试验设计——绿色荧光蛋白的表达

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095）一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。

荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。

荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。

基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。

在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。

本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。

为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果二、主要路线：1、质粒DNA的提取2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA3、酶切连接重组质粒4、重组质粒的扩增5、菌落PCR法鉴定阳性克隆6、目的荧光蛋白基因的表达1、质粒DNA的提取实验原理：1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。

质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。

它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。

碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。

3）。

十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。

抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液或ddH2O中。

●实验目的掌握碱法抽提质粒DNA的原理和方法●实验仪器、材料、试剂1、仪器恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器。

2、材料：含有质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a的大肠杆菌DH5α1.5ml塑料离心管EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）⏹LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。

⏹溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ⏹氨苄青霉素(50mg/mL)⏹抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。

平衡酚密度大，可是DNA 在上清中。

异戊醇防止抽提液起泡。

⏹无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。

⏹70%乙醇作用：纯化质粒DNA。

⏹TE缓冲液或ddH2O 作用：溶解DNA●详细步骤1.1质粒扩增在含有质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a的大肠杆菌DH5α平板菌落上挑取单菌落，分别接种于液体培养基中（加氨苄青霉素40μg/mL），180 r/min振荡培养过夜。

1.2碱裂解法提取质粒1）取各培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液。

2）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。

3）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。

4）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。

5）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中。

6）向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24：1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中。

7）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm ×2min ,取上清液于新离心管中。

8）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置1h。

9）12000rpm ×5 min，倒去上清液，吸干液体。

10）加800μL70%乙醇，离心12000rpm ×1 min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味。

11）加20μL ddH2O（二次蒸馏水），混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-20℃保存备用。

实验结果预测：加入溶液1浑浊；加入溶液2变澄清；加入溶液3出现白色絮状沉淀；加入氯仿抽提溶液分层若成功提取，需琼脂糖凝胶电泳检测之后才能观察出结果。

2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA●实验原理质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。

电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。

因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。

●实验目的检验是否获得所需的质粒●实验用品1、仪器电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

2、材料：提取的质粒，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。

3、试剂：Gold view（DNA染料）1×TAE缓冲液上样缓冲液（6×）●详细步骤2.1琼脂糖凝胶板制备1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。

2）待胶液冷却到65℃（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。

静置30min 左右，轻轻晃动拔出梳子。

2.2加样胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。

2.3电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

2.4观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

2.5注意事项1.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。

倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。

2.用移液枪将样品加至点样孔，吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。

3.电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。

注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。

3、酶切连接重组质粒实验原理1）生物体内能识别并切割特意的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

由于这种切割作用是在分子内部进行的，故名限制性内切酶2）Bam HⅠ切割识别序列后产生的粘性末端：5'⋯G↓GATCC⋯3'→5'⋯G GATCC⋯⋯3'3'⋯CCTAG↑G⋯5→3'⋯CCTAG G⋯⋯5'Not I切割识别序列后产生的粘性末端：5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯⋯53）双酶切重组质粒●实验试剂1 材料：实验一提取的质粒pEGFP- N3和pET--28a，0.2ml管，取液器吸头，一次性手套2 试剂：Not I, Bam HI, ddH2O，10×buffer，引物、琼脂糖，Gold view3 设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱●实验步骤3.1分别取两支0.2mlEP管做上标记：如①②①号管②号管水9μl 9μl 10xBuffer 3μl 3μlNot I 1μl 1μlBam HI 2μl 2μl质粒pET -28a：15μl pEGFP-T1：15μl3.3 将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h。

3.4 取5uL①②EP管的酶切反应液，同时取5uL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。

3.5 按照回收试剂盒（OMEGA）步骤切胶回收所需酶切产物片段。

1）需进行回收的凝胶，必须在新鲜的TAE缓冲液中进行电泳2）取一个灭菌1.5mlEP管称重记录其重量3）电泳结束后，凝胶成像系统中观察目的条带所在位置，用干净锋利的解剖刀切割所需回收的DNA条带（尽量不要切到多余的凝胶），放入已称重EP管后再次称重，计算得到凝胶重量。

4）按照1g凝胶加入1ml Binging Buffer（XP2）计算，若是0.3g则加入0.3ml Binging Buffer（XP2），总体积最好不要超过700ul。

5）装有凝胶的EP管置于55-60℃水浴锅温浴10min，期间不时摇晃直至凝胶完全溶解。

6）取一个HiBind DNA column 放置于2ml collection tube中，把已溶解的胶液添加到HiBind DNA column 中，室温下10000×g离心1min。