微结构均证实了诱导分化的心肌细胞特征。

4.抑制NHE1 活性对干细胞向心肌分化的影响
心血管障碍造成的心肌缺血会直接导致局部心肌细胞受损，影响心脏正常功能。

采用细胞移植疗法对受损心肌细胞进行修复，是目前干细胞和再生医学研究的热点之一。

采用肌肉祖细胞[31]、胎儿心肌细胞或骨髓间充质干细胞进行细胞移植的研究已有报道，但由于这类细胞向心肌细胞分化的潜能有限，很难作为理想的移植细胞用于临床应用。

胚胎干细胞具有多分化潜能并可以在体外进行大量增殖和向心肌细胞诱导，为临床细胞移植和研究提供种子细胞。

P19 细胞是从小鼠畸胎瘤中分离得到的具有多分化潜能的胚胎瘤干细胞系[35]，可以形成向3 个胚层分化的类胚体[36-37]，在一定诱导条件下可特异性的向心肌细胞分化。

在P19 细胞向心肌细胞分化过程中，心肌细胞特异基因开始表达，并出现心肌电生理学特征，这些现象基本模拟了正常小鼠心肌细胞发育过程，被认为是研究心肌细胞发育及相关基因转录调控的理想体外细胞系统。

Na+/H+交换蛋白(NHE)是维持细胞内pH 值稳定所需的 1 种跨膜蛋白，其功能是将细胞内的1 个H+离子外流置换细胞外1个Na+离子内流，通过这种交换保持细胞内pH 值稳定。

目前已发现9 种NHE 的同功蛋白，其中NHE1 是唯一在哺乳动物心肌细胞膜上发现的NHE 亚型。

NHE1 蛋白活性变化对心肌缺血所导致的心肌细胞酸中毒起着关键的调控作用。

心肌缺血时会导致肌细胞内pH 值下降，激活Na+/H+交换蛋白将H+离子外流，同时使细胞内Na+离子浓度升高，这一过程又促进Na+/Ca2+交换，最终导致细胞内Ca2+离子代谢紊乱，使心肌细胞损伤。

因此，抑制NHE1 蛋白的活性，可以显著缓解心肌缺血/再灌注所引发的病理症状。

P19 干细胞与ES 细胞在分化潜能、超微结构、细胞表面抗原和生化特性等方面具有相同性。

与ES细胞相比，P19 细胞在无需饲养层和白血病抑制因
子条件下单层生长并保持有正常二倍体核型。

P19 干细胞具有多分化潜能，在不同细胞诱导剂，如5-氮胞苷、视黄酸、催产素以及DMSO 等处理下，可以向心肌细胞分化。

形成具有三胚层结构的类胚体对于细胞定向诱导分化至关重要。

近来的研究表明，在细胞增殖时NHE1 的活性增加使细胞内出现微碱环境，从而调节细胞内DNA 复制和代谢酶的活性，表明NHE1 也在细胞增殖和凋亡过程中起重要作用。

在试验中我们发现，用特异性抑制剂EMD87580 抑制NHE1 的活性，会阻断P19 细胞向心肌细胞的分化。

经EMD87580 处理的P19 细胞可以正常的形成类胚体，但将类胚体贴壁培养后，细胞团未出现向外扩散生长的分化细胞，仍然保持团状并且边缘较整齐，细胞团中心部位也未出现死亡细胞。

而通过观察发现在正常诱导分化的P19 细胞团中心部位通常会有部分细胞变黑出现死亡，这可能是由于细胞生长较快使细胞团营养不足所造成。

我们发现在干细胞向心肌细胞分化过程中NHE1 的表达量也随着增加，而抑制剂EMD87580 对NHE1 蛋白活性的抑制会降低细胞增殖的速度，但并不影响NHE1 基因的持续表达及其对维持细胞功能的作用。

对经EMD87580处理的细胞进行分子生物学检测结果也表明，与心肌细胞发育相关的转录因子未见表达，而细胞仍然表达胚胎干细胞的特异性标记。

未经抑制剂处理的细胞表达心肌细胞发育相关的转录因子，但胚胎干细胞的特异性标记消失，这是因为心肌细胞属于中胚层，而Sox2 基因的表达最早在桑椹胚期能检测到，随后在内细胞中短暂表达，接着分布在外胚层，Oct4基因当细胞进入分化状态后其表达就消失[52]。

这一现象说明当EMD87580 抑制了NHE1 的活性后，P19 干细胞就不能有效的向心肌细胞分化。

NHE1 蛋白的C末端功能域位于胞浆内，具有细胞信号转导功能，一些生长因子、有丝分裂原、激素等信号会通过 C 末端功能域的介导来调节NHE1 的活性。

这一功能域还存在与钙调蛋白结合的两个位点，通过调控细胞内第二信使钙，发挥信号转导功能。

NHE1 蛋白是通过其C 末端的信号转导功能直接影响干细胞向心肌细胞分化，还是通过调控细胞内酸碱度微环境间接影响干细胞分化，这一分子机理还有待进一步深入研究
5.IGF-1和动态微环境对脂肪干细胞向心肌细胞分化作用的研究
心脏病是发病率和死亡率最高的疾病之一，基于细胞的个心脏修复给心肌再生提供了一个较好的途径,而运用组织工程的方法在体外构建三维心肌组织移植物将是治疗缺血性心脏病较好的方法组织工程三大要素包括细胞，支架材料和生
物活性分子，干细胞由于具有自我更新和多向分化潜能而成为组织工程重要的细胞来源，而脂肪干细胞来源于脂肪组织，无伦理道德和细胞来源的问题，近年来越来越多地受到临床医学家的重视，很多学者应用脂肪干细胞进行心脏病治疗和其他组织再生的研究，将干细胞与基因治疗相结合是未来研究及临床应用的一个方向，此时细胞不仅仅作为载体将目的基因运输到特定的部位，还参与组织修复的过程。

结果表明，IGF-1 质粒与胶原-壳聚糖支架形成阳离子多聚物进行基因转染比传统的方法更简单有效，生长因子IGF-1 可有效地促进支架内脂肪干细胞的增殖和向心肌细胞的分化，而动态微环境可进一步加强IGF-1 的促增殖和分化作用"因此多因素刺激对工程化心肌组织工程的设计和构建有很重要的意义。

6.其它因素使干细胞向心肌细胞转化
观察丹参对pαMHC-EGFP小鼠转基因胚胎干细胞向心肌细胞分化的诱导作用；间充质干细胞是用于组织工程和细胞治疗的重要细胞，它可向成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞等分化。

生物化学因素和物理因素均对间充质干细胞向心肌细胞分化有影响。

间充质干细胞向心肌细胞分化的研究主要集中在生物化学因素上；胚胎干细胞中加入Jagged蛋白持续激活Notch信号，抑制了胚胎干细胞向心肌细胞分化，而加入MW167持续抑制Notch信号，则促进了胚胎干细胞向心肌细胞分化；。

等还有很多这样的研究，在这里笔者就不一一展开了。

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